免疫学检测技术.ppt

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1、第十四章 免疫学检测技术,抗原和抗体可以发生高度专一性的结合,抗原和抗体可以发生高度专一性的结合,抗原和抗体可以发生高度专一性的结合,抗原或抗体检测原理：借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。,抗原和抗体可以发生高度专一性的结合,抗原或抗体检测原理,免疫学（Immunology）：是研究抗原性物质、免疫系统、免疫应答的规律及免疫应答的调节的一门科学。免疫的定义（Immunity）：免疫是机体识别自我与非自我的过程。排除异己，维护自身稳定的生理反应。,免疫的功能：1.抵抗感染（Defense）：机体能抵抗病原微生物侵袭的能力。又称免疫防御。抗菌、

2、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫免疫2.自身稳定（Homeostasis）：机体在新陈代谢过程中，产生大量的衰老死亡细胞，免疫的第二个功能就是清除这些细胞，维持机体的生理平衡。3.免 疫监视（Immunological surveillance）：机体细胞会因物理、化学和病毒等生物因素的影响，使细胞发生癌变，形成肿瘤等，机体可识别、清除这些细胞，这是免疫系统的第三个功能。当这一功能低下或失调时，会导致肿瘤或癌症。,抗原（Antigen）,抗原概念 凡能刺激机体产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，并能与相应抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反应的物质。抗原性（Antigenicity）：包括免疫原性和反应原性

3、二个方面免疫原性：抗原能刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞的性能。反应原性：抗原与特异性抗体或致敏淋巴细胞在体内或体外发生反 应的性能。,抗原（Antigen）,构成抗原的条件1.异物性：机体免疫细胞能识别自身和异己物质，只有外源性的物质才具有免疫原性，产生免疫反应。亲缘关系越远，差异越大，抗原性越强。自身抗原：自身组织发生异常变异、免疫功能紊乱、眼球晶体蛋白、精子蛋白、甲状腺蛋白大分子胶体：一般在10 kD以上。3.具有复杂的立体结构或空间构象.如明胶分子量虽然为100 kD，但结构简单，免疫原性差。,抗原如何被识别,抗原的特异性 抗原决定簇：抗原分子表面具有免疫活性的化学基因,是抗原与抗体结合

4、的部位。抗原分子中抗原的特异性由抗原决定簇决定。,一种细菌可以刺激多少种抗体产生？,抗原,一种细菌可以刺激多少种抗体产生？,根据抗原的化学性质分：天然抗原：微生物及其产物抗原如菌体抗原（O 抗原）鞭毛抗原（H 抗原）表面抗原（如大肠杆菌的K 抗原）细菌的毒素抗原病毒抗原（V 抗原）人工抗原：人工合成多肽、蛋白等,抗体（Antibody),一、概念 是抗原刺激B淋巴细胞,使之增殖分化成浆细胞而产生的能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig),抗体（Antibody),一、概念二、免疫球蛋白的基本结构免疫球蛋白：在人和动物血液、组织液及其他分泌液中的一类结构相似的球蛋

5、白。1.由4 条肽链组成：2 条重链，2 条轻链2.一个抗体单分子：2 个抗原结合位点,抗体（Antibody),抗体（Antibody，Ab),免疫球蛋白的双重性 免疫球蛋白是一种蛋白质，是抗体(Ab1)；同时又可引起机体产生抗体（抗抗体,Ab2），所以既是抗体又是抗原。Ag Ab1 Ab2,抗体（Antibody，Ab),免疫球蛋白的双重性免疫球蛋白的功能 1.与抗原结合 2.激活补体 3.组织结合 4.调理作用 5.抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC）,免疫球蛋白的功能,抗体（Antibody)的产生与功能,抗体产生的主要过程,注射,抗原（如类毒素）,血清,抗体？抗原？,抗体的制备,

6、抗体的制备抗血清：指抗原人工免疫实验动物，获得含 特异性抗体的血清。多克隆抗体(PAb)：多个抗原决定簇免疫机体 所产生的多种抗体的混合物。单克隆抗体（monoclonal antibody，MAb）：只针对某一特定的抗原决定簇，纯度高的抗体。,多克隆抗体与单克隆抗体,多克隆抗体与单克隆抗体的制备,单克隆抗体的制备,骨髓瘤细胞 脾脏淋巴细胞（HGPRT-TK-)（HGPRT+TK+）在HAT中不能生长 体外培养过程中死亡 PEG 杂交瘤细胞(HGPRT+、TK+)在HAT中大量长期繁殖 克隆化 产生单抗,第一节 免疫学检测技术原理,抗原或抗体检测原理：抗原抗体的结合具有高度专一性 借助抗原和抗

7、体在体外特异结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。,对抗原或抗体进行定性或定量的检测的原理,对抗原或抗体进行定性或定量检测的原理,根据抗原抗体形成的免疫复合物的浓度进行定量检测。P 312,第一节 免疫学检测技术原理,可作为抗原进行检查的物质：微生物及其大分子产物 人和动物细胞 人和动物体内的各种大分子 各种半抗原,抗原或抗体检测原理,较早的抗原抗体反应检测方法,1、凝集反应（Agglutination)2、沉淀反应(Precipitation)3、补体结合试验(Complement fixation test)4、中和试验(Neutralization test),

8、一、凝聚反应(Agglutination)二、沉淀反应 1、溶液中的沉淀反应 2、凝胶扩散沉淀 3、免疫电泳 血清免疫电泳 火箭电泳 对流免疫电泳 三、补体参与的反应 四、免疫标记的抗原抗体技术 酶联免疫吸附（ELISA）,一、凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,一、凝集反应,凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。,二、沉淀反应,当抗原是可溶性分子时，与抗体结合则形

9、成沉淀。1、絮状沉淀反应 一系列试管中加入等量的抗体和递增量的抗原，在中性条件下37度保温1-2h，便可见到絮状的蛋白质沉淀。可用于寻找抗原抗体反应的合适比例，检测抗原抗体的分子比。2、环状沉淀反应 在试管中加入抗体后，小心加入相应抗原，使抗原抗体步混合，37度保温10-20min，在二者界面上出现环状沉淀。不能用于定量测定。,3、双向扩散：又称琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质的一种沉淀反应。琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体相遇，比例合适时形成沉淀。可观测到沉淀弧。沉淀弧的特征与位置取决于抗原分子的大小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体存在多种体系

10、时，会出现多条沉淀弧。,二、沉淀反应,双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在普通载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。,二、沉淀反应,抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。,4、单向免疫扩散：又称单向琼脂扩散，是定量抗原的一种检测方法。与双向扩散不同的是在琼脂中含有一定量的抗体，孔内加入未知量的相应抗原。在37度保温过程中，孔内的抗原向周围扩散，与抗体形成沉淀圈。根据沉淀圈的大小确定抗原的含量,二、沉淀反应,二

11、、沉淀反应,另外还有其他众多的免疫检测技术和手段，其机理都利用了抗原抗体的沉淀反应。例如微量免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。,免疫电泳,二、抗原或抗体检测的现代方法：P3121.免疫荧光技术2.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法,第一节免疫学检测技术原理,二、抗原或抗体检测的方法：免疫荧光技术 将结合有荧光素的荧光抗体进行抗原抗体反应的技术 常用的荧光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC)和罗丹明（rhodamine B200,RB200)等。它们可与抗体球蛋白中赖氨酸的氨基结合，在蓝紫光激发下，可分别出现鲜明的黄绿色及玫瑰红色。,第一节 免疫学

12、检测技术原理,二、抗原或抗体检测的方法：免疫荧光技术直接荧光法 间接荧光法,第一节 免疫学检测技术原理,二、抗原或抗体检测的现代方法：P3132.酶联免疫分析法3.放射免疫分析法,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,一、基本原理：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,一、基本原理：免疫荧光素技术,第二节免疫荧光技术在食品检测中的应用,二、抗体的荧光标记 P315（一）荧光抗体的制备搅拌法透析法（二）荧光抗体的鉴定 鉴定指标：效价、荧光素与蛋白质的结合比率,第

13、二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,三、标本的制作 P316 食品卫生检验中，荧光标记抗体检测标本的制作方法是将样品增菌液涂在载玻片上，涂片应薄而均匀，干燥后用化学方法固定，然后进行荧光染色。,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,五、荧光显微镜检查 染色当天即作镜检 通风良好的暗室内进行 选择好光源或滤光片,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,四、荧光抗体染色方法 直接法 间接法,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,四、荧光抗体染色方法 直接法 间接法,使用了两

14、种抗体：一抗、二抗 二抗如何获得？,第二节 免疫荧光技术在食品检测中的应用,六、在食品检验中的应用 P317 免疫荧光检测技术已经广泛应用于医药卫生领域，可检测细菌、病毒、寄生虫等，在食品卫生领域也应用的越来越多。,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,一、基本原理 P319 利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测敏感性的一种标记免疫技术。酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,ELISA 基本原理 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗体

15、与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,ELISA 基本原理 在测定时，把受检酶标抗体或抗原和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,ELISA 基本原理,碱性磷酸酶或过氧化物酶,第三节 免疫酶技术在食品检测中的

16、应用,酶联免疫吸附剂测定 enzyme linked immunosorbent assay，ELISA 二、ELISA的种类 P320直接法测定抗原间接法测定抗体双抗体夹心法测定抗原双抗原夹心法测定抗原竞争法测定抗原,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,二、ELISA的种类双抗原夹心法测定抗原,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体，酶标记的抗原或抗体，酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计

17、出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。可设计出各种不同类型的检测方法。（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。（3）加酶标抗体：（4）加底物：,（一）双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：（2）加受检标本：（3）加酶标抗体：使固相免疫复合

18、物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。,二、ELISA的种类双抗体夹心法测定抗原,三、抗体的酶标记 P321 戊二醛法 过碘酸盐氧化法,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,四、酶与底物 酶与抗原、抗体或半抗原在交联剂作用下连接。是ELISA成败的关键试剂。P323 表14-1 五、固相载体 最常用的是

19、聚苯乙烯 ELISA载体的形状主要有三种：小试管、小珠、微量反应板（酶标板）,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,六、最适工作浓度的选择 以夹心法测抗原为例，可用棋盘滴定法。P323 表14-2,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,七、ELISA测定方法 1、加样 2、保温 3、洗涤 4、比色 5、结果判定,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,封闭 P330 封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸

20、附。封闭的操作与包被相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，可以高浓度使用（5%）。,采用酶标法（ELISA）进行三聚氰胺检测,Thermo MK3型酶标仪,酶标仪原理与结构,第三节 免疫酶技术在食品检测中的应用,八、酶免疫技术在食品检验中的应用 用于细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫的检测。用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测。应用实例：ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素。,常规鉴定,ELISA法检测致泻性大肠埃希氏菌肠毒素,ELISA法检测肠毒素,第四节 放射免疫

21、技术在食品检测中的应用,标记免疫分析技术,用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法 特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法 检测范围生化、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、发光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）,第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用,放射免疫分析（RIA）一、基本原理 放射免疫分析的基本原理是标记抗原Ag*和非标记抗原Ag对特异性抗体Ab的竞争结合反应。反应式为：Ag*+Ab Ag*Ab+

22、Ag AgAb,标记抗原,抗体,非标记抗原,图 14-6,放射免疫RIA以标记抗原与反应系统中未标记抗原竞争结合特异性抗体来测定待检样品中抗原量。,免疫放射IRMA以过量标记抗体与抗原非竞争结合，采用固相免疫吸附载体分离游离和结合标记抗体。,放射受体分析RRA放射配体结合分析RBA,其它,一、基本原理,第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用,二、标记物 P333常用的核素有两大类射线：131I、125I、57Cr和60Co射线：14C、3H和32P。使用最广泛的是：125I性质活泼、易制备标记物对被标记物的免疫活性影响小测量方法简便、已推广半衰期较长、核素丰度高,B、F分离技术 第二抗体沉淀法

23、,第四节 放射免疫技术在食品检测中的应用,测量仪器（1）计数仪（2）液闪仪,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。,化学发光,发光免疫分析技术（Luminescent immunoassay，LIA）,光照发光（photoluminescence）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。,生物发光（bioluminescence）是指发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基

24、态时多余的能量以光子的形式释放出来。,化学发光（chemiluminescence）是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。,化学发光,一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A十B C*C*C h其中为光子，C*表示C处于单线激发态。,发光免疫分析技术（Luminescent i

25、mmunoassay，LIA）,1.原理：（1）LIA：在氧化还原反应中电子被激发，可释放光子，使发光剂鲁米诺（氨基苯二酰肼类）发光。用发光剂标记抗原或抗体（2）发光酶免疫测定（LEIA）：用能催化发光反应的酶（如葡萄糖氧化酶）标记抗原或抗体，酶可使发光剂发光。该法经酶促放大，更灵敏.根据发光的强弱对抗原或抗体定量.2.优点：无放射性，故现正逐步取代 RIA,用吖啶酯直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。,直接化学发光免疫分析,发光,Y,Y,Y,磁微粒,被测抗原,+,抗体,+,带丫啶酯标记物抗体,冲洗后,-夹心法,（1）加入H2O2（pH10）,（2）加入碱（pH10）,直接化学发光的机理,磁微粒模式图,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,特点已结合的抗原和抗体与未结合部分的易分离,磁微粒技术,