高效液相色谱分析法.ppt

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1、第六章高效液相色谱法Chapter 6High Performance Liquid Chromatography,本章学习应该关注的几个问题,问题一,高效液相色谱法与其它色谱法有何不同？,高效液相色谱法利用什么设备实现分离？,问题二,高效液相色谱法有何应用？,问题三,问题一,高效液相色谱法与其他色谱法有何不同？,问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？,问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？,问题1.3 高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？,第一节 概述,问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？,一、高效液相色谱法与经典液相色谱法,固定相颗粒大小,流动相

2、输送压力,样品 分离速度,检测器 灵敏度,采用颗粒极细、规则均匀的固定相，传质阻力小，分离效率高。,第一节 概述,问题1.1 高效液相色谱法与经典液相色谱法有何不同？,一、高效液相色谱法与经典液相色谱法,高效和经典液相色谱法比较表,第一节 概述,问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？,二、高效液相色谱法与气相色谱法,流动相选择范围,分离过程样品状态,色谱柱 柱温,分离对象性质,第一节 概述,问题1.2 高效液相色谱法与气相色谱法有何不同？,二、高效液相色谱法与气相色谱法,高效液相色谱法和气相色谱法比较表,第一节 概述,问题1.3 高效液相色谱法如何实现组分的高效分离？,三、高效液相色

3、谱分离理论,可忽略,a.采用合适的流动相，控制相对较小的流动相流速；,b.采用颗粒直径极小的固定相；,c.色谱柱填充均匀；,d.减小固定相液膜厚度；,影响高效液相色谱峰扩张的主要因素：A和Cu项,问题二,高效液相色谱法利用什么设备实现分离？,问题2.1 高效液相色谱仪由哪几部分组成？,问题2.2 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,一、高效液相色谱仪流程,储液器,进样器,色谱柱,检测器,数据处理系统,馏分收集器,高压泵,高压输液系统,梯度洗脱装置,第二节 高效液相色谱仪,二、高压输液系统,作用,为色谱分离提供流速恒定的流动相。

4、,储液器、高压输液泵、过滤器和压力脉动阻力器。,组成,密封；流量恒定；压力平稳、可调；易于更换溶剂。,要求,常用高压输液泵,恒压泵,恒流泵,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,三、进样系统,作用,定量引入样品。,隔膜注射进样器、高压进样阀。,种类,死体积小。,要求,六通阀进样过程示意图,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,柱外效应,第二节 高效液相色谱仪,四、分离系统-色谱柱,作用,实现样品组分高效分离。,柱管材料,柱管+固定相。,组成,不锈钢、聚合材料。,柱管尺寸,内径：4-5mm,长度：10-50cm,填料直径,5-10m,塔板数,7 000-1

5、0 000,色谱柱填装好坏是影响柱效的重要因素,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,作用,要求,将样品组分的量定量转化为电信号并放大、输出。,灵敏、噪音小、响应快、线性范围宽、死体积小。,类型,溶质型、总体型。,种类,紫外-可见检测器(UVD)；,荧光检测器(FLD)；,折光检测器(RID)；,蒸发光散射检测器(ELSD)。,电化学检测器(ED)；,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,1.紫外-可见检测器和光电二极管阵列检测器,可调波长紫外-可见检测器,固定波长紫外-可见检测器,溶质型,问题2.1

6、高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,1.紫外-可见检测器和光电二极管阵列检测器,特点,灵敏度高；线形范围宽；对流动相和温度变化不敏感。,溶质型,可用于梯度洗脱,只能用于有紫外-可见吸收的样品组分的检测,光电二极管阵列检测器(PAD),问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,2.荧光检测器,特点,灵敏度高；选择性好；线性范围窄。,溶质型,可用于梯度洗脱,只能用于有荧光的样品组分的检测,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,3.折光检测器,特点,通用；灵敏度低；对温度变化敏

7、感。,总体型,不能用于梯度洗脱,可用于所有样品组分的检测,偏转式、反射式,偏转式示差折光检测器,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,通用；灵敏度高；可提供分子的结构信息。,第二节 高效液相色谱仪,五、检测系统,4.电化学检测器,溶质型,可用于梯度洗脱,只能用于有电化学响应的样品组分的检测,特点,灵敏度高；选择性好。,5.蒸发光散射检测器,可用于梯度洗脱,可用于所有样品组分的检测,特点,通用；灵敏度高。,6.质谱检测器,可用于梯度洗脱,可用于大部分样品组分的检测,特点,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第二节 高效液相色谱仪,六、附属系统,脱气装置,梯度洗脱(淋洗)装置,恒

8、温设备,自动进样器,馏分收集器,当样品组成复杂，组分性质差别较大，组分在流动相和固定相中的分配系数差别很大时使用,在双泵系统中应用很广,在分离过程中，使流动相组成随时间改变而改变。,梯度洗脱,通过不断改变色谱柱中流动相的极性、离子强度、pH等因素，使被测组分的相对保留值得以改变，提高分离效率。,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,要求,刚性固体,表面多孔型,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第三节 高效液相色谱的固定相和流动相,一、固定相,比表面极大（颗粒小）；颗粒均匀；耐压。,类型,全多孔型,硬胶,应用范围广,应用于离子交换和尺寸排阻色谱,二、流动相,1.高效液相色谱对

9、流动相的要求,a.合适的极性和选择性,b.与检测器匹配,c.高纯度,d.稳定,e.低黏度,f.安全、低毒,常用流动相：水、乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃、正己烷等,问题2.1 高效液相色谱仪各部分的功能如何？,第三节 高效液相色谱的固定相和流动相,二、流动相,2.描述流动相性质的特性参数,通过改变流动相的性质，可以改变组分的k值，改善分离效果。,a.溶解度参数,溶剂极性的尺度,纯液体中各种分子间力的总和。,b.极性参数P,溶剂极性的另一尺度,根据Rohrschneider报道的溶解度数据编制的。,c.溶剂强度参数 0,溶剂对化合物洗脱能力的一种治标,3.混合溶剂,问题三,高效液相色谱法有何应用？,

10、问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,问题3.2 高效液相色谱法如何进行定性分析？,问题3.3 高效液相色谱法如何进行定量分析？,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,第四节 高效液相色谱法的主要类型,一、液-液分配色谱法,1.分离原理,不同样品组分在固定相和流动相中溶解能力(分配系数)不同,2.固定相,与气相色谱相同,涂在担体表面,3.流动相,与固定相不互溶；与固定相极性差别大,4.分离对象,正相色谱,反相色谱,非极性、弱极性化合物,极性化合物,流动相极性 小于 固定相极性,流动相极性 大于 固定相极性,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,第四节 高效液相色谱

11、法的主要类型,二、化学键合相色谱法,1.分离原理,不同样品组分与固定相和流动相中作用力不同,2.固定相,键合在载体表面,3.流动相,与固定相极性相反,4.分离对象,正相色谱,反相色谱,非极性、弱极性化合物,极性化合物,固定相直接键合在担体表面,烷基、氨基、氰基、羟基等,反相：硅胶-C18、C8、C3,正相：硅胶-CN、NH2、OH,正相色谱,反相色谱,流动相：烃类+氯仿、醇,流动相：水、甲醇、乙腈,何种极性的先流出？,流动性极性改变，组分保留时间如何变化？,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,第四节 高效液相色谱法的主要类型,三、液-固吸附色谱法,1.分离原理,固定相对样品组分吸附

12、能力和流动相对样品组分溶解能力的不同,2.固定相,固体吸附剂,3.流动相,极性大的试样：强极性洗脱剂,4.分离对象,各类化合物,硅胶、氧化铝、聚酰胺等,极性小的试样：弱极性洗脱剂,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,第四节 高效液相色谱法的主要类型,四、离子交换色谱法,1.分离原理,不同待测离子与固定相的离子交换能力不同,2.固定相,离子交换树脂,强、弱阳离子交换树脂 强、弱阴离子交换树脂,3.流动相,具有一定盐浓度的pH缓冲溶液,4.分离对象,固定相为离子交换树脂,多孔型薄膜型表面多孔型键合性,无机离子生物大分子（氨基酸、蛋白质、核酸）,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物

13、质？,第四节 高效液相色谱法的主要类型,五、尺寸排阻色谱法,1.分离原理,按照待测物分子大小(尺寸、形状)不同实现分离,2.固定相,凝胶,3.流动相,与凝胶极性相似、黏度小,4.分离对象,四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺(DMF)、水,凝胶(渗透)色谱法,软性凝胶：葡聚糖、琼脂糖半刚性凝胶：聚苯乙烯刚性凝胶：硅胶、多孔玻璃,大分子物质,分子量大和分子量小的大分子化合物何者先流出色谱柱？,问题3.1 高效液相色谱法可用于分离那些物质？,第四节 高效液相色谱法的主要类型,六、亲和色谱法,分离原理,生物大分子与固定相表面存在特异性亲和力,七、分离类型的选择,1.什么是高效液相色谱法？HPLC高效的

14、原因是什么？,2.与经典液相色谱相比，高效液相色谱法有何特点？,3.与气相色谱相比，高效液相色谱法有何特点？,4.高效液相色谱仪有哪几部分组成？各有何功能？,5.什么是梯度洗脱？梯度洗脱有何优点？,6.高效液相色谱检测器主要有哪几种？各适用于何种样品检测？,7.高效液相色谱常用的流动相有哪些？,8.高效液相色谱法可分为哪几类？各自的分离原理如何？,9.何为正相色谱？适用于何种样品分离分析？判断组分流出顺序,10.何为反相色谱？适用于何种样品分离分析？判断组分流出顺序,11.何为化学键合固定相？,12.如何根据样品性质选择色谱分离分析方法？,仪器分析方法：UV-Vis,MF,AAS,EC,GC,HPLC,每种方法基本概念：定义、分类、优缺点、应用对象,每种方法基本原理及相关名词,每种方法涉及仪器：组成,结构,功能,相关测试条件,各种定量分析方法：标准曲线法,标准加入法,内标法,归一化法,相关计算：标准曲线法,标准加入法,内标法,归一化法,塔板数,分离度,相对保留值,柱长选择,