质粒DNA的提取酶切及浓度检测.ppt
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1、实验5 质粒DNA的提取,质粒的概念,质粒:质粒是细菌染色体外的遗传物质,大小在1200kb之间,大多是具有双股闭合环状结构的DNA分子,通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。,质粒提取目的,PCR的模板质粒作为克隆载体(研究目的基因时,常需要提取质粒),质粒提取的方法与原理,碱裂解法SDS裂解法煮沸裂解法氯化铯-溴化乙锭梯度离心法试剂盒法,碱裂解法溶液1 50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mMTris-HCl pH8.0。溶液2 0.2mol/L NaOH,1%SDS溶液3 乙酸钾溶液(3M,pH=4.8):60mL的5mol/L KAc,11.5ml冰醋酸,28.5mL H
2、2O,培养细菌:将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基,37培养1216小时;取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中,10000r/min离心1min,去掉上清液,加入100l溶液1 充分混匀放置3-5分钟;加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1SDS(变性液),加盖颠倒3-5次使之混匀,冰上放置5min;,质粒小量提取的方法(手工提取):,加入150 l乙酸钾溶液(溶液III),加盖后颠倒3-5次混匀,冰上放置5min;用台式高速离心机,12000r/min离心15min,上清移入另一干净离心管,并加2倍 100乙醇混匀,12000r/mi
3、n离心5min,弃去上清液;沉淀用0.5ml 70乙醇清洗一次,12000r/min离心5min,弃去上清液,小管倒置于吸水纸上,除尽乙醇,室温自然干燥;加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物,室温放置15-30min,使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提);将分离出的质粒DNA置于-20保存备用。,注意:用移液器操作时,每一步都要格外小心,特别是在加入溶液II 和III后,一定不要剧烈振荡,以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)!,质粒小抽试剂盒,原理:把硅胶薄膜的优点与经典的碱-SDS裂解细菌细胞法结合起来。优点:操作简便、节约时间、性/
4、价比高。,使用者需备,10,000 xg以上高速离心机1.5ml的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇,注意,一、使用前往准备好的SolutionI中加入RNase A,二、浓缩的Wash Buffer需用乙醇稀释:三、稀释后的DNA Wash Buffer需室温保存;四、所有步骤必须在室温下操作。,实验操作步骤,增殖细菌、扩增质粒裂解菌体、获取质粒抽提质粒、分离纯化结果鉴定,对于未经酶切的质粒来说,常会出现两条电泳带 1)(松弛)螺旋状质粒DNA带 2)超螺旋状质粒DNA的带以超螺旋状质粒DNA居多,移动速度也最快。有时还会出现三条带,其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程
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