蛋白质组学级研究生基因组学和蛋白质组学课件3.ppt

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1、蛋白质组学,宁夏医科大学裴秀英,从基因组学到蛋白质组学,基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 vs 生命现象的复杂性和多变性,Genome ProteomeGenomics Proteomics,2023/5/24,2,对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。,Proteomics,2023/5/24,3,The era of omics-based science,2023/5/24,4,第一节 蛋白质组学的概念及其研究内容 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在疾病研究中的应用,主要内容,2023/5/24,5

2、,第一节 蛋白质组学的概念及研究内容,Proteome 由一个基因组genome或一个细胞表达的所有protein。（特定条件下）（proteins expressed by a genome）1994年由澳大利亚学者 Williams和Wilkins提出Proteomics 在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。,一、概念及研究内容,2023/5/24,6,对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。特定在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组是：,2023/5/24,7,蛋白质组学(proteomics),指

3、应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,2023/5/24,8,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,2023/5/24,9,蛋白质组概念的提出标志着生命科学的一个崭新时代蛋白质组时代已经开始，它是继基因组研究之后的又一“大学科”。即以蛋白质组为研究对象，在蛋白质多肽谱和基因产物图谱技术

4、的基础上发展起来的一门科学，是通过对基因表达产物蛋白质进行整体、动态、定量水平上的研究来阐述环境、疾病、药物等对细胞代谢的影响，并分析其主要作用机理、解释基因表达调节的主要方式。,2023/5/24,10,Proteome,追究产生特定蛋白质在的缘由，进而找到应对的策略，人为的控制蛋白质组的表达,阐明已得到的蛋白质又将产生哪些后果。,上游,下游,表达蛋白质组学,功能蛋白质组学,2023/5/24,11,2023/5/24,12,表达蛋白质组学,“完全”蛋白质组学：目的是检测一种细胞类型或一种组织内基因组表达的所有蛋白质;“差异”蛋白质组学:主要是筛选和鉴定不同种类或状态下各样本之间蛋白质组的区

5、别与变化.,在制药和疾病研究中的巨大潜力,2023/5/24,13,蛋白质-蛋白质相互作用,蛋白质相互作用的图谱化（protein-protein interaction mapping)蛋白质相互作用的网络图,2023/5/24,14,蛋白质-其他分子相互作用,基因酶的底物-代谢物-代谢组学激素Ca2+,2023/5/24,15,2023/5/24,16,2023/5/24,17,2023/5/24,18,功能蛋白质组学(functional proteomics)的提出,功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对

6、象的蛋白质组学之间。,2023/5/24,19,从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。,2023/5/24,20,功能蛋白质组学从理论和技术上使以“全部蛋白质”为研究对象的蛋白质组学更具体化，更易于从时、空、量效方面动态、整体、深入地研究生理状态下同一组织细胞在不同发育阶段或同一组织细胞在不同个体间或同一基因组在不同组织细胞间，以及病理情况下同一疾病的不同发展阶段的蛋白质表达模式和功能模式的变化，揭示一些重要的生命现象和一些重大疾病的发生发展规律。,2023/5/24,21,二、蛋白质组学的产生与发展,2023/5

7、/24,22,基因组时代 后基因组时代。研究重点的转移标志:功能基因组学,2023/5/24,23,人类基因组计划取得了巨大成绩，一些低等生物的DNA序列已被阐明，人类DNA序列的框架图已经测定，迄今已测定的表达序列标签（EST）几乎覆盖了人类所有基因,重点已从揭示生命所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究,功能基因组学的主要任务,解析和综合大量的遗传信息，阐明基因遗传信息与人类生命活动之间的联系。,2023/5/24,24,基因的功能是通过其产物mRNA和蛋白质来体现的mRNA水平的基因表达研究取得进展(基因表达系列分析（serial analysis of gene express

8、ion，SAGE）、微阵列（microarray）和DNA芯片（chip）)，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.40.5 蛋白质自身特点(翻译后的加工修饰、转移定位、构象变化、蛋白质与蛋白质及蛋白质与其它生物大分子相互作用等)难以从DNA和mRNA水平得到解答,2023/5/24,25,进 展,各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟：1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）,2023/5/24,26,美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库

9、。NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。,2023/5/24,27,Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。,2023/5/24,28,1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议,2023/5/24,29,我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的

10、蛋白质组学研讨会,2023/5/24,30,2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。,2023/5/24,31,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。,2023/5/24,32,Projects,HLPP-the second initiative,but the

11、first organ of human beings,三、蛋白质体系,单一的蛋白质只具有某种单一的生物学功能机体更多的生物学功能是由蛋白质体系完成的蛋白质体系：多种蛋白质 核酸 脂质 金属离子，小分子蛋白质组：特定条件下，基因组所产生的所有蛋白质的组合。蛋白质组是所有蛋白质体系的组合,2023/5/24,34,（一）一些经典的蛋白质体系,代谢过程均是由蛋白质体系中的许多组分协同实施的。合理思维，利用现有技术，在蛋白质组中寻找更多的蛋白质体系。根据体系中各组分的组合情况，分为：串联式 级联式（cascade）“联合”式,2023/5/24,35,1、串联式的蛋白质体系,代谢过程中常见，多种酶构

12、成的各种酶系 E1 E2 E3 En IABP,2023/5/24,36,2023/5/24,37,2023/5/24,38,特征：其中几个关键步骤的酶通常都能发生变构反应，从而调控了整个体系运行，最终产物对体系中起始反应的抑制是最常见的负反馈调控。,2023/5/24,39,2、级联式蛋白质体系,特点1：体系中的一些酶一般以酶原或复合体形式存在。特点2：前一个活性酶激活后一个酶原；或前一个活性分子影响后一个复合物的解离，释放一个活性的蛋白质组分。特点3：经过每一次级联的激活，就产生一次放大作用。,2023/5/24,40,2023/5/24,41,3、“联合”式的蛋白质体系,蛋白质体系是一些

13、组分（以蛋白质为主）通过一些分子间的作用形成一个整体，而后完成某种较为复杂的功能。,2023/5/24,42,补体激活,2023/5/24,43,二、存在于细胞中的一些蛋白质体系,膜上的蛋白质体系 电子传递系统和ATP合酶 新生肽链和核糖体受体 信号序列识别颗粒（SRP）,2023/5/24,44,细胞质中的蛋白质体系 核糖体 分子伴侣 蛋白酶体 信号转导体系,2023/5/24,45,细胞核内的蛋白质体系 核小体 复制点 转录起始复合物 核糖核蛋白（RNP),2023/5/24,46,细胞外的蛋白质体系 沟通细胞和维护细胞：介导神经细胞信号传递的蛋白质体系 细胞外间质体系,2023/5/24

14、,47,从分子水平上研究细胞中各种细胞器和体系的结构与功能，实际上是在研究蛋白质体系的结构与功能。,2023/5/24,48,第二节 蛋白质组学研究方法概述,2023/5/24,49,Proteomics Analysis,Sample preparationProtein separationProcessing&Image AnalysisProtein IdentificationPTM IdentificationProtein quantification,2023/5/24,50,蛋白质组研究更为复杂和困难：蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。,2023/5/24

15、,51,发展高通量、高灵敏度、高准确性的研究技术平台是现在乃至相当一段时间内蛋白质组学研究中的主要任务。,当前主要任务,2023/5/24,52,一、蛋白质组表达模式的 研究方法,2023/5/24,53,研究蛋白质组的组成成分 支撑技术主要有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学分析。,蛋白质组表达模式（expression profile）：,2023/5/24,54,2023/5/24,55,生物学问题的提出,实验模型的设计,实验组和对照组样品的制备,蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离,图像扫描和初步分析,感兴趣蛋白点的切取,胰酶对脱色后蛋白质的消化,质谱的多肽指纹图、微

16、测序分析,质谱结果的生物信息学分析和比对,新蛋白质的发现,其它实验的进一步验证,蛋白信息的初步获得,蛋白质组研究的基本技术路线,蛋白质样品的制备,双向电泳,图像分析,转印至膜上的蛋白,凝胶中的蛋白,溶液中的蛋白,混合肽,蛋白质质量,N端测序,肽序列质谱数据,肽指纹图,数据搜索,新的或已知蛋白,蛋白转录后修饰的鉴定,（一）蛋白质组研究中的样品制备,通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。,2023/5/24,58,样品预分级的主要方法,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等蛋白

17、质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,2023/5/24,59,样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,2023/5/24,60,组织水平上的蛋白质组样品制备,临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。,2023/5/24,61,激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM),可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,2023/5/24,62,双向电泳分析中的样品制备,制备原则：应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有

18、可重现性。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,可溶性样品,固体组织样品,细胞,不同样品的基本处理方法,样品的分级处理通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。,样品的溶解,是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多

19、肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。,增加样品溶解性的手段,变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中

20、CHAPS和SB3-10最好。还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。,起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使

21、两性电解质的pH值与之相符合。,样品液的准备,标准液：,Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use,Multiple chaotropic agent solution preparation,Multiple surfactant solution preparation,样品中核酸的去除,对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。,亚蛋白质组样品的制备,用超离

22、心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。,特殊样品的制备,低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增

23、加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。,强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。极端分子量的蛋白质：小于8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tri

24、s/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,（二）蛋白质组研究中的样品分离,双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。,2023/5/24,76,原 理,第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦(IEF),再在第一向垂直

25、方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。1975年首先由OFarrell等创立。,2023/5/24,77,等电聚焦电泳,2023/5/24,78,特 点,可分离10100 kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配,2023/5/24,79,第一向IEF电泳,传统OFarrell系统双向电泳的缺陷。Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，Grg等成功地将之应用于双向电泳。,2023/5/24,80,一维固相pH梯度等电聚焦（IEF with IPG）：,IPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH

26、-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。,IPG胶条的重泡胀,泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。不同的加样方法和加样量会导致最终结果的差异：Protean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：20mmol/L DTT 垫片的使用：温

27、度的选择：,蛋白载样量,影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。待研究蛋白的丰度：样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。IPG胶条的pH范围：,IPG胶条的蛋白质大约载样量,IPG IEF 中pH梯度的选择,常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。,预分步收集,细胞浆,细胞核,细胞膜,核糖体及其他特定细胞成份,细胞分泌成份,pH4-12,pH3-10,pH4-7,pH5-8,pH7-10,pH

28、6-11,pH3-6,pH3-4,pH4-5,pH5-6,pH6-7,pH7-8,pH8-9,pH9-10,pH10-11,pH11-12,第一步,第二步,第三步,用窄pH范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白,阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质,亚蛋白质组阵列策略的框架图,3倍,3倍,聚焦时间的优化,理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IPG胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。最佳时间的确定需要根据不

29、同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。,IEF的基本条件,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,voltage,Time,Volt-Hours,Ramp,250,20min,Linear,4000,4000,2hr,10,000V-hr,Linear,Rapid,5 hr,14,000V-hr,7 cm,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,total,total,Stemp 1,Stemp 2,Stemp 3,11 cm,17 cm,250,250,8000,10000,10000,8000,20min,20min,2.5hr,2.5hr,20

30、,000V-hr,40,000V-hr,30,000V-hr,50,000V-hr,5.3 hr,7 hr,Linear,Linear,Linear,Linear,Rapid,Rapid,两维间的平衡,一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平衡15min。如果用TB

31、P代替DTT则只需一步平衡。,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,2023/5/24,90,第二向SDS-PAGE电泳,垂直板电泳 水平超薄胶电泳,2023/5/24,91,二维SDS-PAGE,同普通SDS-PAGE类似。但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分

32、离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,2023/5/24,93,新型非凝胶技术,液相色谱法liquid chromatography，LC毛细管电泳capillary electrophoresis，CE,2023/5/24,94,液质联用技术（LC-MS/MS）,蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。,2023/5/24,95,根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。,多维色谱技术（LC/LC-MS/MS）,多维蛋白质鉴定技术(multidi

33、mensional protein identification technology),2023/5/24,96,聚丙烯酰胺凝胶和转印到膜上的蛋白质的检测,理想显色剂的7S安全（safety）：灵敏（sensitivity）：简单（simplicity）：特异性（specificity）：快速（speed）：稳定（stability）：兼容性（synergy）：,有机染料和银染,考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结

34、果。胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。,负 染,能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。,胶体扩散染料,主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤

35、维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。,有机荧光团染料,包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质

36、可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。,金属螯合染料,这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。,凝胶的图像处理分析和,典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：,图示实验流程,2023/5/24,104,2023/5/24,105,S

37、ample Preparation,Urea,thioureaTriton X-100,NP-40,CHAPS,SB 3-10,ASB 14DTT,DTE,TBP,2023/5/24,106,Sample Preparation,Increasing protein solubility with detergents and surfactants,2M thiourea+7M urea,sulphobetaine reagent(SB-10),Chioce of reducing agent non-charged reducing agent:TBP,TCEP.,硫脲,2023/5/24

38、,107,Sample Preparation,The challenge for 2-D PAGE is the solubilisationand separation of insoluble samples such as membrane-associated protein or those from tissuesthat are highly resistant to denaturation.,2023/5/24,108,Cell culture,Protein extraction,2-DE,Silver staining,Image analysis,Scanning,2

39、023/5/24,109,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）使用含有十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸35分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的二硫键（使二硫键还原）。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS。,垂直板电泳装置,加样,样品迁移方向,电泳过程中分子迁移

40、的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的经SDS处理的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳后的凝胶经考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片,标准蛋白分子量,未知蛋白,在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。,相对迁移率,水平式电泳装置,电泳缓冲液,凝胶,等电聚焦电泳（IEF）利用聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至

41、与它的pI 相一致的pH处。,凝胶中加有两性电解质溶液（pH9-3）,加电场后在凝胶内形成一个稳定pH梯度,加样品，然后继续电泳,凝胶染色表明样品按照各自pI值沿着pH梯度分布,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,高pH,高pH,低pH,低pH,双向电泳 第一向：等电聚焦电泳第二向：SDS-PAGE 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图：水平方向反映出蛋白在pI上的差异，垂直方向反映出它们在分子量上的差别。,第一向电泳：等电聚焦电泳,聚焦后凝胶放置在SDS凝胶上，进行第二向电泳,第二向电泳：SDS-PAGE,分子量大,分子量小,pH9,pH3,pH9,pH

42、3,大肠杆菌全蛋白提取液双向电泳凝胶染色后照片,Protein Detection,Coomassie blue 易操作、可重复性好；灵敏度低、斑点有限 300spot）Silver staining(最常用 最常用)灵敏度高(0.1ng)；可重复性差，线性范围狭窄32P/35S radiolabeling 灵敏度最高(0.1ng)；操作繁琐，周期长Fluorescent dyes 灵敏度接近 sliver，线性范围宽，多种波长；价格昂贵,2023/5/24,122,Silver staining,2023/5/24,123,Fluorescent dyes,2023/5/24,124,Ima

43、ge Analysis,图像捕捉 平板扫描仪（Flat-bed scanner）电荷耦合数码相机CCD(charge coupled device Camera)激光密度仪(Laser densitometers)荧光或磷光成像仪（Fluoro-/Phospho-Imaginers）图像处理与分析(software)背景消减与条纹消除(background reduction/streak removal)斑点探测（detection）、图形匹配（pattern matching）定量（quantitation)数据分析(data analysis)数据库构建(database constru

44、ction),2023/5/24,125,图像捕捉系统示例,2023/5/24,126,2023/5/24,127,2023/5/24,128,2DE Application,分离复杂蛋白质混合物，尤其是细胞或组织蛋白质粗提物的分离；分析了解蛋白质表达情况，构建特定组织或细胞的蛋白质组“参考图谱”；不同生理状态蛋白质组差异比较，为蛋白质的挑选和鉴定提供思路。,2023/5/24,129,2023/5/24,130,二维电泳及其重要性,1、二维电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离 等电聚焦：电荷 SDS凝

45、胶电泳：分子大小,2023/5/24,131,二维电泳及其重要性,1、原位细胞提取与样品处理-二维电泳-质谱的技术路线是典型的一条蛋白质组学研究的技术路线。2、二维电泳是研究蛋白组学的关键技术，是深刻认识蛋白质结构与功能的重要工具。,2023/5/24,132,优点：,高灵敏度高分辨率便于计算机图像分析处理与质谱分析匹配,Problems in 2DE,Reproductivity sample preparing protocol/IEF shift Resolution sample amount loading capacity electrophoresis resolve abili

46、ty stain sensitivity Special proteins low-abundance proteins membrane proteins basic proteinsAutomation,2023/5/24,134,二维电泳方法与问题,重复性差：方法尚未标准化导致的结果是实验室内部、不同实验室之间难以重复难定量,2023/5/24,135,2023/5/24,136,二维电泳的进展,1、二维平板凝胶电泳的进展染色试剂：考马氏亮兰、银染、同位素、荧光等 由染色检测到直接紫外检测 肉眼观察自动扫描2、平板二维柱二维电泳（二维CE）3、平板二维芯片二维电泳4、二维电泳多维电泳,2

47、023/5/24,137,（1）荧光染色,FLA-5000-image:Sypro Ruby stained 2 D-gel,brain proteins,2023/5/24,138,二维电泳荧光检测,2023/5/24,139,（2）紫外荧光检测,Anal.Chem.2003,75,157-159,2023/5/24,140,（3）结果自动分析,2023/5/24,141,由平板二维至柱二维(二维毛细管电泳),1、一维：等电聚焦毛细管电泳2、二维：区带毛细管电泳刘春和等。色谱2003年第5期,2023/5/24,142,微流控芯片电泳,微流控芯片二维电泳,2023/5/24,143,芯片二维

48、电泳：MECKCE,J.Michael Ramsey*,Anal.Chem.2000,72,5244-5249Anal.Chem.2003,75,3758-3764,峰容量达4200,2023/5/24,144,芯片二维电泳：MECKCE,2023/5/24,145,芯片二维电泳：开管电色谱CE,Anal.Chem.2001,73,2669-2674,2023/5/24,146,芯片二维电泳：IEFCE,Thomas W.Kenny，Anal.Chem.2003,75,1180-1187,2023/5/24,147,峰容量达到1300,2023/5/24,148,芯片二维电泳：IEFCE,An

49、al.Chem.2004,76,742-748,2023/5/24,149,峰容量达1700,2023/5/24,150,多维电泳,按等电点、质荷比和分子量分离蛋白质，理论上可分离3万多种蛋白质 与平板二维电泳相比，多维电泳可将灵敏度和精密度提高100倍（LIF检测）,峰容量提高5倍,2023/5/24,151,平板二维电泳与三维电泳比较,2023/5/24,152,2023/5/24,153,展望,1、柱二维电泳发展越来越快，如芯片二维电泳将会起越来越重要的作用；2、二维向多维发展；3、将从定性向定量分析发展。,2023/5/24,154,非凝胶技术,液相色谱（LC）毛细管电泳技术（CE）L

50、C-MS/MSLC/LC-MS/MS,LC-MS/MS与质谱联用，作为2-DE-MS的技术补充，但不能取代2-DE在蛋白质分离中的核心地位。,（三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定,2023/5/24,156,新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法,基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。,Mass Spectrometry,2023/5/24,157,“软电离”的特点,分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。,2023/5/24,15