植物种质资源研究方法.ppt

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1、第六章 植物种质资源研究方法,第一节 植物学研究第二节 考古学研究第三节 生态学研究第四节 遗传学研究第五节 细胞学研究第六节 生物数学研究第七节 生物化学研究第八节 分子生物学研究,第一节 植物学研究,植物学研究是植物种质资源最为普遍的研究方法，主要包括：一、资源调查方法二、比较形态学方法三、比较解剖学方法四、孢粉学方法,一、资源调查方法 通过调查了解植物的生长环境、分布状况、生长习性以及基本的植物学性状，从而为种质资源的评价奠定基础，也为其起源、演化和分类提供依据。通过对种质资源不同生态区的地理气候条件、栽培状况等的调查，可以明确某种种质资源的生态适应性和适应范围。主要应用于某一地区或某一

2、类作物的考察活动,二、比较形态学方法植物种质资源研究中最多采用的方法，目前种质资源的多数性状均应用比较形态学研究结果。比较形态学性状：便于观察和获取，一般不需要精密复杂的实验室设施，直尺、放大镜、解剖镜是比较常用的工具；植物形态的变异复杂多样，其变异式样和幅度有利于进行分类、描述和鉴定等工作；研究历史长，积累了丰富的研究资料。,三、比较解剖学方法 对植物的器官或组织进行解剖、观察、比较研究。基于不同植物的器官或组织的解剖结构可能各有自身的特点。解剖学性状主要包括气孔类型的发育及形态解剖、叶片的内部结构、叶脉式样、叶柄微管组织式样等。比较解剖学性状通常与形态学性状密切相关，常作为比较形态学的辅助

3、，为揭示种质资源各类群的区别特征和进化趋向提供证据。,四、孢粉学方法不同植物其孢子和花粉性状各有特点，随着扫描电镜的发展，孢粉学性状在分类研究中应用越来越多，主要包括：花粉萌发孔形态(apertural morphoform)孢粉外壁纹饰和分层式样(exine ornamentation and stratification pattern)花粉聚合(pollen association)花粉核数目(pollen nuclear number),萌发孔形态是研究中讨论最多的花粉性状，主要包括萌发孔的类型、数目、分布与位置等。不同类型植物其花粉粒具有自己的特征，如被子植物花粉粒具有厚的、强耐力、

4、不可渗透的外壁和薄的内壁。孢粉外壁纹饰和分层式样也各具特点，可用于不同植物类群的区分。,第二节 考古学研究,植物考古学是根据古代人类活动遗留下来的实物和历史资料研究植物古代情况。实物和历史资料大多埋藏于地下，考古学家通过发掘它们，研究它们为植物种质资源的起源、驯化、传播和利用情况提供证据。,如：陕西西安半坡遗址中发现的菜籽，经同位素鉴定距今有6000-7000年。广西壮族自治区文物工作队(1978)在发掘一座2 000多年前的古墓时，出土大批植物种子果实，经鉴定，有梅、青杨梅、李、橄榄、乌榄、橘子、红面、罗汉栲、广东含笑、金银花、木瓜、黄瓜、西瓜、花椒、大麻、稻、粟、姜、芋、葫芦等20余种。该

5、发现雄辩地证明了，2 000多年前上述植物已经在广西一带有广泛的栽培。通过考古，纠正了中国不是核桃的原产地的观点,第三节 生态学研究,植物生态学研究是在自然环境或人工控制环境中，研究环境条件、物候期、种质的生长发育习性三者之间的关系，了解植物种质资源生长发育规律、生育周期，及其对温度、光照、水分和矿质营养等的要求。,生态学研究主要包括以下四方面研究内容一、物候期的观察二、气象因子的影响分析三、土壤因子的影响分析四、人类活动的影响分析,一、物候期的观察1、物候期：指随着季节的变化，植物生活史中各种标志性形态出现的时间，是自然界一年一个周期季节变化的明显象征（我国的24个节气72侯）。2、植物物候

6、期鉴定的意义：1）了解该物种在本地区生长发育的动态变化过程，为其进一步的开发和利用提供研究基础，2）有利于品种的合理分布以及制定适宜的栽培制度,美国森林昆虫学家霍普金斯对物候期研究较多，尤其是物候与美国各州冬小麦的播种、收获与发育季节的关系。霍普金斯认为，植物的阶段发育是受当地气候的影响的，而气候又制约于该地区所在的纬度、海陆关系与地形等因素。他从大量的植物物候材料中总结出如下的结论：假如其他因素不变动，在北美洲温带内，每向北移动纬度一度，或是向东移动经度五度，或是上升400英尺，植物的阶段发育在春天和初夏将各延期4天。这就是所谓霍普金斯物候定律。这个所谓物候定律并没有考虑到物候的古今差异。,

7、等候线图：霍普金斯把美国境内同一日子有同一物候（如桃始花、燕子来等等）的地点连成一条线，绘成等候线图。根据等候线图预告各地农作物播种、收获的时期。霍普金斯的物候定律，只是根据美国的物候条件总结出来的，因此它并不适用于世界其它地区。因为物候不但因地而异，而且因时而异，并不像这个物候定律所说的那么简单。,我国向来以农立国，在汉代就有七十二候。一年二十四节气共七十二候。各候均以一个物候现象相应，称候应。其中植物候应有植物的幼芽萌动、开花、结实等；非生物候应有始冻、解冻、雷始发声等。七十二候候应的依次变化，反映了一年中气候变化的一般情况。物候期研究还有许多空白。,二、气象因子的影响分析1、温度 植物体

8、的所有生理活动、代谢反应都必须在一定的温度条件下才能进行。温度对植物的生态作用按照温度变化的规律，可分为节律性变温(一年的四季变化，一天的昼夜变化)和非节律性变温(极端温度)两个方面,特别是极端高低温值、升降温速度和高低温持续时间，对植物都有极大的影响.,地球表面的温度条件随着海拔的升高和维度的北移（北半球）而降低，随海拔的降低和纬度的南移而升高。对植物种质资源产地环境的温度调查，可推测出植物整个生育期对温度的要求 植物需要在一定的温度以上才能开始生长发育，同时植物也需要有一定的温度总量才能完成其生活周期，所以在农业生产中引入了积温的概念.积温：作物生长发育阶段内逐日平均气温的总和,2光照 光

9、照对植物种质资源的起源、分布和生长发育具有决定性的影响.光对植物的生态作用是由光照强度、日照长度、光谱成分的对比关系构成的。光能在地球表面上的分布是不均匀的它们各自有其空间和时间的变化规律，随着不同的地理条件和不同的时间而发生变化，因此不同地区的植物长期生活在具有一定光照条件的生境中，就形成了相应的生物特性和发育规律，在生长发育过程中要求特定的光照条件。,3水分水是植物生存的极重要因子，它通过不同的形态、量和持续时间的变化对植物起作用。形态：三态，即固态、液态和汽态。量：降水量的多少和大气湿度的高低。持续时间：指降水、干旱、淹水等的持续时间。,水分对植物的生长也有最高、最适、最低三基点。低于最

10、低点，植物就会萎蔫，停止生长，甚至枯死；高于最高点，根系缺氧，引起植物的窒息、烂根。只有在水分最适范围内，植物生长才能维持水分平衡，保证植物良好的生长发育。,植被群落学研究结果表明：气象因子是决定植被成带分布的决定性因素，尤以温度和水分更为重要。地球上的气候条件按三个方向改变着，植被也沿着这三个方向交替分布，这三个方向就是纬度、经度与海拔高度。纬度和经度构成植被分布的水平地带性，海拔高度构成植被分布的垂直地带性。,我国植被分布也有明显的地带性，由于受海洋季风影响程度的不同，根据经度的地带性，我国从东到西依次分布着三个大的植被区域：湿润森林区域、半干旱草原区域和干旱荒漠区域。在湿润森林区域，我国

11、从南到北跨越纬度50多度，依次分布着热带雨林区，亚热带常绿阔叶林区，温带落叶阔叶林区和寒温带针叶林区。植物的垂直地带性从属于水平地带性，水平地带性是基础，它决定山地垂直地带性系统。,三、土壤因子的影响分析土壤肥力是土壤物理、化学、生物等性质的综合反映.。提高土壤的肥力，就必须使土壤同时具有良好的物理性质(土壤质地、结构、容量、孔隙度)、化学性质(土壤酸度、有机质、矿质元素)和生物性质(土壤中的动物、植物、微生物)。根据植物对土壤酸碱度的反应将其分为酸性土植物、中性土植物和碱性土植物,根据植物对土壤中过量盐类的适应特点有聚盐性植物：原生质耐受盐份特别强，它们细胞浓度特别高，能吸收高浓度土壤溶液的

12、水分，比如说 盐角草。泌盐性植物：能把吸收进去的多余的盐通过茎、叶、表面密布的盐腺排出来、再被风吹雨淋的洗掉。如红树植物。不透盐的植物：细胞对盐类的通透性非常小，他们几乎不吸收或很少吸收土壤中的盐份，同时也提高了植物吸收土壤中的水的能力，如芦苇等。,盐角草,红树,海榄,四、人类活动的影响分析 人类的活动与生态环境密切相关，人类总是从自然界取得自己生存和发展所必需的物质，对自然资源进行开发利用。通过调查人类活动的具体过程，可以在一定程度上为植物种质资源演化和传播提供相关线索。人类活动对植物赖以生存的生态环境既有积极建设性影响，也存在消极破坏的作用。,过度索取导致许多名贵植物越来越少，如人参、天麻

13、、冬虫夏草、灵芝、苏铁等。农业现代化，工业化导致的大气及水污染、土地退化乃至气候的变化从区域扩展至全球。1、全球变暖：生物群落的分布主要取决于气候，尤其是温度和降雨。如果二氧化碳导致气候持续几十年变暖，一种生物群落会通过改变顶级结构来适应新的气候条件，从而达到新的平衡。如果气候显著变化持续100年以上，就会演替成一种新的生物群落。2、酸雨；3、臭氧层破坏；4、荒漠化,2、酸雨：酸雨是工业高度发展而出现的副产物，由于人类大量使用煤、石油、天然气等化石燃料，燃烧后产生的硫氧化物或氮氧化物，在大气中经过复杂的化学反应，形成硫酸或硝酸气溶胶，或为云、雨、雪、雾捕捉吸收，降到地面成为酸雨。酸雨又被称为“

14、空中死神”，酸雨带来的损失是难以估量的，能破坏森林，使森林中的树木生长缓慢，甚至死亡。目前世界上有14的森林正程度不同地受到酸雨的侵袭。我国是继欧洲和北美洲之后第三大重酸雨区,3、臭氧层破坏：臭氧层可以说是地球的保护层，它主要围绕在地球外部离地面2025公里高度的地方，起到吸收太阳紫外线中对生物有害部分UVB（UVB是紫外线的一段波长，为280315nm）的作用。臭氧层被破坏后，吸收紫外辐射的能力减弱，将给人体健康带来很多不利影响；对植物产生难以确定的影响，,破坏臭氧层的元凶主要是工业制冷剂-氟利昂,4、荒漠化 荒漠化的产生和发展主要是气候变异和人为不合理的因素的影响。目前，世界陆地面积的1/

15、3受到荒漠化危害，约1/5的世界人口受到直接影响。,第四节 遗传学研究,一、杂交分析二、测交分析三、自交分析四、远缘杂交分析,一、杂交分析杂交是指不同基因型配子结合产生杂种的操作过程。杂交是生物遗传变异的重要来源，基因重组是杂交的遗传学基础。杂交分析的作用：1、鉴别物种间的亲缘关系。2、目标性状遗传分析的基础。3、种质创新的有效手段。,二、测交分析测交是指把被测验的个体与隐性纯合的亲本杂交，由于测交时常利用一个原来的隐性纯合亲本进行杂交，故又属于回交。测交目的是验证某种表现型的个体是纯合基因型还是杂合基因型。,三、自交分析 自交一般是指以本植株或较纯的群体内的花粉进行授粉结实的操作过程。其目的

16、：1、验证遗传因子的分离情况。2、使基因趋于纯合，产生稳定自交系。,四、远缘杂交分析远缘杂交通常是指植物分类学上不同种、属以上类型间的杂交。1、研究种间的亲缘关系。2、可以创造出新的植物类型。3、提高植物的抗病（逆）性，改良品种、创造雄性不育以及利用杂种优势等。,第五节 细胞学研究,细胞学方法研究植物种质资源主要是应用染色体分析技术。其原理是基于植物都有相对稳定的染色体数目、大小、形态和结构，它可以反映一个种甚至变种、品种与其它种、变种或品种的差异。1、染色体组分析(genome analysis)2、染色体核型分析（karyotype analysis）3、染色体带型分析（chromosom

17、e banding pattern analysis)等.,1、染色体组分析：分析植物细胞内染色体数目、染色体组的组成和其减数分裂时的行为特征等，其方法主要是通过杂交了解来自不同物种的染色体配对情况，从而判断其亲缘关系程度。染色体数目的鉴定是植物种质资源细胞学研究中最常用的方法，染色体数目鉴定的内容包括染色体基数、多倍体、非整倍体、B染色体和性染色体等。,染色体组(Genome)：遗传学上把一个正常配子中所包含的染色体数,称为染色体组，用n表示。染色体基数：指在呈多倍性的一系列数列中为最小的单倍染色体数，以x表示。多倍体（polyploid）：体细胞中含有三个以上染色体组的个体。分为同源多倍体

18、和异源多倍体。如：小麦是山羊草属、广义的冰草属和小麦属3个属的种类杂交形成的，染色体组为AABBDD，是2n=42的异源6倍体植物，,非整倍体（Aneuploid）：非整倍体是整倍体染色体中缺少或额外增加一条或若干条染色体。B染色体，也称超数染色体：是某些动、植物细胞核中除正常染色体（A染色体）外的一类数目不定的染色体，多为组成性异染色质组成。染色体数目对于研究种质资源系统发育过程中物种间的亲缘关系，特别是对于植物近缘类型的分类具有重要意义。,细胞学方法鉴定染色体数目通常以体细胞染色体数目为准，原因在于：在体细胞中。由于有丝分裂过程中染色单体均等分裂，使得同一个体中染色体数目保持相对的稳定性。

19、染色体数目统计一般应统计30个以上的细胞，其中85%以上细胞具有稳定一致的染色体数，才可作为该物种的染色体数目。,“禹氏三角”理论表明：芸薹（Brassica campestris L.）为AA染色体组（2n=2x=20），诸如大白菜、白菜、塌菜芸薹、芜菁以及白菜型油菜从细胞学上均可归为一类；黑芥（Brassica nigra L.）为BB染色体组（2n=2x=16）；甘蓝（Brassica oleracea L.）为CC染色体组，诸如结球甘蓝、花椰菜、芥蓝、青花菜均属此类。以上均为二倍体，被称为基本种,复合种：芥菜和芥菜型油菜（Brassica juncea）(AABB染色体组)；芜菁甘蓝（

20、Brassica napobrassica M.）和甘蓝型油菜（Brassica napus L.）（AACC）；埃塞俄比亚芥（Brassica carinata L.）(BBCC)。,2、染色体核型分析：染色体核型分析是分析生物体细胞内的染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等特征，其分析常以体细胞分裂中期染色体为研究对象。染色体的长度差异有两种：1)不同种、属间染色体组间相对应的染色体的绝对长度的差异，2)同一套染色体组内不同染色体的相对长度差异。,染色体绝对长度=放大的染色体长度(m)1000/放大倍数。在放大的照片或图片上测量。绝对长度稳定性差，只有在染色体大小差异明显种或者属间比较

21、具有价值。染色体相对长度=（染色体长度/染色体组总长度）100（Leven 1964年）。由于相对长度排除了因技术原因引起的染色体缩短程度不同所产生的差异，所以数据比较稳定。,染色体臂比=长臂（L）/短臂（S）。由于染色体长臂和短臂不一，着丝点的位置不同，根据臂比指数对染色体着丝点位置进行命名,核型分析中，次缢痕或核仁组织区（NOR）和随体的数目、分布和大小的差异。是区分某些近缘种或属的主要特征。次缢痕（secondary constriction）：是染色体上主缢痕以外的另一个凹陷。随体（satelliye）：在某些染色体短臂上连接着一个或几个球形小体，这个球形结构成为随体。具有随体的染色体

22、叫SAT染色体。染色体上随体的大小形状和位置时固定，也是识别染色体的指标之一。,3、染色体带型分析：是以染色体带纹的数目、部位、宽窄与浓淡等具有相对稳定性的特征为依据，借助特殊的理化方法及染料进行染色，使染色体显现出深浅不同的染色体带纹特征（异染色质着色），进而进行分析的方法。染色体显带显示了染色体纵向的内部结构分化，为揭示染色体在成分、结构、行为、功能等方面的奥秘，提供了更详细的信息。,植物染色体显带主要有荧光显带和Giemsa显带。C带：用酸、碱或高温处理，之后在60温度下进行复性，之后用Giemsa染料染色，染色体的不同部分就会出现深浅不同的带纹，将深色带纹区称为C带。由于异染色质在染色

23、体上所处的位置不同，C带可分着丝粒带、端粒带、副缢痕带及中间带等。,N带（R带）：用NaH2PO4在88 温度下处理染色体制片，而后用Giemsa染色，显现出来的带叫R带。G带：通过碱-盐溶液或胰蛋白酶对染色体制片进行预处理，然后用Giemsa染料染色，在染色体全长上显现出异染色区染色深的带纹，叫G带。G带是N带的反带：G带呈淡色的部分N带呈深色。,第六节 生物数学研究,一、模糊聚类分析 聚类分析是用数学方法定量地确定种质资源样品的亲疏关系，从而客观地划分类型，进行分类，在系统生物学中是属于表征分类学(phenetic taxonomy)，又称数量分类学(numerical taxonomy)

24、的分析方法。聚类分析是研究多要素事物分类问题的数量方法。基本原理是根据样本自身的属性，用数学方法按照某种相似性或差异性指标，定量地确定样本之间的亲疏关系，并按这种亲疏关系程度对样本进行聚类。常见的聚类分析方法有系统聚类法、动态聚类法和模糊聚类法等。,模糊聚类的分析方法：（1）统计数据的标准化，把原始数据转换成具有可比性的数据，又能反映原来的真实差别。（2）标定，目的是得到模糊相似矩阵，方法有欧氏距离法、数量积法、相关系数法。（3）分类，得到模糊等价矩阵后进行分类,二、分支分析：分支分析是分支分类学(cladistic taxonomy)的分析方法。分支分类学简称分支学(cladistics)或

25、支序学。基本思想最早由德国昆虫学家W.Hennig 在20 世纪50 年代提出。于1996年出版系统发育分类学(Phylogenetic Sys-tematics)。,分支分类学(系统发育分类学)的基本目标是解释及记录生物界的多样性,其研究的核心内容是式样(生物界的有序性)及过程,研究方法是利用这些性状重建生物类群的演化历史(系统树).研究所用的数据来自形态、化石和分子几个方面.,基本论点:(1)近裔共性原则(2)严格单系原则(3)简约性原则,(1)近裔共性原则有机体的特征可以分为三类：祖征(plesiomorphy)：从有机体的较远祖先继承下来的特征衍征(apomorphy):有机体自身的直

26、接祖先所衍生的特征.有机体的衍征一致性称为共有衍征或近裔共性,这是谱系亲缘关系证据的本质。趋同(convergenee):不同来源的特征在相似的条件下表现出的一致性.只有基于共有衍征的分类,才能形成自然的单亲类群,这就是近裔共性原则,也是分支分类理论的核心.,（2）严格单系原则 一个单系类群是由同一祖先种所衍生的一群种且包括它所产生的所有后代,分类系统必须清楚地表明近裔共性的阶层结构式样并据此建立严格的单系类群的嵌套(nested set,即套中套或类群内类群)系列.,（3）简约性原则 简约性原则要求在根据大量同源性状(近裔共性)建立分支图时,最大限度地综合协调不同性状变形系列,将平行的演化状

27、态(即同一状态在分支图上多次出现,包括平行演化、趋同及反向进化)降到最少数目.它是一种工作程序,并不意味着演化的实际过程是简约的.,分支分析为构造（重建）进化型式（分支图）提供了明晰的操作方法。（1）单系类群的分析确定（2）性状分析（3）分析运算（4）分支图与生物分类系统的建立（5）分支图的检验和系统发育推论,第七节 生物化学研究,生物化学是研究生物的化学组成和生命过程中化学变化的一门科学。生物化学证据对于植物分类研究有重要意义。（1）植物化学分析（2）血清学分析（3）同工酶分析,（1）植物化学分析 植物化学分析主要是研究植物小分子有机物的种类、含量以及相互作用的方法，通过薄层层析，或气相层析

28、，或高效液相层析等技术进行分析。薄层层析是将硅胶、氧化铝、聚酰胺等吸附剂，在一块干净的玻璃板上铺成一薄层，经过点样、展开、显色后，得到不同位置的带，即为不同的组成成分。,气象层析：用气象色谱仪，将在一定温度下具挥发性的物质注射到一根装有填充料的色谱柱中，经过色谱柱按照不同的保留时间到达鉴定器，从而在记录仪上表现出一系列与它们成分含量有关的峰值。气象色谱仪包括载气系统，进样系统，色谱拄，检测器，记录系统。高效液相色谱分析的原理与气象色谱相同，不同的是用液体做流动相，适宜于对热稳定性差、高分子与离子型的化合物。,二、血清学分析 血清学分析是用蛋白质的血清鉴别法测定植物种质资源的亲缘关系。该方法最早

29、用于20世纪初，是运用抗原和抗体在琼脂凝胶中借助电泳力相对扩散，形成沉淀带，对蛋白质结构进行定性鉴定。,抗原(antigen)是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。抗原的基本能力是免疫原性和反应原性。免疫原性是指能够刺激机体形成特异抗体或致敏淋巴细胞的能力。反应原性是指能与由它刺激所产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应。,抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。抗体的主要功能是与抗原(包括外来的和自身的)相结合，从而有效地清除侵入机体内的微

30、生物、寄生虫等异物，中和它们所释放的毒素或清除某些自身抗原，使机体保持正常平衡。,血清学反应（serologic reactions）是指相应的抗原和抗体在体外进行的结合反应。由于抗体主要存在于血清中，所以，进行这类反应时一般都要用含有抗体的血清作为实验材料，所以把体外的抗原、抗体反应称为血清学反应。,血清学反应是根据抗原、抗体具有高度特异性的原理来进行实验的，即用已知的一方来检测另一方的存在。既可定性，又可定量。可用已知抗体来检测未知抗原，也可用已知抗原来检测未知抗体。血清学反应的另一个特点是，当两种不同抗原分子上有共同抗原决定簇存在时，与抗体结合时可出现交叉反应，藉此。可以比较植物的相似性

31、。,血清学分析的具体步骤：从某一种植物中提取蛋白质，注射到兔子体内，在兔子的血清中形成抗体；然后，将含有抗体的血清（抗血清）与要试验的蛋白质悬浊液（抗原）相结合，抗原与抗体反应形成沉淀（沉淀反应）；再测定沉淀的量的强度。沉淀反应对用以形成原始抗体的抗原具有特异性(同源反应),这是标准反应和参考反应；抗体血清与其它植物的抗原产生的反应（异源反应），其反应的强度可以作为供试样品中蛋白质的相似程度，比较所研究植物的相似性。,血清学分析的技术较为复杂，加之多方面因素的限制，没有得到很好的发展。,三、同工酶分析 同工酶定义（isozyme，isoenzyme）：是指生物体内催化相同的生化反应，但其蛋白质

32、的分子结构、理化性质和免疫性能等方面存在明显差异的一组酶。在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，叫做组织的多态性，体现各组织的特异功能。,随着蛋白质分离技术的发展，特别是凝胶电泳的应用，使同工酶能够从细胞中分离出来。这类酶存在生物的的统一属、种、变种，或同一个体的不同组织、细胞中，可通过对它们的分析，并以其多态性作为遗传标记，研究种质资源的亲缘关系、重要性状的同工酶表现等。如：运用脂酶同工酶鉴定近缘野生莴苣与莴苣栽培种的亲缘关系。,同工酶在同一物种、同一个体的不同生长发育时期，其表现是不一样的，所以取不同期的材料，酶带的情况就不一样。一方面，这

33、是同工酶技术适用于发育研究的方便之处。另一方面，利用同工酶技术进行遗传学分析与群体遗传学研究时，则特别要求取材的一致性。否则，它们之间的差异可能不是遗传而是由发育造成的。,第八节 分子生物学研究,一、几个概念1、分子生物学：在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。2、分子标记：分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。,3、限制性内切酶：是一种能识别DNA上特定碱基组成序列，并在这些序列位点上切断DNA分子的酶。这些特定碱基组成的DNA序列叫做相应内切酶的识别位

34、点或限制性位点，长度一般在4至8个碱基对之间。如Pst的限制性位点是 5 C TGCAG 3 3 GACGT C 5常用的限制性内切酶：Ecor、Mse、Pst、Hind等,4、PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式）：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。由美国科学家PE（Perkin Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年诺贝尔

35、化学奖。,二、分子标记技术 分子标记技术是近年来发展最快的的技术之一，是分子生物学的发展尤其是PCR技术的产物，为分子标记技术是一种基于DNA变异的植物遗传标记的新技术。目前DNA分子标记技术已有数十种，已广泛应用于植物种质资源的研究，包括种质资源多样性分析、遗传图谱构建、基因定位、种质资源鉴别、系谱分析和分类等。,与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，遍及整个基因组；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中

36、性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息,三、几种常用的分子标记技术1、RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性）：RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。,RFLP 基本步骤：DNA提取用

37、限制性内切酶酶切DNA用凝胶电泳分开DNA片段把DNA片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。探针为来源于同种或不同种基因组DNA的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。,酶切位点突变,插入突变,RFLP标记的优点：是一种容易识别且遗传稳定的DNA分子标记、同一位点上等位基因多，能在任何发育时期，任何组织进行检测，而且不受环境影响，为共显性标记。因此，通过确定它们与性状的连锁关系或不同标记间的连锁关系，进行基因定位、构建遗传连锁图谱，还可对数量性状进行遗传分析，确定染色体的同源性，了解物种的系统发

38、育与演化关系。,RFLP的缺点：必须要分离单拷贝的基因组DNA克隆或cDNA克隆，才能进行多态性分析。RFLP技术的实验操作过程较复杂，需要对探针进行同位素标记，即使应用非放射性的Southern杂交技术，仍然是个耗时费力的过程。一些作物如玉米、水稻、番茄等已有覆盖整个基因组的克隆，很容易从有关单位或商家索取或购买到。但大多数作物还没有覆盖整个基因组的克隆，仍需要研制特异探针。,2、RAPD（随机扩增多态性，Random Amplified Polymorphic DNA）：使用具有9-10个碱基的单链随机引物，对基因组全长DNA进行PCR扩增，以检测多态性。引物结合位点DNA序列的改变以及两

39、扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。RAPD技术使是Williams等(1990)和Welsh与McClelland(1990)两个研究小组共同发展起来的。,400,引物结合位点突变,引物结合位点突变,缺失突变,RAPD标记的优点：对DNA需要量极少，质量要求也不高，操作简单易行，不需要接触放射性物质，一套引物可用于不同生物的基因组分析，可检测整个基因组。RAPD标记的缺点：一般表现为显性遗传，不能区分显性纯合和杂合的基因型，因而提供的信息量不完整。由于使用较短的引物，PCR 易受实验

40、条件的影响，结果的重复性较差。因此，进行RAPD分析必须建立可重复的反应体系。,3、AFLP（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）指通过PCR扩增经限制性内切酶酶切后的DNA模板，从而显示多态性的DNA片段。1993年由Zabeau etal发明的一项DNA指纹技术。,AFLP原理和步骤：基因组DNA先用限制性内切酶切割，产生分子量大小不同的限制性片段 使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接，作为扩增反应的模板 用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行两次扩增（选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼

41、的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增）扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，染色、显带 然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检验多态性。,AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其后的选择性碱基的变异。AFLP扩增片段的谱带数取决于采用的内切酶及引物3端的带有选择性碱基的种类、数目和所研究基因组的复杂性。AFLP引物包括三部分：5端的与人工接头序列互补的核心序列(core sequence，CORE)，限制性内切酶特定序列(enzyme-specific sequence，ENZ)和3端的带有选择性碱基的粘性末(selective,AFLP分子标记技术流程包括3个步骤：()DNA的准备

42、，DNA的酶切以及与人工合成的寡聚核甘酸接头(artificial oligonucleotide adapter)连接。一般采用双酶酶切。()选择性扩增酶切片段，一般用不带或带1个选择性碱基的引物进行预扩增，然后用带23个选择性碱基的引物进行再扩增。()AFLP标记的统计。AFLP产物通过聚丙酰胺变性凝胶电泳，染色和显色，检测样品的多态性。,AFLP的优点：是限制性酶切与PCR结合的一种技术，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性，可以在一个反应内检测大量的限制性片段，一次可获得50-100条谱带信息，具有高效性。AFLP的缺点：技术流程比较复杂，费用较高。,4、SSR（simple

43、sequence repeat，简单重复序列）：指的是微卫星DNA由于重复次数不同以及重复程度的不完全而造成的每个座位的多态性。微卫星DNA：又叫简单重复序列，是指基因组中由16个核苷酸组成的基本单位，重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置。,如在主要的农作物中两种最普遍的二核苷酸重复单位(AC)n和(GA)n在水稻、小麦、玉米、烟草中的数量分布频率是不同的。在小麦中估计有3000个(AC)n序列重复和约6000个(GA)n序列重复，两个重复之间的距离平均分别为704kb、，而在水稻中，(AC)n序列重复约有1000个左右，(GA)n重复约有2000个，重复之间的平均距离分别为4

44、50kb。另外在植物中也发现一些三核苷酸和四核苷酸的重复，其中最常见的是(AAG)n、(AAT)n。,微卫星DNA 在真核生物的基因组中的含量非常丰富，而且常常是随机分布于核DNA中，不同物种、甚至同一物种不同品种之间具有很高的多态性，如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性。通常微卫星DNA(重复序列)的两侧序列是非常保守的，基于这一点，可以设计与重复序列两侧序列互补的引物，对不同的重复区进行PCR扩增，进而发展成SSR标记。,SSR标记是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧

45、翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性。,SSR标记具有以下优点：(1)数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(4)每个位点由设计的引物顺序决定，便于不同的实验室相互交流合作开发引物。（5）操作简便、稳定可靠，一旦开发出某种生物的全套SSR引物，就获得了最丰富的遗传变异信息的DNA标记。,SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合

46、成引物以及标记的定位、作图等基础性研究，因而其开发费用相当高。由于SSR标记具有较大的应用价值，且种属特异性较强，目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作，共同进行STMS引物的开发。,5、STS（sequence tagged site，序列靶位点）：根据单拷贝的DNA片段两端的序列，设计一对特异引物，扩增基因组DNA而产生的一段长度为几百bp的特异序列。RFLP标记经两端测序，可转化为STS标记。STS标记在基因组中往往只出现一次，从而能够界定基因组的特异位点。但是，STS标记涉及DNA测序，因而只能对少数位点进行分析。,SNP（single nucleotide polymor

47、phism，单核苷酸多态性）：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。SNP在大多数基因组中存在较高的频率，在人类基因组中平均1.3kb就存在一个SNP。,由于SNP 数量丰富，可进行自动化检测，因此SNP具有广阔的应用前景。鉴定SNP可以通过设计特异的PCR 引物，扩增某个特定区域的片段，通过测序和遗传特征的比较，来鉴定该片段是否可以作为标记。大规模的鉴定要借助于芯片技术。,I AAGGGTCATAGGTACCTATGGATACGTAGACCCTGGTYACCTITIGAAT2 AAGGGTCATAGGTACCTATGGATACGTAGGCCCTGGTYACCITITGAAC3 AAGGGTCATAGGTACCTATGGATACGTAGACCCTGGTYACCITITGAAC,