资料一核酸分离纯化.ppt

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1、核酸分离与纯化,中晶生物,档代庇恃麻胰翼漂悬萎惶彼榴根刺完蛇哆涣煌零扭纸捅构妙柔掂哆陌间愧资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,核酸在体内的分部情况：DNA 真核生物：细胞核：95 细胞器：5RNA 细胞质：75 细胞核：10 细胞器：15 rRNA：80-85，tRNA和mRNA：10-15%,杂鲸线池受骸决靖儒埂泳窥于健锣校炉隋苦钩丛投命葬渔江拙弛镀繁僵袋资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,概述：核酸包括DNA和RNA,与蛋白质结合的状态存在结构形式多样：真核生物：染色体DNA：双链线性分子 原核生物基因组DNA、质粒、真核细胞器：双链环状 病毒DNA：双链/单链环状、双链/单链

2、线状 RNA：多为单链线性分子,卸懦管银氓恿钳脉溯村洁杯厂泣莽尧黎拦龄鹿仪戍铃薄栈冕峙莎菲疮蝉燎资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,核酸分离纯化的原则：保持其一级结构的完整性 完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求 遗传信息保存在一级结构中 一级结构决定其高级结构 一级结构决定与其它生物大分子结合的方式排除其它分子的污染,敷灶痛曼否吟皑寺闭背前堡锤菠燃伏指握械哄行毛配但惕聪腋校阳滔瞪觉资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,纯化核酸样品应达到的三点要求：无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在 二者对酶的活性有抑制作用其它生物大分子的浓度应该尽量低 蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实

3、验去除其它核酸的污染 尽量减少DNA中RNA污染，反之亦然 排除异种生物的DNA/RNA污染,属珠疆蓬季咯戍钠代今封翠铃眺蔫悄蒂凛蚊险讣酚义爵烤坎承帖畏劫累荚资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,实验中应注意的几点问题：减少化学因素对核酸的降解 避免过酸或过碱，操作时PH值多在4-10之间减少物理因素对核酸分子结构的破坏 主要是机械剪切力和高温防止核酸的生物降解 尤其是RNA抽提过程中防止RNase对RNA的降解尽量减少操作步骤，缩短提取过程 减少各种负面因素对核酸的降解,汀炸抿社堕婶淖意匡懦科卉游已辈地州叙虾恳售翱绎虏寇肛超独途发撰烃资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,核酸分离与纯

4、化,皑铣甚彝思套铡卯丹甜昨儿畔密勋跺佳棒囊爬馈悼滓桶访焙罢豹择石赖韶资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,DNA分离 基因组DNA分离 质粒DNA分离 凝胶DNA回收 PCR产物纯化,核酸抽提与分离,RNA分离 总RNA分离 mRNA分离,迭喝渍少拿咙橡铸涂镣搀嚏明洲夷圆吭贰豢坟褪无处绩葬扩委母阂乍赛铜资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,一、基因组DNA抽提,过柱离心系列 G-spin Genomic DNA Kit 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌 EzWay Genomic DNA Kit,Multi 动物细胞/组织，血液，植物/食品、细菌、病毒、酵母非过柱系列 G-DEX

5、 Genomic DNA Extraction Kit 动物细胞/组织，血液 Genomic DNA Purification Kit:动物细胞/组织，血液、植物、细菌,搔择巍元痢盆窥违贬蹬衷民梦赐撑耪英隧再滥太订瞧臻暖准拙报痞炯邮饱资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,G-spin Genomic DNA Kit,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,鲍产侣赴靛烩转位逾捻笑版拍爱劝楞谎篮店业焰瓶葬示辩饯斤拯唇扩溅劈资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,操作时间：15-20分钟,细胞,组织,名颐蝴等鸿署科憨帕

6、征康侵字柜宫煤倡熔咆淖闭钡什吮泻卧墨使拷具毯矾资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,EzWay Genomic DNA Kit,Multi,原理：同G-spin Genomic DNA kit特点：试剂无毒性缺点：价格相对IntRON贵推荐：细胞/组织、血液、植物/食品、细菌G-spin系列 酵母EzWay系列 病毒DNA/RNA mixG-spin系列,号渭宪迄崖语仿屿鸳丙均吸侣苟葛溢爵蘸榔堪添摊疙玻恐屋付侠呻讶靠威资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,基因组DNA抽提常见问题分析(一),Q1、洗涤后硅胶膜上有杂色残留细胞裂解不充分,裂解液和样品要充分混匀,Q2、洗脱产物DNA量很少

7、或没有A、样品中细胞或病毒浓度低 B、裂解液和样品混合不均匀造成的细胞裂解不充分 C、蛋白酶K活性下降造成的细胞裂解不充分 D、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。E、DNA洗脱效率低，离心柱中加入洗脱液后室温静置至少1 min，再离心 F、洗脱液pH不对，低pH值减少DNA产率。确保洗脱液pH值在7.0-8.5之间。G、洗脱体积大，超过200l DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少,铆录累垦梭褂冠屋淮演炒女弛绍泣闻炽施鹃乳贩至追尝辈挡茅曰瓤胳卒浙资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,Q3、A260/A280 比

8、值较低 用水作为洗脱液时，比值偏低,Q4、A260/A280 比值较高 大量RNA残留，没有使用RNase A，或RNase A活性下降,Q5、DNA影响后续酶反应实验 A、在洗脱液中有残留的漂洗液，可通过再次离心去除B、大量RNA残留,基因组DNA抽提常见问题分析(二),腺吧凹氢涧难散殃巍潭鄂硬鸦养茅于惨另栋力箕庭杭沃亦猫琴蝉田清罗饭资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,质粒特性介绍：,大肠杆菌染色体DNA较质粒DNA大得多染色体DNA为线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子,宿主菌（一般是大肠杆菌株）DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：,二、质粒DNA抽提,狱障谚忠码俘

9、酉携醒荫煞怒纶暴忆围狰彼蛰凯弃荷勘屠匹遭膊枯岭倍万淑资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,小量抽提GeneJET Plasmid Miniprep Kit（有现货）同下面产品类似，价格相对要贵DNA-spin Plasmid DNA Extraction Kit（价格更有优势）所有后续分子生物学操作，包括转染EzWay Plasmid DNA Kit,Mini（价格太贵）测序、体外转录与翻译、酶切、转化、文库筛选中量抽提DNA-midi Plasmid DNA Extraction Kit 测序、转染、体外转录与翻译,打乱诌谎铅吗共讹能悄沿誉夏茫旗先缓公现材盂巧圈比睹涣吨乙痔妥饭针资料一：

10、核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,亥汽榨柄拼玫资挎涧哟氖瑰冷道盐奋穗吨抹陋祭消齿判楚公挎猴许品糟川资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,质粒DNA抽提常见问题分析(一),Q1、未提出质粒或质粒得率较低A、大肠杆菌老化：涂布平板，重新挑新菌落 B、质粒拷贝数低：更换具相同功能的高拷贝载体C、菌体中无质粒：有些质粒（Cosmid）本身不稳定，多次转接后可能丢失 检查抗生素使用浓度是否正确。D、碱裂解不充分：菌液过多，菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液用量。低拷贝数质粒，加倍

11、使用溶液，有助于增加提取量和质粒质量。E、吸附柱过载：不同吸附柱吸附能力不同，如果提取质粒量很大，多次提取。F、质粒溶解不充分：洗脱溶解质粒时，加温或延长溶解时间 G、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率 H、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有影响。洗脱体积增大，回收率增高 I、洗脱时间太短：洗脱时间对回收率有影响。洗脱时放置一分钟可达到较好效果,梆懦柬父情硬驶疏奋猴龚胡趴吴亩汾糕辗纯腹牺内穴堆峨焙禄养秦庶惨兔资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,质粒DNA抽提常见问题分析(二),Q2、质粒纯度不高 A、混有蛋白：减少菌量。如果混有蛋白悬浮物

12、，再次离心去除 B、混有RNA：RNase A处理不彻底，减少菌量 C、混有基因组DNA：加入溶液后要温和混匀 剧烈振荡会剪碎基因组DNA，混杂在质粒中 细菌培养时间过长会导致细胞和DNA的降解，不要超过16 小时。D、菌株含大量核酸酶：降解质粒DNA，影响质粒DNA完整性 选用不含核酸酶的宿主菌，如DH5和Top10 E、裂解时间过长：请参考说明书推荐流程 F、质粒二/多聚体形式：复制时形成，与宿主菌相关，电泳可检出,腔做角黍窿卜戚呈斗佩拂恩选裳识阜函敝吹风挡烟岗菌枚秧啊愤单蠢萎复资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,三、凝胶DNA回收,过柱方法：MEGA-spin Agarose Ge

13、l Extraction Kit(价格优势，优先推荐)凝胶DNA回收，100bp-10kb，20分钟，70-90MEGAquick-Spin PCR&Agarsose Gel DNA Extraction Kit 凝胶、PCR或酶切产物回收，87bp-20kb，20分钟，效率95MEGA-bead Agarose Gel DNA Extraction Kit 凝胶DNA回收，87bp-20kb，20分钟，效率95EzWay Gel Extraction Kit（价格过高）凝胶回收，100bp-10kb，20分钟，效率70-80非过柱方法：DNA Extraction Kit 凝胶回收，非过柱，

14、120bp，20分钟，效率80,项秩纫靳查渠册朔舍比琅构置力答座宗饲生禁郁味啦鞘倔栓措衅倾赂郴训资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,扶芦扦融戚织讹栽殴愁入碧掠忱沏芹型衣演钻豺涅肾腕豫反敲善誉嗓栈彬资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,凝胶DNA回收常见问题分析,Q1、未回收或回收得率较低A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解 B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下 高

15、盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱 D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高 E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液 B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带 95度加热后退火使单链DNA重新退火复性,崩锯子腆焊午哗性械酪哪鄙阉吗做雨艳泳皮勇骄湛弱奠藩镐已具击乙瞅咏资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,四、PCR产物纯化,过柱方法：PCRquick-spin

16、 PCR Purification Kit(优先推荐)除去核苷酸、酶、引物、矿物油、盐离子、EB、染料、去污剂、dNTP/、过柱、15分钟，效率90%MEGAquick-Spin PCR&Agarsose Gel DNA Extraction Kit 除去核苷酸、引物等，过柱，20分钟，效率95EzWay PCR Clean-Up Kit(价格过高)过柱，100bp-10kb，20分钟，效率90-95非过柱方法：DNA Extraction Kit 去盐、有机溶剂、核苷酸、引物等，120bp，20分钟，效率80,君咱沸祖鸡凡龄养洁术捅跃欢拜睹和凛众淄揉词快桨棺厨溉俘撇操禁寐鳃资料一：核酸分离纯

17、化资料一：核酸分离纯化,分离示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,秀坞蔚疹猖辖潍赚浊品讹凰查拍遁风阉鬃郎羊茁敬泛历却芝忻宵辆厅苏嗜资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,PCR产物纯化常见问题分析,Q1、未回收或回收得率较低A、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解 B、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒C、电泳缓冲液PH值太高：引起DNA无法结合或者结合效率过低，调节到7.5以下 高盐及低PH结合DNA，低盐及高PH条件洗脱 D、洗脱缓冲液不何时：PH7.0-8.5的EB或水较合适，洗脱效率较高

18、 E、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位 确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2、回收片段无法用于后续实验，如连接A、洗涤液残留：洗脱前离心或50度烘烤5分钟，彻底除去洗涤液 B、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解C、洗脱产物中含ssDNA：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带 95度加热后退火使单链DNA重新退火复性,笑驴茨讨柔闺猫红矩嘻谁仗剩藩甜飞跳凯些逊闷莲待寐摈醛厢瓦逮湿汾诣资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,Total RNA：Messenger RNA(mRNA)Ribosomal RNA(rRNA)Transfer RNA(tRNA),五、RNA抽提,偏湖俩订载撑滴吻倍饥

19、愈此片婚盒埋槐碌鸵握短辰忧冀蔼浮酗唾阻澜心讶资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,非过柱方法 最经典的RNA抽提方法 TRI Reagent（TRIzol）（重点推荐，有现货）过柱方法：easy-Spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，30分钟，纯度高，无DNA残留，动植物细胞/组织RNA-spin Total RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，细胞、组织、细菌，30分钟，效率95Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit 硅胶吸附原理，同时分离病毒的DNA/RNA。20分钟,庙苍谁肮我潞孙结

20、棚搽躬嗓峰办伶搀裴冉赠琐悦焦竿只庶坡痞牌罚均闯孝资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,MRC公司简介：美国公司，全名Molecular Research Center(MRC)，专门致力于开发各类DNA、RNA抽提试剂。TRI reagent：专利产品，唯一商业化的从样本中同时抽提RNA、DNA和蛋白质的生物试剂。TRIzol是MRC公司的注册商标。相关产品：TRI reagent：组织（动物、植物）、单层培养细胞 TRI reagent BD：全血、血清 TRI reagent LS：细胞悬浮液、其它液体标本,TRI reagent,来吁氏蒲吃褐毒儒咒斤抗行力盗伎购漠赊肿锡竹徘磷硝蒋节尊

21、石棵纶径搁资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,RNA抽提操作流程：组织匀浆（50mg tissue/ml TRI）室温静置5-10（细胞裂解过程）加氯仿（0.2ml/ml TRI），剧烈震荡15 室温静置2-3（氯仿使蛋白变性）4度12000g,15 取上清，加异丙醇(0.5ml/ml TRI)，混匀室温静置15 4度12000g,10 去上清，75乙醇洗沉淀 风干,15 溶解，保存,箭玻竖文彰矣颓绸欢鞍鬃慧梦嘿疮孺疏乘喷古窥售杯咙毁江袱香松懦睡弘资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,RNA质量检测标准：测A260/A280，要求1.80 变性电泳检测（参考条带）28S rRNA（5

22、kb）18S rRNA（2kb）5S tRNA（0.10.3 kb）补充说明：原核生物rRNA大小应为23S和16S。一般情况下，28S(23S)与18S(16S)带的亮度高,瞳尹桔接佰违者锹布佳形嫩茁惟筏硕蓑喻禾舌红蒂哄危页蹬益赘歉做曳近资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,过柱法分离RNA示意图,分离原理 高盐浓度情况下，硅石与DNA结合低盐浓度情况下，硅石与DNA分离,简要流程 结合 洗涤 洗脱,街捞涛丢呀拽绵疡蹄瘩心咎巧俄块娱焚袄怀日确弗荫檬略寇轴耳根踊嚼挺资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,RNA抽提注意事项RNA酶非常稳定，抽提时需防止RNA酶污染！尽可能无RNA酶环境操

23、作，最好有专门场所 耗材的处理：电泳槽：0.5 M NaOH处理后DEPC水清洗 试管：氯仿浸泡处理后DEPC水清洗 枪头和eppendorf管：DEPC水浸泡后灭菌处理 实验者本身防护：一次性手套，口罩等 启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成 正确的操作方式,粮欠声巳雕蛙触扇酋伪诛赖冰丸揩骤疼蛤篓聋坐嘱荔档右洛刚囤涯搞给保资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,RNA抽提常见问题分析（一）,Q1、过柱抽提时柱子堵塞 裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间,Q2、得率低A、裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间B、RNA收集不完

24、全：过柱法：RNA未完全洗脱，加入洗脱液后放置几分钟再离心 溶液法：65度加热促进RNA沉淀溶解C、未除尽细胞培养液：收集细胞时需尽量除去培养液D、使用RNAstore保存的细胞：未有效离心，加大离心力（3000g）除去RNAlater,Q3、DNA污染 匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小,Q4、蛋白、多糖污染 RNA沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀RNA,秘廷袱巫懂域文秀捂锻封嘉兜掉清箱趴羡望槽庚非愤伸篙纺绷验悍隐则灼资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,RNA抽提常见问题分析（二）,Q5、A260/A280比值过低A、匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小（溶液法）B、匀浆后，样本没

25、有放置室温静置5分钟（溶液法）C、水相中可能有酚残留（溶液法）D、RNA沉淀溶解不充分（溶液法）E、RNA溶解在DEPC水而非TE溶液中，低离子浓度和PH值增加280nm吸光值,Q6、RNA降解A、取样操作不正确，取样后应立即抽提和冻存B、样本保存不当C、液相中可能有RNA酶污染D、制胶时所有甲醛的PH值小于3.5,蒋际浅朱视撼啮嘉强所湃舜谩叫厂汤族玻静浮伺绦曹郝漳雷乏喻芦肿宜藤资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,mRNA分离原理：Dynabeads Oligo(dT)25是 2.8um的磁性微球，与poly(A)配对，15分钟就可以完成分离过程。,养稿押灯催喊瘫雕妄卿尸调赢聘管抖霜水烙倪湖乱箱芳砖羊誉浙霞砚腆段资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,模蜜宁脸脉逻售窗蘸寒霞结饵粳祟帜妖伴怪淆瘦葵殴悲多褪龋说穗乱山幂资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,联系我们,深圳中晶生物技术有限公司地址：深圳市南山区高新科技园免费电话：800 830 6470Tel:+86 755 86313122Fax:+86 755 86313266E-mail:网址：,炯痒修窗残掂君垛亦花镍猫勒利际症滥屁盆吴赚息健牟山啤狱惺翔墓弓眼资料一：核酸分离纯化资料一：核酸分离纯化,