血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳.ppt
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1、血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳,第六组,蛋白质的分离,蛋白质是生物大分子化合物,具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分离纯化的方法主要有:盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。,透析,超速离心,凝胶过滤层析,离子交换层析,电泳技术的原理,电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷,成为带电颗粒,在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同,其在电场中的泳动速率也不同,从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基(-NH2)和羧基(-COOH),是典型的两性电解质,在一定PH条件下会解离带上电荷,COO-COO-COOH+H
2、+H+Pr Pr Pr+OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI,迁移率电场力 F=EQ(E:电场强度,Q:电荷)阻力 F=6(:半径,:介质粘度)/E表示单位电场强度时粒子运动的速度,称为迁移率,也称位泳动度,以表示:=/E=Q/可见,离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质,即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率,因此电泳一定时间就可分开它们。,样品性质 与分离样品所带电荷成正比,与样品相对分子质量成反比。电场强度 电压越高,带点粒子移动越快。缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多,迁移速度越快;反之越慢。离子强度等于1/2ciz
3、i2支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。温度,影响电泳分离效果的因素,电泳的分类,1、根据固体支持物种类的不同 纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳2、根据电泳装置不同 薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,琼脂糖凝胶电泳,琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖,由于这些基团带有电荷,在电场力作用下能产生较强电渗作用,因此用于作为电泳支持物。琼脂糖凝胶电泳具有:操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可进行电泳;电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好;可直接用于紫外检测;易染色易洗脱等优点。尤其适
4、合核酸的分离。,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰氨凝胶电泳,实验目的1、掌握电泳的基本原理,了解电泳仪、电泳槽的基本结构与功能。2、熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本过程。,实验原理,聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂(过硫酸铵),四甲基乙二胺(TEMED)作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成1225个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分离效果好。根据有无浓缩效应可分为:连续系统与不连续系统,其中不连续系统因具有浓缩效应,分
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