细菌耐药及标本留取赵学礼.ppt

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1、关注细菌耐药及标本留取,赵学礼 河南大学第一附属医院,触目惊心耐药菌,近年来,由于对抗生素的过分依赖和滥用,使抗生素在治病的同时,又成为威胁人类健康的隐形杀手而引起社会的严重关注 21世纪人类将面临三大病原微生物的威胁:耐多药结核菌,艾滋病病毒,医院感染的耐药菌株,其中耐药菌的发展速度令人触目惊心,目前值得关注的细菌耐药问题,MRSA 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRCNS 耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌VRE 耐万古霉素肠球菌VRSA 耐万古霉素金黄色葡萄球菌MDR-TB 耐多种药物的结核分枝杆菌PRP 耐青霉素肺炎链球菌ESBL 产超广谱-内酰胺酶的大肠埃希菌、克雷伯菌和奇异变形杆菌,目前值

2、得关注的细菌耐药问题,持续高产染色体I型-内酰胺酶（AmpC）的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌，弗劳地枸橼酸杆菌多重耐药的铜绿假单胞菌，不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌泛耐药的铜绿假单胞菌，鲍曼不动杆菌产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌,细菌耐药的严重性-国内,中国细菌耐药性监测-CHINET监测（2008年）,参加单位上海华山医院上海瑞金医院北京协和医院卫生部北京医院浙医一附院上海儿科医院,广州医学院一附院湖北同济医院上海市儿童医院重庆医大一附院甘肃省人民医院新疆医大一附院,2008年CHINET监测网各医院的菌株数,门诊分离株：12.4（4378/35215）住院分离株：87.6（30837/35215）,CH

3、INET耐药监测网革兰阴性菌菌种分布,2008年CHINET监测网各医院产ESBL菌株检出率,产ESBL不仅对二三代头孢耐药，对非头孢类耐药也明显产ESBL者对碳青霉烯类耐药率低其次是舒普深再是哌拉西林/他唑巴坦对内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药率均很高,2008年12家医院克雷伯菌属的耐药率（%）,产ESBL不仅对二三代头孢耐药，对非头孢类耐药也明显产ESBL者对碳青霉烯类耐药率低其次是舒普深再是哌拉西林/他唑巴坦对内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药率均很高,2008年12家医院大肠埃希菌的耐药率（%）,产ESBL不仅对二三代头孢耐药，对碳青霉烯类耐药率低其次是舒普深和再是哌拉西林/他唑巴

4、坦庆大和环丙不论是否ESBL耐药率均很高,对碳青霉烯类耐药率2对头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、头孢吡肟和哌拉西林/他唑巴坦的耐药率次之（20%）,2008年12家医院1416株肠杆菌属细菌耐药率（%）,虽然肠杆菌属过去认为产AmpC酶为主，但现发现对四代头孢耐药率高于舒普深提示也产ESBL,对碳青霉烯类耐药率5%余同肠杆菌属,2008年12家医院260株柠檬酸杆菌属细菌耐药率（%）,2008年12家医院13259株肠杆菌科细菌耐药率（%）,对多数测试药的耐药率在1532，近年来较稳定。碳青霉烯类耐药率增高显著，美罗培南、亚胺培南耐药率分别为25、30，较2007年略低。,2008年12家医院40

5、34株铜绿假单胞菌耐药率（%）,碳青霉烯耐药率高于舒普深但总的耐药情况优于2007年,2008年12家医院3508株不动杆菌属(鲍曼不动86.2%)细菌的耐药率（%）,舒普深耐药率最低碳青霉烯耐药率高达40%，均明显差于2007年,2008年12家医院嗜麦芽窄食单胞菌和伯克霍尔德菌属的耐药率（%）,2008年12家医院10017株非发酵菌耐药率（%）,中国细菌耐药性监测-CHINET监测2008,G-杆菌药敏现状之原因,耐药性的发生机制,灭活酶或钝化酶的产生靶位的改变细菌的泵出机制抗生素的渗透障碍,细菌耐药的主要机制,水解酶,外膜通透性,泵出机制,适者生存,靶位改变,细菌对-内酰胺类的主要耐药

6、机制,-内酰胺酶的分类根据结构,金属-内酰胺酶,丝氨酸-内酰胺酶,A类-内酰胺酶ESBLs KPC,B类-内酰胺酶 IMP VIM,D类-内酰胺酶OXA,C类-内酰胺酶AmpC,（金属酶）,ESBLs的药敏特点,理论敏感药物：碳青霉烯类、头霉素类、-内酰胺酶抑制剂复合物但产酶菌的数量、细菌的累积、高产量的ESBLs、细菌变异可影响酶抑制剂复合物的敏感性,ESBLs的药敏特点,耐药药物：青霉素、头孢菌素、单环-内酰胺类药物在体外可对部分三代头孢菌素和安曲南敏感，但体内临床试验灭活,产生ESBLs的原因,三代头孢菌素的大量使用预防性使用的增多国产仿制品大量使用侵入性操作（气管插管）,ESBLs,A

7、mpC酶,AmpC酶是最重要的-内酰胺酶之一，属C类酶，耐酶抑制剂克拉维酸，但可被邻氯西林抑制，对头孢菌素的水解率大于青霉素。AmpC酶有染色体介导和质粒介导两种。,染色体AmpC酶主要存在于阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、枸橼酸杆菌、鲍曼不动杆菌、粘质沙雷菌等细菌中染色体AmpC酶的表达模式：诱导型(可恢复)结构型(持续高产)：ampD突变 启动子突变,质粒AmpC酶主要存在于 天然缺乏AmpC结构基因的细菌，如：克雷伯菌属、奇异变形杆菌和沙门菌属 缺乏AmpR、由弱启动子和衰减机制调控而低水平表达的大肠埃希菌。质粒AmpC酶的表达模式：持续高产,指所有能明显水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生

8、素的一类内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中的A类、B类、D类酶。,碳青霉烯酶,天然来源碳青霉烯酶嗜麦芽窄食单胞菌的L1酶获得性碳青霉烯酶A类酶：染色体介导-SME,NMC,IMI；质粒介导-KPC，GES B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54,碳青霉烯酶按其来源可分为,外膜通透性下降,先天不足：内在性耐药或固有性耐药；细菌本身存在的膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药物不能进入菌体内部 后天培养：原有的孔蛋白通道由于细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失,靶位改变,MRSA Methicillin-resistant sta

9、phylococcus aureus 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSCN/MRCoNS Methicillin-resistant coagulase-negative staphylococcus 耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌,mecA基因编码的PBP2a发生结构变异，对所有的-内酰胺类药物耐药常同时对红霉素、克林霉素、四环素等多重耐药性，万古霉素常是MRS的唯一选择MRS是医院获得性感染的重要来源，易引起爆发流行,MRS特点,主动外排系统,铜绿假单胞菌的主动外排系统,主要由3部分组成：外膜蛋白，内膜蛋白，膜融合蛋白3种蛋白连接在一起可形成连续的通道，开口于外膜，直接将药物排到菌体外,细

10、菌耐药机制常见细菌的耐药特点临床用药临床病例,不同G-菌耐药特征,肠杆菌科-产ESBL酶，尤其是大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌非发酵菌-产酶（不仅ESBL，还有碳青霉烯酶）、外排泵出及通透性下降，可导致多药耐药铜绿假单孢菌及多重耐药不动杆菌,超广谱-内酰胺酶（ESBL）,分类 名 称 来 源 代 表 酶 主 要 产 酶 菌,Bush 头孢菌素酶 染色体 AmpC 肠杆菌属 拘橼酸杆菌属 肺克 质粒 大肠 铜绿 志贺菌 沙雷氏菌Busha 青霉素酶 质粒 PC1 G+球菌（金葡菌）极少见于大肠 b 广谱酶 质粒 TEM-1、2 大肠 克雷白 嗜血杆菌（ROB-1）SHV-1 奈瑟菌 沙门菌 志贺菌 假

11、单胞菌 be 超广谱酶 质粒 TEM-329 大肠杆菌 克雷白菌（ESBLS）SHV-26 铜绿假单胞菌（PER-1）染色体 KI、PER-1 产酸克雷白菌 铜绿假单胞菌 br 耐酶抑制剂 染色体 TEM-3041 大肠杆菌 TEM-44、45 Bush 金属酶 染色体 L1 嗜麦芽窄食单胞菌 铜绿假单胞菌 IMP-1 嗜水气单胞菌 芳香黄杆菌 CcrA 脆弱拟杆菌 Bush 青霉素酶 染色体 分子分型不明 洋葱假单胞菌,be 超广谱酶 质粒 TEM-329 大肠杆菌 克雷白菌（ESBLS）SHV-26 铜绿假单胞菌（PER-1）,2007年CHINET监测网各医院产ESBL菌株检出率,200

12、8年CHINET监测网各医院产ESBL菌株检出率,增加的ESBL有何危害？产ESBL的细菌如何选择适当药物？.,有关ESBL现状与思索,碳青霉烯类抗生素,优势：最强的体外抗菌活性最高的敏感率存在的问题：如果患者免疫力尚可，感染控制；如何患者免疫力下降呢？如高龄、器质性肺病、糖尿病等，则可能增加多重耐药的非发酵菌的感染机会或其它二重感染,产ESBLs细菌感染的治疗,-内酰胺抗生素/酶抑制剂复合物,应用时间较短者抗菌活性较好，应用较久的药物则存在着不同程度的耐药酶抑制剂耐药的原因可能与ESBLs产量大而酶抑制剂剂量相对不足有关,产ESBLs细菌感染的治疗,非-内酰胺类抗生素,产ESBLs菌往往对氨

13、基糖甙类和喹诺酮类呈交叉耐药（如庆大、环丙耐药非常高）选择此类药物时应参照体外药敏试验结果，敏感者可用于产ESBLs细菌感染的治疗,产ESBLs细菌感染的治疗,铜绿假单胞菌感染的抗生素选择,-内酰胺类抗生素 青霉素类哌拉西林及其酶抑制剂复合物替卡西林及其酶抑制剂复合物第三代头孢菌素头孢哌酮/舒巴坦头孢他啶第四代头孢菌素碳青霉烯类,非-内酰胺类抗菌药物喹诺酮类药物环丙沙星左旋氧氟沙星新喹诺酮类药物对革兰氏阳性菌、厌氧菌、分枝杆菌及非典型致病原的作用有所增强，对包括绿脓杆菌在内的革兰氏阴性杆菌的活性并没有增强氨基苷类抗生素,铜绿假单胞菌感染的抗生素选择,常用的药物没有一种敏感性特别高，因此治疗往往

14、需综合治疗首先判断定植与感染：部分痰培养铜绿假单孢菌不一定要治疗选择敏感的或未用过的抗生素注意消除诱因：如排痰、机械通气早日脱机增加机体免疫力：营养支持联合用药：双药联用；全身与局部联用（如局部吸入多粘菌素）尽量避免易诱导铜绿假单孢菌多药耐药的抗生素,泛耐药铜绿假单胞菌抗生素选择对策,联合用药治疗铜绿假单胞菌感染,联合用药在理论上的益处延缓继发耐药的出现具有协同抗菌作用常用的联合治疗方案-内酰胺类+氨基甙类哌拉西林/他唑巴坦+氨基苷类舒普深+氨基甙类头孢吡肟+氨基甙类-内酰胺类+喹诺酮类哌拉西林/他唑巴坦+CIP或LVF舒普深+CIP或LVF头孢吡肟+CIP或LVF,不动杆菌,鲍曼不动杆菌纯培

15、养的镜下形态（革兰染色）,鲍曼不动杆菌在麦康凯琼脂平板上的粉红色菌落,鲍曼不动杆菌在血琼脂平板上的菌落特征,抗生素应用中的注意事项,根据实验室或临床做出的病原推断选用抗生素最好有药敏结果的指导应了解所在地区病原的耐药情况应了解所选药物的剂量、特点、副作用选用药物、疗程、给药方式应考虑到病情的严重性及PK/PD特点应注意患者的年龄特点、基础病及用药历史,细菌耐药的严重性-省内,2008年河南省部分医院耐药菌株检出率,56.8,65.5,46,72,濮阳某市级医院,42.6,32.4,33,40,南阳某市级医院,68,40.4,33,42,郑州省级医院,62.8,56.3,49,73,郑州省级医院

16、,88.4,77.6,45.9,67.2,郑州省级医院,凝固酶阴性葡萄球菌MRCNS,金黄色葡萄球菌MRSA,奇异变形杆菌ESBL(%),克雷伯菌ESBL(%),大肠埃希菌ESBL(%),菌株医院,细菌耐药的严重性-院内,我院四年间多重耐药菌的检出率,注 意,万古霉素等糖肽类抗生素仍为 治疗葡萄球菌感染的首选 但已出现耐药菌万古霉素对肠球菌的耐药率在不断升高,注 意,碳青霉烯类抗生素仍为治疗 肠杆菌科细菌感染的首选，但已出现耐药菌 碳青霉烯类抗生素对非发酵 菌的耐药率在不断升高,治疗无效，发病率和病死率增加。病程延长，住院天数增加，床位周转率底。花费大量的抗菌药物，使国家药政开支增加，严重影响

17、国民经济发展。危害人类健康，对婴幼儿和老年人、免疫机制低下者的生命构成威胁。,细菌耐药性的危害性,Question（1）,病人发烧都是感染吗?,Answer（1）,临床上有许多发热并非细菌感染所致 如药物热胶原性疾病肿瘤功能性发热等,Question（2）,临床症状是感染，为何培养阴性?,Answer（2）,标本留取不当 痰口水培养前使用大量抗生素实验室培养条件限制,病毒 厌氧菌 G（+）菌 细菌 需氧菌 G（-）菌,肺炎球菌草绿色球链球菌葡萄球菌肠球菌,表皮金黄色溶血性,流感嗜血杆菌肺炎克雷伯杆菌大肠杆菌不动杆菌硝酸盐阴性杆菌假单胞菌军团菌卡他布兰汉菌,肺炎支原体、衣原体 真菌：念珠菌、曲菌

18、、隐球菌 其他：阿米巴、卡氏肺孢子虫,引起感染的病原体,根据药敏用药，为何效果不好?,Question（3）,Answer（3）,致病菌判断不正确,细菌室分离的病原菌不一定都是致病菌，有些可能是定植菌或污染菌。抗生素联用不当或剂量不足，导致感染不能控制。抗生素选择不当 尿路感染-呋喃妥因抗生素给药途径不当，不能到达感染部位，或药物到达病灶部位的浓度太低，如包裹性脓胸、深部脓肿等。检测出耐药菌时，报告药敏结果没有进行修正和说明。,Question（4）,报告耐药，为何临床使用有效?,Answer（4）,体外药敏试验和体内药物疗效确实有差异，主要是因为体外和体内的环境不同。致病菌判断错误,造成药敏

19、与药效不符。污染菌?定植菌?.药敏试验方法选择错误导致药敏结果不准确。药敏纸片的药物浓度变化或失效,造成假耐药情况。,Question（5）,为什么脓性标本（分泌物或穿刺液）常常培养不出细菌？,Answer（5）,标本中的脓细胞可能是白细胞吞噬掉细菌后中毒而死亡的尸体深部脓液多是厌氧菌生长，用常规有氧条件培养，细菌不会生长 标本中可能为苛养菌或慢生长菌，但受接种的培养基、培养环境等因素的影响，可能导致脓标本培养不出细菌。患者体内残余抗生素抑制了细菌的生长。,微生物学检验标本的采集,微生物学检验标本的采集可直接影响到病原体的检出率和实验结果的准确性，必须严格按照操作规范采集、送检和保存，避免标本

20、污染。微生物学检验申请单必须按要求逐项填写，包括患者姓名、性别、年龄、病历号、临床诊断、当前使用的抗菌药物与标本采集时间等。这些都是微生物实验室和临床分析结果与编制信息索引时所需的必要资料。,1.血液及骨髓标本的微生物检验,血液培养是检验血液中是否存在细菌、真菌或其它病原微生物的最好方法。但培养结果易受多种因素影响，如采血时间、部位、采血量和采血的次数等，因此严格掌握每个环节是提高血培养阳性率的关键。,标本采集：血液培养存在不同的系统和方法，每一种系统都有各自的特点，但有些条件是共同的，其中包括采血时间、采血量、培养基的成分等。,采集血培养的指征：,发热（38）或低温（36）。寒颤。白细胞数增

21、多（10109/L，特别是核左移未成熟的或带状的白细胞增多）。粒细胞减少（成熟的多形核白细胞2.5109/L）。,血小板减少。皮肤黏膜出血。昏迷。多器官衰竭。血压降低。呼吸加快。,标本采集时间：,一般原则：一般情况下应在患者发热初期或发热高峰时采集。原则上应 在抗菌药物应用之前，对已用药而病情不允许停药的患者，也应在下次用药前采集。布鲁杆菌感染：最易获得阳性培养结果的是采集患者发热期的血液或骨髓。除在发热期采血外，还可多次采血，一般为24小时采34次。沙门菌感染：根据病程和病情可在不同的时间采集标本。肠热症患者在病程第12周内采取静脉血液，或在第13周内采集骨髓是最佳时间。,亚急性心内膜炎：除

22、在发热期采血外，应多次采血。第一天作3次培养，如果24小时培养阴性，应继续采血3次或更多次进行培养。急性心内膜炎：治疗前12小时内分别在3个不同部位采集血样，分别进行培养。急性败血症：脑膜炎、骨髓炎、关节炎、急性未处理的细菌性肺炎和肾盂肾炎除在发热期采血外，应在治疗前短时间内于身体不同部位采血，分别作需氧和厌氧血液培养。,不明原因发热：可于发热周期内多次采血作培养。如果24小时培养结果为阴性，应继续采血23份或更多次血样本作培养。肺炎链球菌感染：最佳时机是在寒战、高热或休克时采血，此时采集的样本阳性率较高。分枝杆菌感染：当机体抵抗力下降时，分枝杆菌感染初期，容易发生淋巴-血流播散。把握早期采集

23、血样，阳性率较高。,螺旋体感染：应采集早期（一周内）未用药物治疗前的血液。当回归热螺旋体感染时，螺旋体侵入人体内，约经一周潜伏期，可大量出现于血液内。病人在持续发热一周后可退热，血中螺旋体也可消失。间歇12周内，病人会再次发热，血中还可以出现螺旋体。间歇性的采集血液样本可获得较高的阳性率。,标本采集量：,血液培养的阳性率直接与血样本量有关。血液标本与培养基比例以1:10为宜。成人采集以每瓶10ml为宜。婴幼儿采血12ml，儿童采血35ml(可使用相应的儿童培养瓶)。当怀疑真菌感染时，应采集双份标本，分别作双相培养。骨髓采集量一般为12ml。在无法确定患者所感染何种微生物时，应同时作多种微生物的

24、培养，如需氧菌培养、厌氧菌培养、真菌培养等。当使用抗菌药物超过10天，患者应同时用含去抑制剂培养基，如含活性炭或树脂的血培养瓶。,标本接种：,选择合适的培养基：根据临床需要，医生在书写血培养申请单时应注明使用何种培养基，以便护士准确领取所需培养基。推荐每份标本同时接种二种培养基，一瓶需氧菌培养，一瓶厌氧菌培养，因为证明菌血症和真菌血症存在的病原微生物多种多样，也因为血液中可能同时存在需氧菌和厌氧菌。将化验单边条撕下贴在所需的血培养瓶上，如用自动血液培养系统，瓶上都带有可撕条型码，将其撕下贴在相应的化验申请单上。培养瓶如从冰箱取出，必须使温度平衡至室温。用70%酒精消毒培养瓶橡胶瓶盖部分。,标本

25、保存与送检：,接种血液后的培养瓶应立即送至细菌室，如因某种原因不能立即送检时，应将已接种的培养瓶放在室温，切勿放冰箱存放,因为某些苛氧菌可在冰箱中死亡，而使阳性率下降。,注意事项：,样本采集必须在使用抗生素治疗之前，并选择最佳的采集时间、部位、采集次数和采血量。所用培养瓶必须仔细检查有无变色或混浊，变色和混浊表示有污染可能，如有污染应立即与细菌室联系，改换后再进行接种。严格防止标本次序混乱，按一人一瓶一单原则，采样后立即将化验单边条贴在培养瓶上或将可撕条码贴在相应化验单上。对于疑为细菌性骨髓炎病人，应在严格消毒后抽取骨髓1ml，作增菌培养对于HIV病人作为鸟分枝杆菌分离时，骨髓培养比血培养有更

26、高的敏感性。,对于HIV病人作为鸟分枝杆菌分离时，骨髓培养比血培养有更高的敏感性。如用BatT/Alert血液分析系统时，不能用碘酒消毒瓶盖只需75%酒精消毒瓶盖。严格做好患者采血部位的无菌操作。同时作厌氧和需氧培养时，应先将标本接种到厌氧瓶中，然后在注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。,采集标本用的针头、注射器及废弃培养瓶必须经高压灭菌后才能丢弃，因为菌血症患者标本中的微生物可成为传染源。采样后的血培养瓶在送往细菌室的过程中，如天气寒冷应采取一定的保暖措施。应在化验单上表明准确采样时间。如在送检途中培养瓶不慎打破，应封锁现场，妥善消毒处理后再离开。,2.尿液标本的微生物检验,正常人的尿液

27、通常是无菌的。但有一些病原菌和条件致病菌可以通过多种途径引起轻重不同的尿路感染，从尿液中培养并分离出病原菌是诊断泌尿系统感染的重要依据。正确留取尿标本是尿培养的关键，往往由于忽视这一环节而导致培养的失败。因此严格掌握操作规程，才能获得可靠的结果。,标本采集：,标本采集时间：一般原则：应采集晨起第一次尿液送检。应在抗菌药物应用之前采集尿液。沙门菌感染：一般在病后2周左右采集尿液培养。钩端螺旋菌感染：一般在感染后2周左右采集尿液培养。结核分枝杆菌感染：留取晨尿或24小时尿的沉渣部分1015ml送检。,采集方法：,中段尿采集方法：女性：导尿虽然可以减少污染，但多次重复导尿可以造成上行感染，因此近年来

28、大多采取中段尿。该方法简单易行，又无感染危险。成年女性外阴部先以肥皂水清洗，再以灭菌水或1：1000高锰酸钾水溶液冲洗尿道口，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌容器内立即加盖送检。,男性：先用肥皂水清洗尿道口，后用清水冲洗。包皮过长者，为防止包皮内细菌的污染，可将包皮翻开冲洗，再取中段尿。疑为尿道炎时，可将最初34ml尿收集在灭菌容器中。该尿即使细菌数量较少，如反复检查为同一细菌，也应考虑为病原菌。儿童：在多数情况下仅冲洗外阴是不够的，故采集标本较为困难。如尿内细菌明显增多，可高度怀疑为尿路感染，无菌则可否定。菌数居中时，有必要导尿或膀胱穿刺取尿。,肾盂尿采集法：,为确定菌尿是否

29、来自肾脏，可用导尿管采集肾盂尿，充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿做为对照，然后用导尿管插入输尿管，分别标记左右两侧收集3次尿；如输尿管菌数比对照尿菌数多或第三次比第一次多，该菌尿可能来自肾脏。反之，第一次尿菌数多于第三次尿菌数，则可能来自膀胱。此方法一般请泌尿科医师协助进行。,膀胱穿刺采集法：有时采集中段尿完全避免污染较为困难，如遇培养结果与病情矛盾时，可采用耻骨上膀胱穿刺取尿。集尿法：结核分枝杆菌集菌检查时，可用一清洁容器，留24小时尿取其沉渣1015ml送检。导尿法：采取导尿管留尿是一种较好的无菌采集法，取1015ml于灭菌容器内送检。长期留置尿管患者，应在更换新尿管时留取尿标本。标本保存与

30、送检：尿液标本采集后应尽快送检，否则会影响细菌检查的正确性。,注意事项：,尿液标本的采集和培养中最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作。通常应取晨起第一次尿液送检。多数药物均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液均宜在用药之前进行。尿液中不得加防腐剂或消毒剂。,3.粪便标本的微生物检验,人类肠道中的细菌种类繁多，健康人肠道内经常寄居着大量的厌氧菌和少量的兼性厌氧菌。这些细菌一般不引起疾病，一旦肠道发生病理变化，就可能入侵病变部位引起疾病。,标本采集：,标本采集时间：采样原则：腹泻病人应在急性期采集，以提高检出率，应在用药之前采集标本。沙门菌感染 肠热症在2周以后；胃肠炎病人在急性期，早

31、期采集新鲜粪便。,采集方法：自然排便采集法：自然排便后，挑取有脓血，粘液部分的粪便23g，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内或置于保存液中送检。直肠拭子方法：如不易获得粪便时或排便困难的患者及幼儿，可采取直肠拭子方法采集，取出后插入灭菌试管内送检。,标本保存与送检：标本采集后应立即送检，如不能立即送检应放入Cary-Blair运送培养基或pH7.0的磷酸盐甘油（0.33mol/L PBS与等体积的甘油混合）中运送和保存。,注意事项：,粪便虽含有多种杂菌，但应尽量采用无菌容器。为提高检出率，要采集新鲜粪便作培养。腹泻病人应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。标本最好在用药前采集。用于厌

32、氧培养基的标本应尽量避免与空气接触，最好在床边接种。,4.痰液及上呼吸道标本的微生物检验,痰液及上呼吸道标本的细菌检验，对于呼吸系统（上呼吸道、支气管、肺、胸膜）感染性疾病的诊断、治疗具有重要意义。,标本采集：,痰液标本采集方法：自然咳痰法：患者清晨起床后，用清水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰于灭菌容器内，立即送检验。对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入加温至45C的10%NaCL水溶液，使痰液易于排出。对咳痰量少的幼儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽，将痰收集于灭菌容器中送检。,支气管镜采集法：用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管直接取得标本，该方法对患者有一定痛苦，不易接受。

33、胃内采痰法：无自觉症状的结核病人尤其婴幼儿不会咳嗽，且有时将痰误咽入胃内，可采集胃内容物做结核分枝杆菌培养，其阳性率比咳痰高10%左右。该方法于清晨空腹时，将胃管插入胃内，用注射器抽取胃液。,气管穿刺法：通过气管取得痰液主要用于厌氧菌培养。小儿取痰法：用弯压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿轻压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上，送检。上呼吸道标本：采集上呼吸道标本通常采用无菌棉拭子。采集前患者应用清水反复漱口，由检查者将舌向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，将棉拭子通过舌根到咽后壁或腭垂的后侧，涂抹数次，但拭子要避免接触口腔和舌粘膜。,标本保存与送检：,标本采集后应立即送检，以防某些

34、细菌在外环境中死亡。做结核分枝杆菌和真菌培养的标本不能及时送检，放4C保存，以免杂菌生长。,注意事项：,在应用抗菌药物之前采集标本。采集标本以清晨为佳，为减少口腔正常菌数群污染标本，采集前应先用漱口液充分漱口。作结核分枝杆菌检查，痰量要多或留取24小时痰液，婴儿肺结核要用胃管取痰。有1/41/2肺部感染患者可能发生菌血症，应同时作血培养。,5.脓液和创伤标本的微生物检验,标本采集：开放性感染和已溃破的化脓灶：外伤性感染、癌肿溃破感染、脐带残端、外耳道分泌物等感染部位，标本采集前先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，用灭菌拭子采取脓液及病灶深部的分泌物；如为慢性感染，污染严重，很难分离到致病菌，可取感

35、染部位下的组织，置于无菌容器内送检。,结膜脓性分泌物：脓性分泌物较多时，用灭菌棉球擦拭，再用灭菌拭子取结膜囊分泌物培养或涂片检查；分泌物少时，可作结膜刮片检查。扁桃体脓性分泌物：患者先用清水漱口，由检查者将舌向外牵拉，将咽拭子越过舌根涂抹扁桃体上的脓性分泌物，置灭菌管内送检。外耳道分泌物：脓性分泌物较多时，先用灭菌拭子或棉球擦拭，再取流出分泌物置灭菌管内送检。,术后切口感染：疑有切口感染时可取分泌物，也可取沾有脓性分泌物的敷料置灭菌管内送检。导管治疗感染：应做导管尖端培养再加血培养，因为当接受导管治疗的患者有不明原因的发冷、发热时，首先考虑导管感染或败血症，及时采血培养及导管尖端培养，有助于明

36、确病灶。瘘管内脓液：用灭菌棉拭子挤压瘘管，选取脓液中“硫磺样颗粒”盛于灭菌试管内送检；也可用灭菌纱布条塞人瘘管内，次日取出送检。本法有利于检出放线菌。,闭锁性脓肿：,皮肤化脓（毛囊炎、疖、痈）和皮下软组织化脓感染：用2.5%3%碘酊和75%酒精消毒周围皮肤，穿刺抽取脓汁及分泌物送检，也可在切开排脓时，以灭菌注射器或棉拭子采取。淋巴结脓肿：经淋巴结穿刺术取脓液，盛于灭菌容器内送检。乳腺脓肿：在手术引流时采集脓液，盛于灭菌容器内送检。也可做脓肿穿刺，采集脓液标本检查。,肺脓肿：体位引流使病肺处于高处，引流的支气管开口向下，痰液顺体位引流至气管咳出；也可在纤维支气管镜检查或手术时采集。肝脓肿：在手术

37、引流时采集脓液，盛于灭菌容器内送检。也可做脓肿穿刺，采集脓液标本检查。胆囊炎：十二指肠引流术采集胆汁：标本分三部分，即来自胆总管、胆囊和肝胆管,在行胆囊及胆管手术时，可从胆总管、胆囊直接采取；或胆囊穿刺及胆道造影时采集胆汁。,脑脓肿：在手术引流时采集脓液，盛于灭菌容器内送检。也可做脑脓肿穿刺采集脓液标本检查。肾周脓肿：在手术引流时采集脓液，盛于灭菌容器内送检。也可做肾周穿刺采集脓液标本检查。阑尾脓肿：在手术引流时采集脓液，盛于灭菌容器内送检。胸腔脓肿（脓胸）：经胸膜腔穿刺术抽取脓液，盛于灭菌容器内送检。,腹腔积液：经腹腔穿刺术抽取脓液，盛于灭菌容器内送检。心包积液：在手术引流时采集脓液，盛于灭

38、菌容器内送检。也可做心包穿刺术采集脓液标本检查。盆腔脓肿：已婚妇女可经阴道后穹窿切开引流或穿刺采集脓液检查；也可在肛镜暴露下经直肠穿刺或切开引流采集脓液标本采集。关节腔积液：采用膝关节穿刺术取关节液，留于灭菌容器内送检。,肛周脓肿：在患者的皮肤和粘膜表面，先用碘酊消毒，然后用75%酒精脱碘，再用灭菌干燥注射器穿刺抽取，将采集的标本置灭菌容器。疑为厌氧菌感染时，应作厌氧菌培养，取出标本后应将注射器内空气排空，同时将针头插入灭菌胶塞内，以防空气进入。需厌氧菌培养最好通知临床细菌室作床边接种。,注意事项：,在使用抗生素前采集标本，如患者在采集标本前已用药，请在检验申请单上注明，检验人员可在培养基内加

39、入相应拮抗物，以利于提高阳性检出率。采集标本时应注意脓汁及分泌物的性状、色泽及气味，为分离鉴定致病菌提供依据。疑有某种细菌感染，若该细菌对干燥敏感，用棉拭子采集标本后，应立即放入液体培养基内，或采标本前先将棉拭子沾少许肉汤以保持标本湿度。,不能立即送检的标本，应放4C保存；培养淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌的标本除外。深部脓肿常由包括厌氧菌在内的混合细菌感染所致，若有条件应作厌氧菌培养，采集标本应遵守厌氧菌感染标本的采集原则。,6.穿刺液标本的微生物检验：怀疑感染性心包炎、胸膜炎、腹膜炎、关节炎或滑膜炎，应作穿刺液进行细菌学检验。,脑脊液采集时间：怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，应在使用抗菌药

40、物以前采集标本。,采集方法：用腰穿方法采集脑脊液35ml，一般放入3个无菌试管，每个试管内12ml。如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应大于或等于1ml；如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应大于或等于2ml。标本保存与送检：如果用于检测细菌，收集脑脊液后，在常温下15分钟内送到实验室。脑脊液标本不可置冰箱保存，否则会使病原菌死亡，尤其是脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌和嗜血杆菌。,如果用于检测病毒，脑脊液标本应放置冰块，在4C15分钟内送到实验室。用于检测病毒的脑脊液，在4可保存72小时。注意事项：如果只采集了1管脑脊液，应首先送到微生物室。作脑脊液培养时，建议同时作血培养。采集脑脊液的试管不需要加入

41、防腐剂。进行腰穿过程中，严格无菌操作，避免污染。,穿刺液,采集时间：如有感染存在，应尽早采集标本，应在使用抗菌药物之前或停止用药后12日采集。采集方法：首先用2%碘酊消毒穿刺要通过的皮肤。用针穿刺法抽取标本或外科手术方法采集标本，然后放入无菌试管或小瓶内。立即送到实验室。,标本要在1ml以上。标本保存与送检：由于厌氧菌在这些感染中占有较大比例，故除了做一般细菌的培养外，还应做厌氧菌培养。标本在常温下15分钟应送到实验室。如果做真菌培养，在4C条件下保存。,对疑有淋病性关节炎患者关节液，采集后应立即送检。注意事项：应严格无菌穿刺。为了防止穿刺液的凝固，最好在无菌试管中预先加入灭菌肝素，再注入穿刺

42、液。,7.烧伤标本的微生物检验,标本采集：采集时间：烧伤创面愈合前，都可能发生侵袭性感染。但侵袭性感染发生有一定规律性，常见于以下3个时期：早期：侵袭性感染常见于烧伤后10天内，其中大多数发生在烧伤47天，于烧伤后有长途转运、休克期病情不稳定、组织灌注不良，降低了全身和局部的抗感染能力，即人体抵抗力下降，此时细菌易侵袭到深层组织，此期间，最容易发生侵袭性感染，以革兰阴性杆菌为主。,深度烧伤溶痂和焦痂分离期：烧伤后34周左右，在这期间由于坏死组织自溶，感染加重，大片焦痂分离未及时引流易发生感染，同时在焦痂分离时，肉芽生长暴露过多，无法或未能及时覆盖，发生感染的可能性较大。后期：在烧伤后一个月左右

43、，由于创面长时间不愈合，热量-蛋白营养不良，免疫功能低下，容易引起侵袭性感染，血培养阳性率高，金黄色葡萄球菌占优势。因此采集烧伤标本通常在烧伤病人入院后，每日送检标本，尤其在以上三个时期，只有这样才能及时检出病原微生物，为临床治疗提供依据。,采集方法：,用无菌棉拭子，直接从烧伤创面脓汁多部位采集。由于严重烧伤，发生感染同时易发生败血症，同时做血液培养，初次培养可作普通需氧瓶、普通厌氧瓶，若长期使用抗生素后可采血接种高渗需氧瓶或高渗厌氧瓶，每瓶58ml血液。,注意事项：,由于烧伤感染常常由于皮肤和粘膜上的条件致病菌引起，所以只有严格的无菌操作才能准确采到病原菌。检测厌氧菌时由细菌室工作人员亲自去

44、烧伤病人床前采集标本。由于烧伤的早期创面是无菌的，通过12小时才可出现大量细菌，因此在烧伤后12小时内，勿采集创面的标本，否则不能获得阳性结果。已较长时间用抗菌药物患者，如采血样则应接种在加有青霉素酶、对氨基苯甲酸等高渗的培养基内，避免假阴性结果。,8.生殖道标本的微生物检验,标本采集：尿道分泌物：男性：清洗尿道口，尿道口用灭菌纱布或棉球擦拭，采取从尿道口溢出的脓性分泌物或用白金耳棉拭子插入尿道24厘米取出分泌物。如无脓液溢出，可从阴茎的腹面向龟头方向摩擦，促使分泌物溢出。女性：清洗尿道口，用灭菌纱布或棉球擦拭，然后从阴道内诊压迫尿道，或从尿道的后面向前按摩，使分泌物溢出。无肉眼可见的脓液，可

45、用灭菌拭子轻轻深入前尿道内，旋转拭子，采集标本。,巴氏腺、尿道旁腺：清洗或局部消毒然后压迫腺体，使分泌物溢出，集于灭菌容器或用灭菌拭子蘸取。阴道分泌物：用窥器扩张引导，用灭菌棉拭子采取阴道口内4厘米内侧壁或后穹窿处分泌物培养或涂片镜检。宫颈分泌物：用窥器扩张引导，先用灭菌棉球擦取宫颈口分泌物；用灭菌棉拭子插入宫颈管2厘米采取分泌物，转动并停留1020秒钟，让拭子充分吸附分泌物，或用针头的注射器取分泌物，将所采集分泌物置入灭菌试管内送检。,宫腔内容物：羊膜腔感染时可经腹壁羊膜穿刺抽取羊水或经子宫颈插管抽取羊水进行病原体检测如细菌培养。经子宫颈插管抽取羊水进行细菌培养易受阴道或子宫颈部位细菌污染，

46、临床应用价值有限。在怀疑有急性宫腔内感染时，原则上不采取宫腔分泌物，以免引起感染散播；必要时用灭菌导管抽取，导管外套一层保护膜，经子宫颈插入宫腔后再刺穿保护膜抽取分泌物。,前列腺按摩液：用前列腺按摩法采集前列腺按摩液，清洗尿道口，冲洗尿道膀胱，从肛门用手指按摩前列腺，使前列腺液溢出。用无菌容器收集。无肉眼可见的脓液，可用灭菌拭子轻轻深入前尿道内，旋转拭子，采集标本。用于区分泌尿系感染和生殖道感染常用的尿液和前列腺液分段定位培养和菌落计数。又称Meares和Stamry检查法。,方法和步骤：多饮水，46小时内不排尿，包皮过长者将其翻起，用肥皂水清洗局部，灭菌棉球揩干；灭菌试管置尿道口采前段尿10

47、毫升为VB1，代表尿道标本；排尿200毫升弃去，再用第2支灭菌试管取10毫升中段尿为VB2，代表膀胱标本；按摩前列腺后收集前列腺按摩液为EP3；按摩后排尿，收集10毫升为VB3。代表前列腺及后尿道标本。,精液：受检者应在5天以上未排精，清洗尿道口，采用手淫法或体外排精法，射精于灭菌容器送检。溃疡分泌物：先用生理盐水清洗患处，用灭菌拭子取其边缘或基底部的分泌物，置灭菌试管内送检。组织标本：感染部位的组织可作组织印片和培养，将组织磨碎成细胞匀浆接种液体培养基。一、二期梅毒感染时可取活体组织荧光抗体染色或镀银染色，检查病原体。,注意事项：,生殖器是开放性器官，标本采集过程中，应严格遵循无菌操作以减少杂菌污染。阴道内有大量正常菌落存在，采取宫颈标本应避免触及阴道壁。疑有宫腔感染，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取婴儿耳拭子一同送检。沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，取材时拭子应在病变部位停留十几秒钟，并采集尽可能多的上皮细胞。疑有厌氧菌感染，采集标本时避免与空气接触，最佳方法是床边采样，直接做厌氧培养。,谢谢,