细胞体外培养的基本方法和过程.ppt

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1、体外培养的原理与技术薛庆善 主编,广西医科大学组胚教研室何少健,电话：；0771-5358577(办),课 程 安 排 及 进 度,实验课时间：从第14周开始实验课地点：104馆三楼东边,注意事项：1.网上没有名字的 同学请不要填报实 验课名单。2.现在不能确定 自己时间的同学 不要填报，可以 下次上课时再报。3.一旦填报就不能 再更改时间。,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,二、体外培养的基本方法和过程,植块（explant）：从动物体

2、内取出，用于培养的小块组织一般称为外植块或简称植块。分离（散）细胞isolated（dissociated）cell：由组织块分散后制成的单个细胞一般称之。细胞悬液（cell suspension）：单个细胞分散存在于培养液或者其它平衡盐溶液、缓冲溶液中，就称之。,几个名词和概念：,当培养物的总体积不断扩大，培养过程持续到一定的时候，原先的培养器皿已不能满足培养物的空间要求，这时就需要将培养物分成若干小的部分，继续培养。因此，按照培养过程中培养物是否需要被分割后再培养，而将体外培养分为原代培养或称初代培养（primary culture）和继代培养（secondary culture)或称再培

3、养（subculture）两大类。,二、体外培养的基本方法和过程,几个名词和概念：,（二）继代培养,（三）体外培养的基本方法和技术,（四）培养物的冻存与复苏,（五）培养物的污染,（一）原代培养,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,原代培养，通俗地讲，就是第一次培养。它是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。原代培养的概念包含以下几方面含义：原代培养的实质就是初次培养，即培养物一经接种到培养器皿中就不再分割，任其生长繁殖而不更换培养物的生长器皿；原代培养中的“代”并不是指细胞的“代”数，原代培

4、养物中的细胞在接种之后并不一定没有分裂增殖。相反，在原代培养过程中，培养物中的细胞也可能经历多次的细胞分裂活动而产生多个子代细胞；,原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿，像盖玻片培养法和悬滴培养法，即便在换液过程中更换培养器皿，但不更换培养组织细胞所附着的生长基质盖片，仍属于原代培养；植块培养不一定都是原代培养，植块培养有时候在培养物增长到一定程度后，也需要分割培养物为较小的部分再培养。,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,、取材及培养材料的制备,、分离（散）细胞的方法,、接种与培养过程,、更换培养液,二、体外培养的基

5、本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,（1）准备工作：,（2）制备基本步骤（技术路线）：,主要是取材器具、用品的灭菌以及实验者、实验动物的清洁与消毒。,、取材及培养材料的制备：,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,大块组织,洗去血污 剔除多余成分,切成约1mm3大小的植块植块培养,将所取组织剪碎 蛋白酶溶液消化 机械方法吹打组织块 不锈钢网筛过滤 过滤液离心 用培养液悬浮成细胞悬液 计数并调节细胞密度 培养分离的细胞,二、体外培养的基本方法和过程,（2）基本步骤（技术路线）：,（一）原代培养（primary culture）

6、,、取材及培养材料的制备：,二、体外培养的基本方法和过程,关于取材：,（1)取材要准确：取材是体外培养工作的开端。如果在这最初的实验过程中没有取到合格、理想的实验材料，整个体外培养过程就很难达到预期的目的。(2)关于取材及制备培养材料的步骤：就动物不同组织的取材而言，取材的步骤大同小异。但在具体操作过程中，还需要根据具体的实验情况做一些调整。,（一）原代培养（primary culture）,、取材及培养材料的制备,、分离（散）细胞的方法,、接种与培养过程,、更换培养液,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,（1）机械解离细胞法：1）吸管吹打法-2）过

7、筛法-（2）酶学解离细胞法：1）胰蛋白酶离解细胞法-2）胶原酶离解细胞法-（3）螯合剂解离细胞法：常用螯合剂：乙二胺四乙酸钠（EDTA-Na）、柠檬酸钠、枸橼酸钠。,二、体外培养的基本方法和过程,、分离（散）细胞的方法：,（一）原代培养（primary culture）,、取材及培养材料的制备,、分离（散）细胞的方法,、接种与培养过程,、更换培养液,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法和过程,接种（seeding）也称种植(plating)或体外移植(explantation),实际上就是将取材并切割好的组织块

8、（植块）或者分离好的细胞悬液加到培养器皿内的过程。如果将准备好的植块（包括器官型植块）接种并进行培养，就称为植块培养。体外移植的称谓较多用于植块培养的情况。如果将所制备的细胞悬液用于种植和培养，就称为分离（散）细胞培养。,（一）原代培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法和过程,分离（散）细胞培养的细胞如果属于贴壁依赖型细胞，在培养瓶皿中必须黏附于一定的生长基质表面才能生长，这样的细胞一般只能在培养瓶皿表面长满一层，当培养物长满培养器皿的表面时即会因为接触抑制而停止生长，这种培养方式就称为单层细胞培养（single-layer cell culture)

9、。如果所培养的细胞没有贴壁依赖性，在悬浮状态下即可以生长和繁殖，这样的培养方式就称为悬浮（细胞）培养（suspension culture）。,（一）原代培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法和过程,（1）植块培养：植块培养是比较简单的培养方法，其技术要点就是将从动物体内所取得的组织切割成一定大小的植块，再将植块接种到培养瓶皿内，加入培养液，然后将培养瓶皿送入培养箱中进行培养。植块培养的目的主要有两个，其一是观察植块的组织学生长行为，其二是通过植块培养，让构成植块的细胞从植块内迁移出来并在植块外分裂增殖，然后将植块去除，从而得到细胞培养物。,（一）原代

10、培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法和过程,（2）分离（散）细胞培养：相对于植块培养法，分离（散）细胞培养的最大优点是：解除了植块内细胞之间的“组织关系”，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。借助分离（散）细胞培养法，还可以分离(isolate)或纯化某一类型的细胞，从而实现对单一细胞类型（monotypic cell culture）进行细胞生物学研究。动物组织的大多数细胞类型都属于贴壁（锚定）依赖型细胞（anchorage-dependent cell)。,（一）原代培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法

11、和过程,（3）生长基质：生长基质（growth substratum）泛指培养物附着的各种介质，狭义特指在塑料或玻璃培养器皿表面上涂布（包被）的一层能够促进培养物黏附、贴壁与铺展的生物活性物质。一般来说，国际上一些著名厂商生产的塑料或玻璃培养器皿，其使用的材质能够适宜大多数种类的动物细胞体外生长。只有少数黏附和贴壁能力较差的细胞，需给予提供包被有特殊生长基质物质的生长表面。,（一）原代培养（primary culture）,、接种与培养过程,二、体外培养的基本方法和过程,（4）悬浮细胞培养（suspension cell culture）对于有些细胞来说，其生长不需要黏附在某一固相表面便能分裂

12、增殖。例如，某些白血病细胞、某些腹水瘤细胞等。体外培养这种细胞时，可以通过对培养液以及其中的细胞进行不断搅拌，或对培养器皿进行振荡、快速旋转而维持细胞的悬浮状态。也有一些细胞无须搅拌或用摇床摇动，只要在培养器皿表面涂布一层不利于细胞粘附的硅脂即可维持悬浮状态。这种培养方法就称为悬浮细胞培养。,（一）原代培养（primary culture）,、取材及培养材料的制备,、分离（散）细胞的方法,、接种与培养过程,、更换培养液,二、体外培养的基本方法和过程,（一）原代培养（primary culture）,、更换培养液,二、体外培养的基本方法和过程,随着培养的进程，营养物被消耗，细胞的代谢产物愈来愈多

13、，尤其是细胞呼吸反应，释放出的CO2及其它酸性代谢产物（如乳酸和丙酮酸）越来越多，培养液的pH值越来越低，培养液的颜色越来越黄。根据培养液的颜色变化确定换液的间隔时间是很有实际意义的。营养物质消耗的快慢还取决于所接种的细胞数量。随着培养过程的继续，细胞会分裂增生，数量增加，换液的时间间隔就可能越来越短。,（一）原代培养（primary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,5、原代细胞培养方法的注意事项,（1）关于培养液：1)培养基的选择：培养某一种细胞，到底选用哪一种培养基，需要根据细胞的生长情况摸索确定。2）添加物：选择好培养基类型以后，还要摸索需要补加的成分及其添加量。3)培养

14、液的酸碱度：普通动物细胞一般适宜的pH范围为7.27.4当pH值低于6.8时，会对细胞的生长产生抑制作用。4)换液：换液时，如果细胞密度很低或者细胞的生长较为缓慢，可以不完全更换培养液，只吸出一半的旧培养液，补加相同体积的新培养液即可。培养液最好经事先预温至370C。,（一）原代培养（primary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,5、原代细胞培养方法的注意事项,（2）关于培养空间：培养空间是指培养物生存的空间，包括液相环境与气相环境两方面。调整培养空间的主要目的是改变对培养物的供氧量。一般来说，培养液与液面上的空间二者之间的体积比例以1：10为宜。加入的培养液液面高度最好维持

15、在25mm的范围。,（一）原代培养（primary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,5、原代细胞培养方法的注意事项,（3）其它方面：必须根据不同细胞生命力的不同以及对环境转变适应能力的不同，选择适宜的取材、分散、种植方法和选用适当的培养条件。除了所培养细胞自身的活力外，原代培养不成功最大的可能性有两点：其一是在对组织分散并分离细胞的过程中严重损伤了细胞，其二是给细胞提供的体外生长环境，尤其是生长基质与培养液条件不合适。,（一）原代培养（primary culture）,（二）继代培养,（三）体外培养的基本方法和技术,（四）培养物的冻存与复苏,（五）培养物的污染,（一）原代培养,

16、二、体外培养的基本方法和过程,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。传代培养的实质就是分割后再次培养。只要是将培养物从一个培养器皿转移到另一个器皿之内继续培养就算传代。即便是按“一传一”的比例进行传代。,1、原代培养物需要传代的指标2、传代的过程3、传代培养的注意事项,二、体外培养的基本方法和过程,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,（1）植块培养物与器官培养物：植块

17、培养物生长一定时间之后，从植块内长出（outgrowing）的细胞会越来越多，迁移出来的细胞也会不断分裂繁殖，逐渐长满所附着的生长基质表面，细胞之间逐渐发生接触性抑制现象。若不将原代培养物分割再进行培养，植块培养物可能会停止生长。,1、原代培养物需要传代的指标,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,（2）分离（散）细胞培养物：对于贴壁依赖型细胞来讲，随着培养时间的延长，细胞分裂增殖，数量愈来愈大，逐渐会在培养瓶皿的底壁形成一完整的细胞层，细胞之间因接触性抑制作用而停止生长，此时便需要进行传代。判断分离（散）细胞培养物是否需要传代的主要指标就是观察培

18、养物是否已基本长满培养瓶皿的底壁。,1、原代培养物需要传代的指标,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,（3）悬浮培养物：悬浮培养细胞之间虽然不容易发生接触性抑制现象，但随着培养液中细胞数量的增加，细胞的生存空间会越来越小，营养供应愈趋紧张，代谢产物积聚，培养环境逐渐不适应细胞的生长，因而需要传代。,1、原代培养物需要传代的指标,（二）继代培养（secondary culture）,1、原代培养物需要传代的指标2、传代的过程3、传代培养的注意事项,二、体外培养的基本方法和过程,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本

19、方法和过程,2、传代的过程,（1）分离（散）细胞培养物：（贴壁依赖型细胞）,1）弃去原培养液（吸出或倾倒）；2）漂洗：12次，3）离解细胞：4）终止消化：5）吹打分离细胞：6）离心：7）重新悬浮、计数：8）分装：9）送培养箱继续培养。,（二）继代培养（secondary culture）,（2）悬浮培养物：无需分割培养物。,1）离心：2）重新悬浮、计数：3）分装：4）送培养箱继续培养。,二、体外培养的基本方法和过程,2、传代的过程,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,2、传代的过程,（3）植块培养物：,对这种培养物，仅在少数情况下再培养。由于它们

20、一般是种植在生长基质盖玻片上，再培养时一般不更换生长基质盖玻片，只是将培养物分割并舍弃部分培养物，而将剩余的培养物继续培养,（二）继代培养（secondary culture）,1、原代培养物需要传代的指标2、传代的过程3、传代培养的注意事项,二、体外培养的基本方法和过程,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,3、传代培养的注意事项,传代培养首先必须注意的事项：根据不同细胞的承受能力；选择合适的时间；采用适当的方法。,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,3、传代培养的注意事项,（1）传代的时机与再培养

21、的细胞密度：不要急于传代是对大多数生命力较为脆弱的细胞体外培养的上策。除非需要利用传代实现其它的目的，如通过传代对培养物中的混合细胞进行分离。由于在体时细胞之间的相互作用有利于细胞的生存和生命活动，因而在进行体外分离细胞培养时尽量给细胞提供相互作用的条件。一个重要的方法就是增大接种的细胞密度，使培养的细胞尽快发生相互作用。,（二）继代培养（secondary culture）,二、体外培养的基本方法和过程,3、传代培养的注意事项,（2）传代数或代数与培养物的生长：传代数或代数（passage number）是指对培养物传代的次数。用它可以相对地衡量某一培养物的培养年龄（culture age）

22、。经过一次传代，细胞的生长环境就发生一次大的变化。体外生长的细胞若处于“动荡”的生活环境中，其生物学性状往往容易发生改变，尤其是细胞的遗传特性可能会发生改变。应该认识到，传代对细胞生长和性状是有影响的，在必要性不强的情况下，少传代为上。,（二）继代培养（secondary culture）,（二）继代培养,（三）体外培养的基本方法和技术,（四）培养物的冻存与复苏,（五）培养物的污染,（一）原代培养,二、体外培养的基本方法和过程,二、体外培养的基本方法和过程,（三）体外培养的基本方法和技术,这里要介绍的是，体外培养这门技术从创立以来所发展起来的、若干种被普遍运用的、具有代表性的基本方法和技术。这

23、些基本的方法和技术有的还在使用，有的则已不常使用，代之以一些改良的方法和技术。,二、体外培养的基本方法和过程,（三）体外培养的基本方法和技术,1、悬滴培养法2、培养瓶培养法3、盖玻片培养法4、旋转管培养法5、灌注小室培养法6、培养板培养法7、二倍体细胞培养法8、克隆培养法9、中空纤维细胞培养技术10、微载体细胞培养法11、微囊培养技术,2、培养瓶（culture flask）培养法,凡是可以用于培养生物结构成分的瓶子都可以叫做培养瓶。早期的培养瓶主要是玻璃培养瓶，如今国外主要用一次性使用的塑料培养瓶。,卡氏瓶（carlsbergs flask）北京瓶 塑料培养瓶,所谓培养瓶培养法，就是将拟培养

24、对象直接接种在培养瓶内，再放入培养箱进行培养的方法。这种培养法只是强调所用的培养器皿是培养瓶而已。,卡氏瓶,北京瓶,经典的培养瓶,6、培养板培养法,培养板培养法过去曾被称为微量培养法（microculture）：是现代体外培养技术中最为普遍应用的常规培养方法之一。它是将所培养的细胞接种在培养板的孔内，然后在CO2培养箱中进行培养的一种培养方法。,培养板的应用使得细胞培养技术规范化、标准化，使得细胞培养可以微量培养的方式进行，使得科研工作者能够对培养物进行规范的、定量的组间比较。培养板一般都是一次性使用的培养器皿，有极为规范的商品供应。,8、克隆培养法（cloning culture techn

25、ique）,克隆（clone）一词既有名词意义又有动词含义。作名词讲时，意指由同一个祖细胞分裂增生而来的一个子细胞群，体外培养技术中常用的细胞克隆（cell clone或colony）即为此意。作动词解时，克隆一词主要指从同一个祖细胞经分裂增殖而产生一个子细胞群的过程，体外培养技术中的细胞克隆（cell cloning）就是这个意思。,克隆培养法也可以称作单细胞分离培养法（single cell culture），就是将从细胞悬液中获得的单个细胞用于培养，使之分裂增殖而产生一个细胞群的培养方法。,克隆培养法最基本的要求是拟用于培养并分裂增殖的祖细胞必须是一个细胞，如此才能获得具有同一祖先的子细

26、胞群。,理论上讲，各种生物体细胞都可以进行克隆培养，但由于细胞在体外培养时生长繁殖的环境、生命力等方面均不如在体时的情况。所以，能够进行克隆培养的细胞一般只是一些细胞活力强、增殖能力强、对体外生长环境适应性强的细胞，如肿瘤细胞和转化（无限）细胞系、（胚胎）干细胞以及微生物细胞等。这些细胞种类即便是单个细胞被置于体外培养环境，也可以逐渐适应培养环境并行分裂增殖，从而形成一群子细胞。,8、克隆培养法（cloning culture technique）,实验课时间：从第14周开始实验课地点：104馆三楼东边,注意事项：1.网上没有名字的 同学请不要填报实 验课名单。2.现在不能确定 自己时间的同学

27、 不要填报，可以 下次上课时再报。3.一旦填报就不能 再更改时间。,（二）继代培养,（三）体外培养的基本方法和技术,（四）培养物的冻存与复苏,（五）培养物的污染,（一）原代培养,二、体外培养的基本方法和过程,（四）培养物的冻存与复苏,二、体外培养的基本方法和过程,在体外培养工作中，为了保种和长期保存培养物的活性，常须将培养物进行冷冻保存，并在需要的时候重新复苏和培养。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,冷冻保存（cryopreservation）：就是将体外培养物悬 浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的 冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70 的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的

28、过程。复苏（thawing）：就是以一定的复温速率将冻存的培养物 恢复到常温的过程。,细胞内的冰晶损伤（intracellular ice-damage）：是指因细胞内部结冰而致的细胞损伤。,纯水（细胞悬浮其中）,低于零度,结冰,细胞内外的水分都会结冰,冰晶造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡,、培养物的冷冻保存与复苏原理,溶质损伤（solute damage）或称溶液损伤（solution damage）是指因保存细胞的溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤。,溶液（细胞悬浮其中）,温度下降,细胞外的水分先结冰,在复温时，大量水分就会渗入细胞内，造成细胞死亡,未结冰的溶液中电解质浓度升高,细胞在高

29、溶质的溶液中时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便会发生渗漏。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,在溶液中加入冷冻保护剂(cryoprotectant)时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成，并且通过其摩尔浓度，降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。在复苏时，一般以很快的速度升温，12 min内恢复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会暴露在高浓度溶质的溶液中过长时间，从而不会产生冰晶损伤和溶质损伤，冻存的细胞经复苏后仍保持其正常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还与冷冻

30、速率、冷冻温度和复温速率有关。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻速率,细胞在冷冻过程中会发生如下生理变化：*当细胞被冷至-5左右时，因溶液中加有冷冻保护剂而降低了溶液的冰点，细胞内外溶液仍未结冰；*当细胞被冷至-5-15之间时，细胞外溶液先出现结冰而细胞内仍保持未结冰状态。细胞内未结冰的水分子会比细胞外部分结冰溶液中的水分子具有更高的化学能，其结果是：细胞内水分为了和细胞外水分保持化学能的平衡，会向细胞外流动。,是指降温的速度。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况就会不同：（1）冷冻速度慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，细胞内溶质浓度增高，细

31、胞内不发生结冰；（2）冷冻速度快，细胞内水分没有足够的时间外渗，结果随着温度的下降而发生细胞内结冰；（3）冷冻速度非常快（即超快速冷冻），则细胞内形成的冰晶非常小或不结冰而呈玻璃状凝固（玻璃化冷冻）。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻速率,超快速玻璃化冷冻：是细胞存活最理想的冷冻方法。因为细胞内外呈玻璃化凝固，无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中暴露时间过长而受损。,不同细胞的最适冷冻速率不同。所以，在对一种细胞进行冷冻保存之前，首先要测定其最适冷冻速率，以保证获得最高冷冻存活率。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻速率,（）冷冻保存

32、温度,是指能长久保存细胞的超低温度。,在超低温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，经过长期保存在复苏后仍能保持正常的结构和功能。,液氮温度（-196）是目前最佳冷冻保存温度。在-196时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能保持完好。,如果冷冻过程得当，一般生物样品在-196均可保存十年以上。应用-70-80条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）复温速率,是指在细胞复苏时温度升高的速度。,复温速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说复温速度越快越好。复温速度过慢，细胞内会重新形成较大冰晶而造成细胞损伤。

33、最佳的复温速率与最佳的冷冻速率对保证获得最佳的冻存效果同等重要。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻保护剂,是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。,冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类：渗透性冷冻保护剂：可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质。主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酞胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂：不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。主要包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及 羟乙基淀粉等。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,渗透性冷冻保护剂保护细胞的机制是：（1）在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外

34、未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；（2）细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。,甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻保护剂,非渗透性冷冻保护剂的保护机制：(假设有多种)其中有一种可能是，聚乙烯吡咯烷酮等大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；同时，由于其分子量大，使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻

35、保护剂,不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前，有一种趋势，就是联合使用二种以上冷冻保护剂组成保护液。由于许多冷冻保护剂（如nMSO）在低温条件下能保护细胞，但在常温下却对细胞有害，故在细胞复温融解后要及时洗除冷冻保护剂。,、培养物的冷冻保存与复苏原理,（）冷冻保护剂,、冷冻保存的方法,按照冷冻保护液在冻结后是否形成冰晶来划分，冻存方法可分为非玻璃化冻存和玻璃化冻存两种。,非玻璃化冻存：利角各种温级的冰箱分阶段降温至-70-80，然后直接投入液氮进行保存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至-100以下，再直接投入液氮进行保存的方法。以此种方法冻结的细

36、胞悬液或多或少有冰晶形成。,玻璃化冷冻：则是指利用多种高浓度冷冻保护剂组合成的玻璃化冷冻保护液悬浮细胞，直接投入液氮进行保存的方法。以此种方法冻结的细胞悬液无冰晶形成。,、冻存细胞的复苏,（略）,（）非玻璃化冻存细胞的复苏方法（）玻璃化冻存细胞的复苏方法,（略）,（二）继代培养,（三）体外培养的基本方法和技术,（四）培养物的冻存与复苏,（五）培养物的污染,（一）原代培养,二、体外培养的基本方法和过程,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,与培养无关的杂质混入培养系统称为污染（contamination）。广义的污染包括各类微生物的污染、各种培养物间的交叉污染和化学物质的污染。后两种

37、污染比较容易预防，而微生物污染的预防及处理就比较困难，它能直接影响后续研究工作。通常论及的培养物污染多指各类微生物（包括细菌、真菌、支原体、病毒等）对培养细胞的污染。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,判断所培养细胞是否被微生物污染，可以通过以下方法进行确定：目测显微镜观察电镜检查特殊染色鉴定微生物培养试验免疫学分子生物学等,其中，免疫学和分子生物学方法因其快速、敏感和特异性强等优点已得到广泛的关注和应用。,、微生物污染的判断：,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）细菌（bacterial）的污染及其判断,在细菌污染培养细胞的初期，由于受

38、培养系统内的抗生素的作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响，这种情况用倒置相差显微镜观察也不易判断。,*将10 ml左右的细胞悬液以1000 r/min离心5 min，再用无菌的PBS洗涤2次，加入无抗生素的培养液2 ml后，将细胞置于370C培养箱中培养。如果培养物真的受到细菌的污染，就可以在24 h内因细菌的大量繁殖而获得阳性结果。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,*当污染的菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20 min一代的细菌增殖速度，会使培养系统内很快产生大量细菌，后者不仅会消耗培养系统内大量的养分，也能释放出大量的代谢产物。几

39、小时之后，增殖的细菌即可导致培养液外观混浊。酸性代谢产物的累积可使培养液呈现黄绿色。,（）细菌（bacterial）的污染及其判断,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）真菌（eumycete）的污染及其判断,单细胞真菌称为酵母菌（yeast fungus）；多细胞真菌能长出菌丝及孢子并交织成团，称丝状菌（hyphomycete），又称霉菌（mycetes）。,污染了酵母菌的培养物，类似细菌污染。在倒置相差显微镜下可以观察到圆形或卵圆形的酵母菌，开启培养器皿，可闻到像酒或酸的发酵样异味。随着培养液酸度下降，培养液外观呈现黄绿色。,（五）培养物的污染,二、体

40、外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）真菌的污染及其判断,污染了霉菌的培养物，在倒置相差显微镜下能观察到呈丝状或树枝状生长的菌丝。这些菌丝在培养液中可以长成白色的丝状团块，如棉絮状漂浮在培养液中，有的附着在培养器皿或培养物的表面。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）支原体（mycoplasma）的污染及其判断,受支原体污染的培养细胞在显微镜下无特殊的外观表现，培养液也不浑浊。由于对支原体污染难以观察到特殊的外观变化，要在污染的早期发现和处理是相当困难的。,(细胞碎片),（支原体）,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污

41、染的判断：,在细胞培养过程中，如果在显微镜下发现破碎的细胞较多，培养细胞需要频繁改善营养环境才能支持长期传代培养时，应怀疑培养物可能受支原体污染。必要时应借助有关检测技术对培养物进行特殊检测，如DNA荧光染色法、聚合酶链反应方法、免疫学方法以及支原体培养法。,（）支原体（mycoplasma）的污染及其判断,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）病毒（virus）的污染及其判断,细胞培养中的病毒污染来源可以是原宿主体细胞的潜伏性感染，也可以是细胞膜受体或其它理化方法诱导后进入的。,判断培养的细胞是否被病毒污染，其困难之处在于病毒种类的复杂性和相应的宿主细胞

42、的特异性。,感染了病毒的宿主细胞形态学上不一定有显著的特异性的改变，因此仅依据用目测或显微镜观察到的细胞形态学变化来判断是否受病毒的污染是不充分的。应根据不同的病毒选用不同的方法，才足以判断培养的细胞是否存在某种病毒的污染。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,、微生物污染的判断：,（）病毒（virus）的污染及其判断,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,2、污染的预防,一般情况下，由于培养物自身不可能清除污染的微生物，污染严重时即使想尽各种方法也将难以挽回。为了使实验顺利进行，预防污染至为关键，预防措施涉及下述各环节：,（1）培养操作前的准备,（2）培养操作时的注

43、意事项,（3）其它注意事项,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,2、污染的预防,（1）培养操作前的准备：,主要包括如下方面：应当按厂家规定定期清洗或更换超净工作台的空气滤网，请专职人员定期检查超净工作台的空气净化标准；检查培养器皿是否有消毒标志，有条件的实验室应尽可能使用一次性无菌器皿；检查新配制的培养液，取样检菌一周后确认无菌方可应用；操作前提前半小时启动超净工作台及其紫外消毒灯；操作者应清洗双手，如有呼吸道感染应带口罩。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,2、污染的预防,（2）培养操作时的注意事项：,主要包括：在超净工作台面放置的所有培养瓶瓶口不能与超净工作台

44、的风向相逆，不允许用手触及器皿的无菌部分，如瓶口和瓶塞内侧；在安装吸管帽、开启或封闭瓶口操作时要经过火焰烧灼，并在火焰附近进行；吸取培养液、细胞悬液等液体时，应专管专用，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染；,使用培养液前，不宜过早开瓶。开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立。不再使用的培养液应立即封闭瓶口。培养的细胞在处理之前勿过早暴露于空气中；操作时不要交谈、咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染；操作完毕后应整理好工作面，用消毒剂抹拭工作面，关闭超净工作台。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,2、污染的预防,（2）培养操作时的注意事项：,（五）培养物的污染,二、体外培

45、养的基本方法和过程,2、污染的预防,（3）其它注意事项：,主要有：为了确保培养物的安全，应及早冻存有价值的培养物。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行；购入的未灭活血清应采取560C水浴灭活30 min的措施以使血清中的补体和支原体灭活；为了避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素；,对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；定期清洁CO2培养箱，用消毒剂如0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）抹拭以防止和清除真菌的生长。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,2、污染的预防,（3）其它注意事项：,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,3、污染的排除,培养物受污染以及用以排除污染的措施都有可能影响培养细胞的生物学性状。为了保证实验的可靠性和防止污染的进一步蔓延，受到污染的培养细胞宜尽早消毁。,各项排除污染的措施，只适用于挽救一些有价值的细胞系（株）或珍贵的培养物，以及在操作中难于避免污染的培养情况下应用，例如从样品中新分离出的细胞，或估计在操作中有可能被污染的细胞。,（五）培养物的污染,二、体外培养的基本方法和过程,3、污染的排除,抗生素的应用：（略）巨噬细胞共培养的方法：（略）小鼠皮下/腹腔过继培养方法：（略）,OVER,