植物遗传转化体系的建立.ppt

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1、第十三章 植物遗传转化体系建立,第一节 植物基因转化的受体体系 转基因植物是指利用重组DNA技术将外源优良目的基因整合到植物的基因组中，并使其得以表达，从而获得具有新的遗传性状的植物。转基因技术的基础是良好的受体体系，因此，建立了高效稳定的受体体系，才能进行植物转基因的操作和应用。,植物基因转化的受体体系是指将用于基因转化的外植体-利用组织培养途径或其它非组织培养途径，建立高效、稳定并能接受外源基因的整合以及对转化筛选抗生素较敏感的再生系统。良好的基因转化的受体体系的建立是成功实现观赏植物遗传转化的基础，而合适的转化受体体系要有高效稳定的再生能力。,理想的受体材料是：细胞既要能有效地接受外源目

2、的基因，还应由单细胞分化再生植株，减少假阳性植株和嵌合体。目前常用的外植体有原生质体、悬浮细胞、愈伤组织、胚状体、叶圆盘、叶片、茎段、下胚轴、无性胚等。其次，受体材料的特性，包括受体材料的生理状态，受体的再生能力和再生途径，体细胞无性系变异的发生等。,再次，适宜的诱导和筛选条件，如培养基种类和组成，筛选剂种类、浓度，筛选时间等都会影响到转基因细胞的分化和抗性植株再生。最后，观赏植物基因转化的受体体系要有较高的遗传稳定性，要求受体系统在接受外源DNA后不应影响其正常的生长、分裂、发育、分化，并能稳定地将接受的外源DNA遗传给后代，尽量减少变异。,一、直接分化受体体系 是外植体直接分化出不定芽获得

3、再生植株而建立的受体体系。获得再生植株的操作简单，周期短。体细胞无性系变异小，获得的再生植株其遗传性质十分稳定，特别是由茎尖分生组织经过直接分化建立的再生系统其遗传稳定性更佳。但通常由外植体直接分化成芽难度较大，再生频率较低。同时不定芽的再生常常起源于多细胞，容易存在嵌合体。,二、愈伤组织 愈伤组织受体体系是外植体经过脱分化形成愈伤组织再获得再生植株而建立的受体体系。由分生细胞组成，易于接受外源目的DNA，转化效率较高。繁殖系数迅速增加，可以获得大量的转化植株。适合于通过直接分化难以获得再生植株的植物和相应的外植体，特别是单子叶植物和木本植物。愈伤组织通常是由多细胞组成的，易产生嵌合体；同时获

4、得的再生植株无性系变异较大，外源基因整合的稳定性较差。,三、原生质体 在进行植物遗传转化之前要尽可能选取与母本遗传一致的外植体来建立有效的再生体系。原生质体是植物遗传转化中应用最广的、理想的受体材料之一。特点有：去除了细胞壁的阻碍，能够直接高效地接受外源DNA并整合到染色体上。,原生质体生理生化特性几乎一致，便于在相对均匀、稳定的同等条件下实现目的基因的表达、转化、鉴定。原生质体经过培养易于形成基因型一致的细胞系，较易避免嵌合体的产生，性状也易纯化且稳定遗传。受体体系可适合于多种转基因方法。但原生质体的培养技术要求高、过程复杂、周期长，获得再生植株的频率较低；同时原生质体培养形成的细胞无性系变

5、异强烈，再生植株变异频率较高，限制了原生质体作为遗传转化受体的应用。,四、悬浮细胞 基因转化的受体体系的特点是：生长迅速，重复性好，易于接受外源DNA，转化效率较高。悬浮细胞主要是由单细胞、小细胞团组成，可有效克服转基因植株中存在的嵌合体现象。悬浮细胞培养条件易于控制，便于进行转化体的筛选。但建立良好的细胞悬浮系受植物基因型的影响较大，且耗时较长，一般需要36个月时间。同时随着继代培养时间的延长，胚性悬浮细胞的再生能力会逐渐丧失，并导致突变体的产生。,五、胚状体 体细胞胚发生具有数量多、速度快、结构完整、再生率高等优点，同时体细胞胚的产生起源于单细胞，能在突变体育种和基因重组育种中克服嵌合体现

6、象。体细胞胚受体体系的特点是：1.发育成胚状体的胚性细胞具有较强的分裂特性和接受外源目的DNA的能力，是理想的基因转化的感受态细胞，同时这些胚性细胞繁殖量大，同步性好，转化效率高。,2.胚状体的发生是单细胞起源，因此获得的转基因植株嵌合体少。3.胚状体具有两极性，即在发育过程中能同时分化出芽和根，克服了某些植物由不定芽难以生根的缺陷。,4.与植物器官再生方式相比，胚状体发生速度快、数量多、结构完整、再生率高，胚状体个体间的遗传背景一致，不容易产生变异，使获得的转基因植株的遗传稳定性好。5.与周围细胞存在隔离区，和培养物没有维管束联系，容易从培养物上剥离。6.利用胚状体可生产人工种子。,六、生殖

7、细胞受体体系（种质系统）利用植物的生殖细胞如花粉粒、卵细胞等为受体细胞进行基因转化的系统叫生殖细胞受体系统，也称种质系统。目前主要通过两个途径建立生殖细胞受体系统。1、利用植物组织培养技术进行花药培养和花粉培养，通过诱导出胚性细胞或愈伤组织，获得单倍体植株，建立单倍体的基因转化受体体系。2、直接利用花粉和卵细胞受精、发育过程进行遗传转化，如花粉管通道法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。,生殖细胞基因转化受体系统的特点有：生殖细胞再生能力强，接受外源目的基因的能力也强，转化效率高。生殖细胞是单倍体细胞，转化的基因无显隐性影响，能提高外源基因的表达效率，有利于性状的选择。通过加倍后能获得纯合的二倍体。

8、跟传统的育种技术结合，能缩短复杂的育种纯化过程，简化种质创新程序。易于获得稳定遗传的转基因植株。,第二节 植物基因转化的方法一、载体转化方法（一）根癌农杆菌介导转化法 根癌农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段可转移的DNA（T-DNA），农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，而T-DNA插入外源DNA片段并不影响整合。,（二）植物病毒法 植物病毒作为潜在的转化载体，具有易于浸染、拷贝数多和启动外源基因表达能力

9、强的特点，因而引起人们的极大兴趣，其中最有希望的是花椰菜花叶病毒（CaMV），已有实验证明它能进入宿主细胞并得以扩增及传播。,二、DNA理化转移方法 不依赖于农杆菌载体和其他生物媒体，将经过特殊处理的裸露外源DNA直接导入植物细胞，实现基因转化的方法叫DNA直接导入的转化，该转化技术根据原理可分为物理法和化学法2种。物理法是基于诸多物理因素对细胞膜的影响，或通过机械损伤直接将外源DNA导入细胞，；化学法借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞。,第三节 转基因植株再生及检测一、转基因植株再生 植物转基因方法众多，转基因植株的再生方法也各异。,二、转基因植株的检测 经过转基因操作后的外植体通过一段时间的再生、筛选后，将获得抗性植株，但由于转化过程中会出现大量的假转化体，同时T-DNA进入细胞后并没有整合到受体基因组中，而是以游离状态存在。因此遗传转化获得的转化子是不是真正的转基因植株，还需要进行严格的检测与鉴定。,