植物细胞培养制备代谢产物II.ppt

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1、第7讲 植物细胞代谢产物制备,一 代谢产物,初级代谢产物（Primary metabolites）是通过初级代谢产生的维持细胞生命活动必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类等。在不同种类的细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。初级代谢产物的合成无时无刻都在进行着，任何一种产物的合成发生障碍都会影响细胞正常的生命活动，甚至导致死亡。次级代谢产物（Secondary metabolites）是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。由于次级代谢产物大多具有生物活性，因此是植物代谢产物研究的重点。,本节主要内容：,1.植物细胞培养生产次级代谢产

2、物的技术方法2.植物细胞培养生产次级代谢产物的讨论本节关键问题：影响植物细胞培养生产次级代谢产物的因素及调控方法,二 植物细胞培养生产代谢产物的意义 一个例子：紫杉醇,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005%左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。无法满足市场需求，破坏宝贵资源、不可持续发展。化学合成：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤，总得率仅4-5%。成本高。,有效途径：红豆杉细胞培养制备紫杉醇

3、,1.从树叶获取细胞，利于资源保护（红豆杉属于濒危保护植物）。2.细胞培养不受地理环境影响：地理环境、病虫害和季节等因素的影响，可以保证产物无限、连续、均匀地生产。3.利用生物技术提高目标产物含量，实现大规模培养制备。（1）可以通过进行红豆杉细胞的筛选，获得超过原植株紫杉醇含量的细胞。（2）易于在生物反应器中满足最佳条件，进行大规模、高密度培养。（3）可以进行红豆杉细胞紫杉醇代谢途径研究，利用代谢调控使细胞定向合成有用次生代谢物。,三 植物细胞培养生产次级代谢产物（一）细胞株筛选,细胞系(Cell line)是由原代培养经传代培养纯化，获得的以一种细胞为主的、能在体外长期生存的不均一的细胞群体

4、。细胞株(Cell strain)是指从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株(Substrain)。,细胞株指标,（1）分散性好，适合大规模悬浮培养。（2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。（3）生长速度快，培养周期短，不易染菌。（4）目标产物含量高，容易分离提取。（5）细胞遗传稳定。,适合工业生产用细胞株的一般筛选流程,1.愈伤组织的诱导与培养：选用植物的目标化合物高产部位作为外植体诱导愈伤组织。愈伤组织形成后，进行继代培养。2.单细胞分离：选取生长快速而疏松的愈伤组织，通过固

5、体培养基继代培养，挑选生长快速的细胞。3.细胞无性系的分离：转移到液体培养基中进行悬浮培养，从中选择分散性好、生长速度快的细胞。4.细胞株筛选：检测目标产物含量，从（3）中选择目标产物含量高的细胞株。5.性能评价：进行较大规模培养，考察细胞生长与目标产物合成的稳定性。6.细胞株获得：得到适合工业化生产的细胞株，保种。,要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎,适宜悬浮培养,适宜再生植株,细胞株定向富集驯化,例如：激素自养型细胞株的筛选驯化：将愈伤组织或分离到的细胞接种在不含生长素、分裂素的继代培养基中进行传代培养，挑选生长好的细胞进行反复

6、继代培养驯化，可以获得激素自养型细胞。,（二）次级代谢产物生物合成,莽草酸途径：喹啉类、异喹啉类、吡咯啶类、乌头类、吲哚类、大环类生物碱等。聚酮途径：聚酮类化合物。甲戊二羟酸途径：萜类、甾体。,紫杉醇（双萜类）生物合成4个异戊二烯GGPP19个酶促反应（Bacctin直接前体）、C13侧链合成紫杉醇,植物类黄酮（黄酮、黄酮醇、异黄酮、黄烷酮、黄烷醇、花色素）的生物合成,产物积累与细胞生长关系,a生长偶联型：产物合成发生在细胞生长过程中，到达平台期后合成停止。b中间型：产物合成出现在细胞生长旺盛阶段，在平台期也能合成，但是速度减缓。c非生长偶联型：产物合成出现在细胞生长平台期。,（三）工艺流程,

7、（四）影响次级代谢产物的因素 1.生物因素,（1）细胞株稳定、高产、生长速度快的细胞株是细胞大规模培养生产代谢产物的前提。在进行植物细胞培养生产有价值的代谢产物时必须弄清楚产物的合成部位，也就是应该考虑到不同部位来源细胞的特性。缺乏适合的细胞株是目前许多代谢产物无法利用细胞培养生产的主要限制之一。,（2）细胞凋亡,细胞凋亡（Cell apoptosis），也叫程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD），是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。细胞凋亡是植物细胞培养过程中不可避免的现象，但是可以通过条件改变进行调控来减少细胞凋亡。关键是要保证充足的营养供给

8、以及避免有害代谢产物的积累，这可以通过采用合适的培养工艺来实现。,（3）细胞团,植物细胞容易聚集成团，每个细胞团一般由4-300个细胞组成，大小因植物细胞种类不同具有较大差异，例如：烟草细胞团直径大约在350-1000m，长春花细胞团在40-2000m之间。细胞团的形成影响稳定的悬浮体系的维持，同时造成了培养物的显著异质性，细胞团表面与内部的细胞存在营养吸收和代谢产物分泌的差异。此外，细胞团容易受剪切力影响而破碎，引起培养液粘度增加，致使气体交换与传递受到影响。要保持反应器良好的混合效果。适当大小的细胞团有利于代谢产物积累。,（4）生物合成机制,次级代谢产物的生物合成不同于蛋白质合成，涉及多基

9、因参与（基因簇），机制非常复杂，影响因素非常多。结合目标产物进行生物合成机制研究，揭示代谢途径及诱导合成机制是细胞培养的重要生物学问题，有利于指导建立优化的培养工艺与技术。,2.化学因素,主要通过合适的培养基选择来控制，包括营养盐、前体和调节因子等。（1）营养盐：一方面是保证植物细胞生物量的增长；另外一方面是要保证细胞能合成和积累次级代谢产物。普通的培养基一般仅能满足第一方面的需要，对于第二方面的需求，必须针对具体的培养对象和目的，对培养基进行优化，从而保证最大限度地积聚目标产物。,（2）前体（precursor）,指某一代谢中间体的前一阶段的物质。一般在生物合成反应的中间过程中，某一阶段前的

10、物质，都可以说是该阶段物质的前体物质。缺乏某一种前体时细胞就不能合成某一种代谢物。如果在培养基中加入外源前体将会有助于合成该代谢产物或使其产量增加。,（3）诱导子,狭义诱导子：是指那些能够与细胞发生相互作用，通过细胞内一系列的信号转导过程，作用于与细胞次生代谢相关的基因表达，进而改变细胞次生代谢相关酶的活力，最终使细胞次生代谢水平发生改变的物质。广义诱导子：是指所有能够提高细胞次生代谢相关酶活力，进而提高细胞次生代谢水平的外界因素。温度、光照、紫外线、红外线等都是广义诱导子。从来源上可以分为外源性和内源性诱导子，后者是指在外界信号刺激下细胞合成的物质。外源诱导子：菌丝、微生物机体提取物及微生物

11、产生的多糖、蛋白和脂肪酸等内源性诱导子：来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶、细胞壁碎片、寡聚糖等有机分子。,诱导子促进次生产物积累与其种类和浓度有关诱导子对南方红豆杉细胞培养合成紫杉醇的影响,（4）反馈抑制,植物次级代谢产物在培养系统的积累有时会对目标产物的合成具有反馈抑制。例如：直线式反馈控制（Straight linear feedbackcontro1)：当末端代谢产物达到一定浓度时，就会抑制该代谢途径，通常是抑制第一种酶的活性。可以采用流加/半连续培养、两相培养等工艺技术可以克服。,在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上、下两相，细胞

12、在水相中生长合成次生代谢物质，分泌出来的产物被转移至有机相中。不仅减少了产物的反馈抑制作用，而且实现收获的连续化。例如：（1）在紫草细胞悬浮培养时加入十六烷不仅可以原位提取紫草宁色素，而且可以使产量提高。（2）采用对紫杉醇有高分配系数的十六烷、油酸等进行东北红豆杉细胞两相培养生产紫杉醇，结果好于一般悬浮培养，有机相中紫杉醇含量远高于水相和细胞内紫杉醇。（3）在培养的花菱草细胞中加入一种液体硅胶可使血根碱（sanguinarine）产量大幅度提高。,3.物理因素,主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。（1）光照：光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。光照时间长短、光质、光强等都会对代谢产物

13、合成和积聚产生作用。光对许多酶有诱导或抑制作用。（2）温度：温度会影响酶的活性。细胞的生长速率与培养温度紧密相关。植物细胞培养一般在25左右进行。(3)pH:会影响培养液的渗透压、酸碱度，酶的活性，从而影响细胞代谢。植物细胞液体培养的pH 变化范围在56 之间，最佳的起始pH在5.55.8 之间。如果对培养液pH进行控制，将有利于次级代谢产物的生成。,4.工程技术问题,（1）培养液的流变特性由于植物细胞培养过程中容易结团，同时，不少细胞在培养过程中容易分泌粘多糖等物质，从而使传氧速率降低，影响细胞生长。粘度变化可以由细胞本身或其分泌物等引起。前者包括细胞浓度、年龄、大小、结团情况等。,（2）气

14、体传递与微生物不同，植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对培养过程影响较大。氧的传递与通气速率、培养液混合程度、培养液流变特性、气液界面面积等因素有关；而氧的吸收与反应器类型、细胞生长速率、温度、pH、营养组成、细胞浓度等相关。,（3）搅拌与剪切力,为了加强气液固之间的传质，细胞悬浮培养时需要混合搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆弱，对搅拌的剪切力很敏感。由于剪切力比较大，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐受剪切力的能力不尽相同。烟草细胞和长春花细胞在涡轮搅拌器转速150 rpm和300 rpm时一般还能生长。培养桔叶鸡眼

15、藤细胞时，涡沦搅拌器的转速应低于20 rpm。剪切力影响的克服可以通过低剪切力的生物反应器开发与耐受高剪切力的细胞株筛选来实现。,（4）泡沫与器壁表面粘附性,与微生物细胞培养相比，植物细胞培养过程中产生的气泡更大，而且由于培养液含有蛋白质或粘多糖，粘度大，细胞很容易被包埋在泡沫里，造成非均相培养，也可从营养液中带出来，造成损失或污染。因此，必须对泡沫进行消除。消泡剂、机械去除。,五 提高次级代谢产物产量的途径,培养设备：选择或设计合适的生物反应器。培养工艺：诱导子添加、前体喂养、添加竞争途径代谢产物抑制剂、培养条件（培养基、环境条件）优化与控制、流加培养。培养技术：固定化培养技术、两相培养技术

16、、两步法培养（第1步细胞生长；第2步产物积累）。,四 植物细胞培养生产次级代谢产物的讨论,（一）水母雪莲细胞培养 生产黄酮类化合物,雪莲花,。花园里种不出天山上的雪莲花，不经历磨难我找不到今生的幸福。“艾里郎和赛乃姆”（刀郎）“回到拉萨”（郑钧）：。爬过了唐古拉山遇到了雪莲花。我美丽的雪莲花。“雪莲花”（小舟）：。我思念远方的家乡，天山开满雪莲花。“雪莲花”（罗天蝉）。我采了一朵雪莲花，她是我心中最美丽的花。洁白无瑕。勤劳的人、纯洁的人才配拥有它。“遇上你是我的缘”（央金兰泽）。我爱你，就像山中的雪莲花。,雪莲被视为神物。高山牧民在行路途中遇到雪莲时，被认为有吉祥如意的征兆，并以圣洁之物相待。

17、,雪莲,雪莲，别名雪荷花。雪莲花除产于我国西藏外，在我国的新疆、青海、四川、云南也有分布。3000-5000M海拔以上。早在清代,赵学敏著的中就有以下记载：“大寒之地积雪,春夏不散,雪间有草,类荷花独茎,婷婷雪间可爱”；“其地有天山,冬夏积雪,雪中有莲,以天山峰顶者为第一”。,药用价值,雪莲在医药上应用以有数百年的历史。我国汉族人民多视为治疗风湿关节炎之珍品；维吾尔、哈萨克族则当作妇科良药。印度民间还雪莲花来治疗许多慢性病患者。如胃溃疡、痔疮、支气管炎、心脏病、鼻出血和蛇咬伤等症。在藏医藏药上雪莲花作为药物已有悠久的历史。藏医学文献月王药珍和四部医典上都有记载。,雪莲中黄酮类化合物为主要成分。

18、黄酮类化合物以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素。其中包括黄酮的同分异构体及其氢化的还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物。类黄酮化合物具有多种生物活性，除具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌等方面也有显著效果；是大多数氧自由基的清除剂，因而能提高过氧化物歧化酶(SOD)的活力，减少脂质过氧化物丙二醛(MDA)及氧化低密度脂蛋白(OXLDL)的生成，对治疗冠心病、心绞痛、高血压等有显著效果；对降低舒张压，防治心律失常、心血管病和活血化瘀也起重要作用。,雪莲种类繁多,如水母雪莲、毛头雪莲、绵头雪莲、西藏雪莲等。水母雪莲(Sau

19、ssures medusa)属菊科凤毛菊属雪兔子亚属植物。自然资源有限，生长条件苛刻，很难人工栽培。通过水母雪莲细胞培养生产黄酮有着重要意义。,思考题,Q1.作者是从哪几个方面进行黄酮生产优化的?Q2.黄酮积累和细胞生长属于哪种类型关系?Q3.接种量大小对细胞生长和产物积累的作用是怎样的?为什么?Q4.如何解释聚集体大小于产物积累的关系?Q5.为什么搅拌生物反应器培养的黄酮产量低于摇瓶培养?,生物反应器,1 搅拌桨选择,对比了倾斜式搅拌桨、透平浆，选择前者。,2,3,4,5,6,放大培养产量降低的因素分析,延伸文献讨论:,提高水母雪莲细胞培养生产黄酮的产量的研究,1 高产细胞系筛选,2 培养基

20、优化,采用8种培养基培养水母雪莲细胞,考察细胞生长于黄酮产量，发现MS培养基效果最好,在此基础上优化得到的MG培养基使细胞浓度提高32%,MP培养基使黄酮产量提高70%。发现碳源、氮源、植物激素对细胞生长和黄酮积累影响显著。,3 前体调控,黄酮合成的前体物质前体指某一代谢中间体的前一阶段的物质。,（二）两步法培养生产紫杉醇,两步法培养 第一步：细胞生长阶段 第二步：产物积累阶段,茉莉酸甲酯茉莉酮酸类化合物在植物调节防御基因的信号传导过程中扮演着重要作用。,结果（NOTE:LH:促黄体素）,（三）两相培养生产紫杉醇,五 植物培养生产次级代谢产物存在的主要问题,利用植物细胞大规模悬浮培养为生产有用

21、代谢产物提供了有效途径，但是由于植物细胞容易积聚、细胞分化、剪切力敏感、代谢途径复杂性等因素使工业规模化培养受到限制。迄今为止，只有极少量的植物细胞培养实现了工业化，例如两步法生产紫草宁、迷迭香宁酸、肉桂酰丁二胺等。植物细胞培养在放大过程中往往产量会比实验室摇瓶培养或小型反应器培养下降许多。放大培养还存在许多技术问题。,本节回顾,问题回顾1：植物细胞培养生产有价值代谢产物的优点。问题回顾2：适合大规模培养的植物细胞系特点及筛选步骤。问题回顾3：影响植物细胞培养生产有价值代谢产物的因素有哪些？可以采取哪些方法促进代谢产物积累？,本节补充阅读文献,下节内容：植物组织培养生产次级代谢产物提前查阅并阅读的文献：,