细胞电生理研究进展.ppt

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1、细胞电生理研究进展,一 电压钳（voltage clamp）技术,20世纪50年代，Hodgkin and Huxley 首次应用电压钳技术对枪乌贼的标本进行膜电流的测定。,在枪乌贼大纤维内纵向插入两根细铂丝，一根记录电压E，另一根记录电流I。记录膜电位E与调定电压差值经放大进入快速电压-电流转换器(FBA),加入反馈电流I,直至膜电位与调定电压相等为止,维持膜电压不变。当一个神经冲动到达时，出现膜离子电流，为了维持膜电位不变，就必须输入一个与膜离子电流大小相等，方向相反的补偿电流,记录下这个补偿电流就是膜电流的镜像。,工作原理：离子流过通道所形成的离子流是形成动作电位的基础。电生理实验以电流

2、作为刺激源，使可兴奋细胞产生兴奋，然后测定其膜电压以确定离子通道的状态。但在形成动作电位时所产生的离子流可影响膜电位，而膜电位的变化又会影响该离子的通透性的变化。因而，须人为地使膜电位在一定时间内维持在一个固定水平。电压钳技术是通过插入细胞内的一根微电极人为向胞内补充电流，补充的电流正好等于跨膜流出的反相离子电流（大小相等方向相反）。意义：1）确保膜通透性发生改变时，控制膜电位始终维持在指令电位的水平（不变）；2）通过电流检测装置，记录到补充入胞内的注入电流，它相当于离子电流的反相电流。这样可测定在不同膜电位水平的离子电流，从而了解膜通道的电导及功能活动。,（一）电压钳 基本原理,离子通道电流

3、:细胞膜上的电流 膜电容充放电电流 电压钳技术消除膜电容电流的影响 电压钳技术的基本原理：用微电极将膜电压钳制到新的数值上，保持一段时间不变使膜电容完成充放电过程进入电压钳制的稳态期，测得的跨膜电流可以认为来自于离子通道电流。,（二）理想的电压钳,存在问题：没有考虑钳制电压的微电极阻抗RCE（兆欧姆数量级）若考虑微电极电阻，钳制电压VC就就被分压，并且，膜电阻Rm 可以有大幅度改变，,（三）双电极电压钳,加记录电极实现闭环电路的反馈控制,A1和A2为两个高增益的运算放大器，A1连接成电压跟随器，提供 高输入阻抗和低输出阻抗；A2连接成负反馈放大器。,（四）单电极电压钳,在电压钳制的稳态期，钳制

4、电压VC=Vm(Rm RCE)/Rm 只有当钳制电极的电阻RCE远小于细胞膜电阻Rm时，VmVC,二、膜片钳实验技术,膜片钳技术是细胞生物学研究的一个重大发明。,由德国神经生物学家赫尼（Neher）和萨克曼（Sakmann）在1970s年代中期发明，1991年两人共同荣获诺贝尔生理学和医学奖。,Neher,Sakmann,（一）膜片钳技术发展历史,1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-1

5、00G的高阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1m的空间分辨率和10s的时间分辨率。1983年10月，Single-Channel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出贡献，荣获1991年诺贝尔医学和生理学奖。,（二）膜片钳技术的原理,同电压钳，用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面,使之形成10100的密封(giga-seal)

6、，被孤立的小膜片面积为m量级,内中仅有少数离子通道。使与电极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片）与其周围在电学上绝缘，然后对该膜片实行电压钳位，可测量单个离子通道开放产生的pA（10安培）量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系。还可把吸管吸附的膜片从细胞膜上分离出来，以膜的外侧向外或膜的内侧向外等方式进行实验研究。这种技术对小细胞的电压钳位、改变膜内外溶液成分以及施加药物都很方便。,（一）膜片钳技术的原理,1 显微照片2 单个离子通道电流3

7、 多个离子通道电流的叠加。,双电极电压钳技术,低电阻P2、高增益A2时，,VmVc,对细胞有损伤，不宜于小细胞,单电极电压钳技术（膜片钳）,电极电阻远小于膜片电阻，,A1高增益，A2单位增益（检测），,运算放大器的正负输入端子为等电位，向正输入端子施加指令电位、经过短路负端子可以使膜片等电位，达到电位钳制的目的。当膜片微电极尖端与膜片之间形成10G欧（以上封接时其间的分流电流达到最小，横跨膜片的电流（I）可100做为来自膜片电极的记录电流（Ip）而被测量出来。,Rseal,Ip,I,Ip,Rf,R0,R0是与膜片阻抗相串联的局部串联电阻（或称输入阻抗）。R0通常为1-5 M欧，如果Rseal高

8、达 10G欧，此时Ip/I=Rseal/(R0+Rseal).此时Ip可作为在IV转换器(点线）内的高阻抗反馈电阻（Rf）的电压降而被检测出。实际上这时场效应管运算放大器A1的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在第二级场效应管运算放大器A2时被减掉。,Rseal,Ip,I,Ip,Rf,R0,(二)膜片钳电极的制备,1.标本制备根据研究目的的不同，可采用不同的细胞组织，如心肌细胞、平滑肌细胞、肿瘤细胞等，现在几乎可对各种细胞进行膜片钳的研究。对所采用的细胞，必须满足实验要求，一般多采用酶解分离法，也可采用细胞培养法；另外，由于与分子生物学技术的结合，现在也运用分子克隆技术表达不同的离子通道，如利用

9、非洲爪蟾卵母细胞表达外源性基因等。,2.电极制备合格的膜片微电极是成功封接细胞膜的基本条件。要成功的封接细胞膜需要两方面的因素保证，一是设法造成干净的细胞膜表面，二是制成合格的电极。首先要选择适当的玻璃毛细管，其材料可使用软质玻璃（苏打玻璃、电石玻璃）或硬质玻璃（硼硅玻璃、铝硅玻璃、石英玻璃）。软玻璃电极常用于作全细胞记录，硬质玻璃因导电率低、噪声小而常用于离子单通道记录。,电极玻璃,3.电极在实验前要灌注电极液，由于电极尖端较细，因此在充灌前，电极内液要用0.2 m的滤膜进行过滤。一般电极充灌可分灌尖(tipfilling)和后充(backfilling)两步。灌尖时将电极尖端浸入内液中5s

10、即可，由于毛细作用溶液会进入电极最尖端处，然后从电极后端用细小的聚丙烯注射管插至尖端附近将溶液充至1/4长度，用手指轻轻弹除尖端残留的气泡即可。灌注后的电极电阻一般为25M，而全细胞记录则最好在23M。4.进行实验，记录和分析数据准备工作就绪后即可进行实验操作，数据记录和分析,膜片钳实验技术的新发展,传统膜片钳技术主要优缺点总结,膜片钳实验技术的新发展,目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术（Conventional patch clamp technique）发展到全自动膜片钳技术（Automated patch clamp technique）。,传统膜片钳技术每次只能记录一个细胞（或一对细胞）

11、，对实验人员来说是一项耗时耗力的工作，它不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选，也不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题，它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且从找细胞、形成封接、破膜等整个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。这两个优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！,膜片钳实验技术的新发展,1.Flip-Tip翻转技术：将一定密度的细胞悬液灌注在玻璃电极中，下降到电极尖端的单个细胞通过在电极外施加负压可以与玻璃电极尖端形成稳定的高阻封接，自动判断封接形成是否良好并自动破膜形成全细胞模式。随后,药物化合物等可以

12、被自动应用到管内进行全细胞模式实验。这种方式形成的膜片钳完全排除显微镜和显微操作,从而革命性的实现膜片钳技术的全自动化。它的显著特点是仍然采用玻璃毛坯作为电极。,2.SealChip技术：完全摒弃了玻璃电极，而是采用SealChip平面电极芯片，一定密度的细胞悬液灌注在芯片上面，随机下降到芯片上约1-2m的孔上并在自动负压的吸引下形成高阻封接，打破孔下面的细胞膜形成全细胞记录模式。,3.Population Patch Clamp（PPC）技术：同SealChip技术一样，完全摒弃了玻璃电极，而是采用PatchPlate平面电极芯片。该芯片含有多个小室，每个小室中含有很多1-2m的封接孔。在记

13、录时，每个小室中封接成功的细胞数目较多，获得的记录是这些细胞通道电流的平均值。,总而言之,全自动膜片钳技术具有如下的优点:效率高,是传统膜片钳效率的20300倍;不需要专业电生理人员,简单易用,所有的操作可以在电脑软件控制的界面下完成,无须显微防震系统;大部分仪器的封接质量在1G以上;部分仪器同时适用于研究配体门控通道和电压门控通道;主要应用于药物药理和毒理测试;在药物微量加样设计方面表现优秀;仪器主要工作方式为全细胞膜片钳方式。缺点:仪器仅适用于悬浮细胞实验。无疑地,随着基因组测序的完成和蛋白质组学的兴起,离子通道在未来的细胞与药物方面研究将会变得越来越重要。与此同时,作为离子通道研究的最佳

14、伴侣-全自动膜片钳,由于其独特的优点也必定在这一领域大展身手。,3离子通道,3.1 重要的生理功能细胞生物电现象的基础参与维持细胞正常形态细胞兴奋-收缩偶联和兴奋-分泌偶联细胞跨膜信号转导,3.1 重要的生理功能,细胞生物电现象的基础静息电位的形成,细胞生物电现象的基础动作电位的形成,参与维持细胞正常形态,细胞兴奋-收缩偶联,细胞兴奋-分泌-兴奋偶联,细胞跨膜信号转导,3.2离子通道分类,在1902年，Bernstein创造性地将Nernst的理论应用到生物膜上，提出了“膜学说”。他认为在静息状态下，细胞膜只对钾离子具有通透性，即细胞静息电位的钾离子学说；而当细胞兴奋的瞬间，膜的破裂使其丧失了

15、选择通透性，所有的离子都可以自由通过。Hodgkin、Huxley、Katz等人在20世纪3050年代做出了开创性研究。他们基于电压钳技术，提出并验证了所谓的HodgkinHuxley方程，数学模拟出和真实状况相符合的神经冲动的传导，由此建立了细胞动作电位的钠离子学说。离子通道的近代观念也由此产生。,3.3离子通道研究理论,3.4离子通道研究技术,微电极电压钳-电流钳技术传统膜片钳技术,Erwin Neher(1944-),Kenneth Cole(1900-1984),3.平板膜片钳技术（膜片钳技术新趋势的关键）,原创技术专利：,表2.膜片钳技术的历史角色,3.5传统膜片钳设备的组成,电学部

16、分 信号放大器 数据采集卡 PC 周边设备控制器等,光学部分：荧光显微镜 CCD照相机 监视器 激光器等,机械部分 防震台，气压泵或气瓶 高精密微电极操作器 灌流操作器 显微镜移动平台或可移动载物台,辅助部分：信号屏蔽罩 微电极拉制仪 药物灌流设备 温度控制器,3.6 全自动膜片钳设备的组成,工作站,平板芯片,+,即：,德国Nanion公司Patchliner,德国Nanion公司Syncropatch 96,美国MolecularDevices公司Ionworks,3.7不同膜片钳技术的比较,1 记录模式,传统膜片钳,平板膜片钳,传统膜片钳,高信息量：通道功能的各项指标、结合其他实验记录高灵

17、敏度：pA级、单通道水平适用范围广：不受样本种类限制操作过程复杂，对实验者要求高实验数据量低，难以应用于药物筛选,全自动膜片钳,操作自动化，简单培训即可使用高效率、高通量实现某些传统膜片钳不具有的功能，例如全细胞模式内液灌流。保持传统膜片钳高信息量和高灵敏度方面程度不一，样本兼容性不一,2 各自的优缺点,离子通道研究,通道蛋白分离、通道重建和基因重组技术 利用与通道特异结合的毒剂标记，可把通道蛋白质从膜上分离下来，经过纯化，可以测定各亚单位多肽的分子量。然后，把它们加入人工膜，可重新恢复通道功能。用于确定蛋白质氨基酸序列的基因重组技术的程序是：从细胞中分离出含有与该种通道蛋白相关的mRNA，置入某种细胞(如大肠杆菌)，经逆转录得到cDNA。用限制性内切酶将cDNA切割成特定片段，再用核酸杂交方法钓出特定的DNA并克隆化。通过测定阳性克隆DNA的核苷酸顺序，推断出相应的蛋白质氨基酸序列。,