植物细胞培养及原生质体培养.ppt
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1、第 十 章 植物细胞及原生质体培养,一、植物细胞培养:在一定条件下,通过人工供给营养物质及生长因子,使离体植物细胞生长繁殖的方法。细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。,(一)细胞培养(cell culture)的特性:1.植物细胞较微生物细胞大,具有纤维素细胞壁,抗剪切力差;2.细胞生长速度慢,易受微生物污染,有时需用抗生素;3.细胞生长的中期及对数期,易凝聚为直径达350 um一400 um 的团块,悬浮培养较困难;4.培养时需供氧,培养液粘度大,不能耐受强力通风搅拌;并具有群体效应 5.培养细胞产物滞留于细胞内,且产量较低,培养过程具有结构与功能
2、全能性。,1,(二)植物细胞培养的营养需求及培养基.营养需求:植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂,除水分外,其它营养成分可分为如下几类:(1)无机营养:如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等;(2)维生素:如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等;(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等;(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等;,(5)植物激素:如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸;其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等;(6)氨基酸类:如甘氨酸、谷氨酰胺、天
3、冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等;(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等;(8)其它成分:如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.2.培养基:(1)固体培养基:添加琼脂等(2)液体培养基:不加琼脂等,(三)植物细胞培养技术 实验室中有悬浮培养、固相化培养、单细胞培养(微室培养、平板培养、看护培养、悬滴培养、微滴培养)等多种培养方式。,1.悬浮培养法:植物细胞悬浮培养(cell suspension culture)即植物细胞或小的细胞聚集体在液体
4、培养基中于摇床 上进行悬浮培养,这些细胞和小的聚集体来自愈伤组织,某个器官或组织,甚至幼嫩的植株,通过物理或化学的方法进行分离而获得。,(1)优良的悬浮细胞培养体系必需满足:A.悬浮培养物分散性好,细胞团较小,一般由几十个以下的细胞组成。B.均一性好,细胞形状和细胞团大小大致相同。C.生长迅速,悬浮细胞的量一般23天甚至更短时间便可增加一。,(2)培养过程:将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织,经匀浆器破碎、纱布或不锈钢网过滤,单细胞滤液作为按种材料,接种于液体培养基中振荡培养。(3)悬浮培养特点:培养过程中细胞总数不断增加,一定时间后产量达最高点,生长趋于停止。然后进行移
5、植继代培养,其过程表现出严格可重复周期性变化,细胞增长规律与微生物相同,有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度,通常为0.25 x l0细胞ml 一0.5 x 10细胞m1。,(4)悬浮培养类型:A.成批培养(Batch culture):成批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加,培养基营养的消耗及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。分缓慢转动培养(1-2rpm)、震荡培养(100rpm)、快速转动培养(80-120rp
6、m)和搅拌培养。,B.连续培养(Continuous culture):是用一定容积的非密闭系统进行 细胞培养的方法,在培养过程中不断注入新鲜培养基,而使营养物连续得到补充,细胞生长和增殖连续进行,同时有等体积的培养物排除系统。最大特点是细胞生长速率标准一致,新形成的细胞补偿了被排出的细胞,系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。恒化控制:通过营养液或某一成分 恒浊控制:比浊计测定浑浊度而进行流量控制。,2.固相化培养技术:细胞固定在一定的惰性基质中,如琼脂、海藻酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上,细胞不能运动,但营养液可以在基质中流动。,(1
7、)固相化培养的特点:A.消除剪切力;B.细胞生长缓慢,促进次生代谢过程;C.细胞之间紧密接触,形成梯度,利于产物积累;D.便于操作,不易污染。E.便于产物收集。,(2)固相化培养系统:A.平床培养:生长慢,代谢产物多,但不易放大。B.填充床培养:条件控制困难。C.膜生物反应器:采用一定孔径和选择透性膜来固定营养物,营养物可以通过膜渗透到细胞中。,3.单细胞培养:对单离的细胞进行培养的方法。(1)平板培养法:分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散的细胞,洗涤离心除酶,细胞浓缩物经计数及稀释,接种到加热熔化而
8、刚冷却至35左有的固体培养基中充分混匀,倾入培养皿中,石蜡密封,于25含5CO2空气的培养箱中培养,细胞即可生长成团。,(2)看护培养法:从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞,每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面,而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。,(3)微室培养法:悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。,(四)细胞培养过程:1.择适宜的外植体;2.诱导疏松愈伤组织;3.选择适宜的培养基;4.悬浮培养;5.悬浮细胞的继代与选择;6.悬浮细胞的同步化;7.悬浮愈伤组织形成及植株再生。,水稻细胞悬浮培养及植株再生:1.愈伤组织的诱
9、导:(1)取水稻种子,人工去皮后用70酒精表面消毒2分钟,再用25次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动30分钟。(2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次,按每瓶3粒接入附加2mgL 2,4D、3蔗糖、03酵母提取物的Ms固体培养基中,25黑暗下培养、诱导愈伤组织。(3)3周后,将从胚部长出的愈伤组织切割,并转移到新鲜培养基上继代培养,每2周继代1次。(4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖,2单细胞分离(1)愈伤组织的细胞计数:取1g幼嫩、新鲜的愈伤组织以1:10(wv)加入o1(wv)的果胶酶(溶于培养液或06 mol/L 的甘露醇溶液中,pH35)。25,黑暗下静置1216小时,再用电磁搅拌器低速搅拌
10、几分钟即可获的细胞悬浮液,然后用血球计数板计数。(2)单细胞的机械分离。称取适量的愈伤组织,放入适量液体培养基的三角瓶在120 r分、25,黑暗下悬浮培养。(3)悬浮液过滤:愈伤组织块在液体培养基中连续振荡培养3周后,用大约10 0目的尼龙网过滤,经过滤后可获得95左右的单细胞。(4)单细胞收集。过滤液用150r分离心5分钟钟,收集单细胞及小细胞团。,3.细胞悬浮培养:(1)计算细胞起始密度:离心后将23的上清液例掉,将剩余部分轻轻摇动,使细胞均匀悬浮,取1滴悬浮液滴于血球计数板上,以游离单细胞为基数,计算细胞密度。(2)测定细胞活力。酚藏花红染色法和二醋酸荧光素染色法:先配制o1酚藏花红水溶
11、液,溶剂为培养液,二醋酸荧光素则先用丙酮配成5 mgml贮藏备用,使用时用培养液稀释为0.01%的溶液.将培养物和二醋酸荧光素溶液在载玻片上混合,再用o1酚藏花红水溶液作染料,滴一滴于载玻片上,与上述溶液混合,盖上盖玻片。酚藏花红能将死细胞染成红色,很快可在显微镜下观察,530分钟后改用相差和荧光显微镜,活细胞显示较强的荧光反应。,(3)细胞悬浮培养的诱导:将离心管中近l3的悬浮细胞培养物倒入三角瓶中,并根据所需要的起始密度补加新鲜培养基,悬浮细胞在120转分,25黑暗下培养。并定期计数细胞密度,计录并绘制细胞生长曲线 4细胞团和愈伤组织的再形成及植核再生 大约在悬浮培养2周后,将细胞分裂形成
12、的小愈伤组织团块(直径约1525mm)及时转移到分化培养基上(Ms基本成分,附加03酵母提取物,03水解酪蛋白,10mgL KT04mgL NAA及70蔗糖)。连续光照,空温25。3周后即可分化出试管苗。如果不及时转移,愈伤组织团块很快失去分化能力,转入分化培养基后即停止生长,变褐,死亡。,三七细胞培养工艺:1.工艺流程:,2.工艺过程:(1)培养基 植物愈伤组织诱导及培养所用培养基为Ms培养基,烟酸0.5mg/l,肌醇100 mg/l,甘氨酸2.0mg/l及蔗糖30g/l,pH56pH58。(2)三七种质材料选择与处理 取34年生三七植株粗根,用自来水充分洗净再用70乙醇冲洗表面后切成小块,
13、在70乙醇中浸泡2min再转移至01升汞溶液中浸泡20min然后用无菌水冲洗45次,备用。(3)愈伤组织诱导与培养:将上述无菌三七粗根小块组织接种于含2mg/l的2,4D、0.5mg/l KT 及10椰子乳的MS固体培养基中,于25的培养箱中培养40天,即可形成小的愈伤组织块,然后每隔30天进行一次继代培养。每次继代培养均取一块愈伤组织,如此多次继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。,(4)细胞悬浮培养:培养基为含l mg/l 2,4-D、0.05mg/l KT及l0椰乳的MS培养基pH5.8。l00ml三角瓶的培养基装量为25ml,高压灭菌20min冷却后按1-2g/L干重接种愈伤组织愈伤组织
14、切成干重1mg 小块。于25摇床中以120转分钟振荡培养30天,即得三七悬浮细胞培养物。(5)三七细胞大量培养:培养基与悬浮细胞培养相同。在l0L搅拌反应器中加入培养液,培养液充满系数为0.75一0.80,灭菌后冷却至室温接种已培养2530天的悬浮培养细胞,接种量按干细胞计为12g/L,在2526下,以60转分钟搅拌速度及06vvmo8vvm(vvm为每分钟单位体积培养液中通入空气的体积数)速度通气,并维持pH5.55.8培养30天,收获细胞。(6)细胞收集及干燥:每批细胞培养30天后,离心或过滤收集细胞,用去离子水洗涤3次,每次抽干,然后于30一40低温下真空干燥或冻干,即得三七培养细胞成品
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