血红蛋白的凝胶过滤.ppt

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1、血红蛋白的凝胶过滤,Gel Filtration,凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)分子筛层析(molecular sieve chromatography)凝胶过滤(gel filtration),凝胶层析技术及原理,凝胶:是胶体溶液凝固而成的固体物质，其内部是立体的网状结构.交联葡聚糖(sephadex)琼脂糖凝胶(sepharose)聚丙烯酰胺凝胶(BIO-Gel P)硅胶(Silicon dioxide or Silica gel),葡聚糖,分子筛凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，小分子可以

2、进入凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。,凝胶层析(Gel chromatography):凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。Kav 值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo),在限定的层析条件下，Vt 和 Vo 都是恒定值，而 Ve 值却

3、是随着分离物分子量的变化而变化的。分离物分子量大，Kav 值小；反之，则 Kav 值增大。因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开,常用的色谱分离方法,一.按两相所处的状态分类气相色谱法:气固色谱法,气液色谱法液相色谱法:液固色谱法,液液色谱法二.按固定相的几何形式分类柱色谱法纸色谱法薄层色谱法

4、,凝胶过滤技术特点,凝胶过滤的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。,凝胶层析的应用,脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。测定高分子物质的分子量高分子溶液的浓缩,凝胶层析应用,1.生物大分子的纯化凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生

5、物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。,2.分子量测定在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。Kavb lg MWcVeb lg MWc由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。,3.脱盐及去除小分子杂质利用凝胶过滤进行脱盐及去除小分子杂质是一种简便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脱盐要快得多，而且一般不会造成样品较大的稀释

6、，生物分子不易变性。一般常用的是Sephadex G-25，另外还有Bio-Gel P-6 等排阻极限较小的凝胶类型。目前已有多种脱盐柱成品出售，使用方便，但价格较贵。,4.溶液的浓缩利用凝胶颗粒的吸水性可以对大分子样品溶液进行浓缩。例如将干燥的Sephadex（粗颗粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物质也会渗透进入凝胶孔穴内部，而大分子物质则被排阻在外。通过离心或过滤去除凝胶颗粒，即可得到浓缩的样品溶液。这种浓缩方法基本不改变溶液的离子强度和pH值。,5.蛋白质的复性为了减少高浓度下的聚集反应,凝胶过滤层析技术也可以用来进行蛋白的体外复性。层析介质的隔离作用,降

7、低了蛋白之间相互作用产生的聚集,使复性浓度、复性率都得到很大的提高。同时,蛋白经过凝胶过滤层析本身也可得到一定的纯化。,为了提高蛋白质复性效率，发展了一种梯度凝胶过滤层析复性方法。在色谱柱中预先设置变性剂浓度的梯度，当复性的蛋白质进入到柱子中后，由于蛋白质的表观分子量远远大于变性剂的，从而蛋白质经过了一个变性剂浓度逐步降低的环境，蛋白质逐步地折叠复性，从而有效地降低了聚集体的形成，并能把聚集体和折叠的蛋白质进行分离。,影响分离效果的因素,1.基质的颗粒大小、均匀度2.筛孔直径和床体积的大小3.洗脱液的流速4.样品的种类等，5.缓冲液的pH6.而最直接的影响是 Kav 值的差异性，Kav 值差异

8、性大，分离效果好；Kav 值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。,影响凝胶过滤的因素,层析柱的选择 一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm加样量 加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。凝胶柱的鉴定 凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡洗脱速度 一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长,本

9、实验的原理,本实验利用凝胶过滤的特点，先向层析柱中加入FeSO4溶液，形成一个还原带，然后加入血红蛋白样品（血红蛋白与高铁氰化钾的混合液）。由于血红蛋白分子量大，在凝胶床中流速快，当其流经还原带时，褐色的高铁血红蛋白立即被还原为紫红色的亚铁血红蛋白。亚铁血红蛋白继续下移，与缓冲液溶解的O2结合，形成鲜红色的氧合血红蛋白。铁氰化钾是小分子量化合物，呈黄色带远远地落在后边。这样，就可以形象直观地观察到凝胶过滤的分离效果。,实验主要步骤,凝胶溶胀,装柱,制备血红蛋白样品,平衡（20min）,上样和缓冲液洗脱,形成层析柱还原层,装柱注意事项,1.装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重

10、新装柱。2.流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。3.进行实验时，注意与目标物分子量相似的尽量少。4.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。,操作步骤1,1.装柱:检查上下柱帽是否通畅,将接线短的柱帽接在层析柱的下端.加入1/8柱体积的去离子水或磷酸盐缓冲液,搅拌小烧杯里的凝胶,并连续的装入层析柱中,使沉积后的凝胶高度不低于12cm,接上上端的柱帽,将其连线插入三角瓶里磷酸盐缓冲液中,平衡20分钟.,操作步骤2,2.上样前的准备调节恒流泵的流速为610滴/分钟,并将其进水口与层析柱的下端接线相接.撤去柱上端的柱帽,放入与柱内径大小一致的

11、滤纸片一块,检查胶面是否平整,层析柱是否均匀.然后将胶面上的缓冲液用排气键放至与胶面相齐,关上恒流泵.切忌干胶!,步骤3,A.上样FeSO4 0.5ml于滤纸面上。开启恒流泵至液面与胶面相齐。关泵。B.上1ml磷酸缓冲液,开启泵,至液面与胶面相齐。关泵。C.上0.5ml血红蛋白样，开泵，至液面与胶面相齐，关泵。D.同B操作。E.上5ml的磷酸缓冲液。接上上端柱帽与磷酸缓冲液，连续洗脱，观察现象，并用烧杯分别收集血红蛋白样品与铁氰化钾。,凝胶过滤层析中,小分子物质能进入填料内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。,Thanks a lot,