第十四章免疫标记技术.ppt

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1、第十四章 免疫标记技术,免疫标记技术,免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并借助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定；可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；,免疫标记技术,在应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。,免疫标记技术的分类,根据试验中所用标记物的种类和检测

2、方法不同，免疫标记技术分为：免疫荧光技术放射免疫技术免疫酶技术免疫电镜技术免疫胶体金技术发光免疫测定。,免疫标记技术的应用范围,近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的进展以及应用现代高新技术建立的仪器分析日趋发展，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已发展成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术。在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验上作中应用十分广泛。,良好的分析试剂所具备的条件,高度选择性：决定分析结果的可靠性，同时省略预分离过程；高亲合性：保证分析数据的精密度和分析结果的准确性，也是达到高灵敏分析的基础；高灵敏性：试

3、剂与分析络合物之间应有较大的信号反差,特异性和亲合性是免疫分析的基础,抗体作为分析试剂其特异性和亲合性是无与伦比的，在免疫分析中样品不需要或只要简单的预处理即可直接进行反应抗体-抗原复合物的亲和常数(Ka)一般为109 mol-1，有些可达1014-15 mol-1，并且有较高的稳定性这两点是奠定免疫分析的高灵敏度和高度专一的基础。,免疫标记技术的必要性,然而抗体却缺乏高灵敏性试剂所应具备的分析信号反差，为了解决这一问题，人们研究发展了标记免疫分析法，在分析体系中引入探针系统实现高灵敏度检测，这就是抗体的标记技术（免疫标记技术）。,第一节 免疫荧光标记技术,免疫荧光分析(Immunofluor

4、escence assay，IFA)始创于40年代初，1942年Coons等曾次报道用异氰酸荧光素标记抗体检查小鼠组织切片中的可溶件肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。,基本原理,免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性同显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可

5、以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。,荧光抗体染色方法,荧光及荧光素,荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光，停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。,荧光抗体染色方法（直接法）,直接法是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每

6、种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。,荧光抗体染色方法（间接法）,将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去末结合的抗体。滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体己发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结合，形成抗原抗体标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法的优点是敏感性高于直接法，而且只需制备一种荧光素标记的抗球蛋白抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。,荧光抗体染色方法（间接法）,亦可用荧光束标记葡萄球菌A蛋白，代替标记抗球蛋白抗体用于间接法荧光染色。且不受第一抗体来源的种局限制，但敏感性低于标记抗抗体法。间接法

7、有时易产生非特异性荧光，为其缺点。此法常用于各种自身抗体的检测。如果第一抗体为已知，间接法也可用于鉴定未知抗原。,第二节 放射免疫标记技术,放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。,放射免疫标记技术的特点,RIA技术具有灵敏度高，可检测出ng(10-9g)至pg(10-12g)，甚至fg(10-15g)的超微量物质。特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此、在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微

8、量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。,放射免疫测定方法的主要类型,以同位素标记的抗原和检品中待测抗原与特异性抗体竞争结合的经典RIA法(Radio immunoassay)。以同位素标记的过量抗体与检品中待测抗原直接结合，然后用固相抗原免疫吸附剂分离游离标记抗体的免疫放射测定(Immunoradiometic assay，IRMA)。以同位素标记的配基(如激素)与细胞膜表面或组织中的相应受体特异结合，进行测定的放射受体分析(Radioreceptor assay，RRA)。,放射免疫测定(RIA),RIA是1959年Yalow和Berson首先创建的经典放射免疫分析技术，

9、用于血清中胰岛素含量的测定。30多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。,RIA的原理,免疫放射测定(IRMA),免疫放射测定:是待测抗原与过量标记抗体的非竞争结合反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体，离心除去沉淀，测定上清液中放射性强度从而推算出检品中抗原含量。,IRMA的特点,1968年Miles和Hales应用同位素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功，为了区别于经典的放射

10、免疫测定(RIA)，他们将其称为免疫放射测定或免疫放射度量分析(IRMA)。由于在反应系统中使用过量的标记抗体，且无竞争性抑制反应，因此抗体与待测抗原达到结合状态的化学平衡，在23h即可完成，较少受到抗体亲和常数的限制，即使单克隆抗体的亲和力较低，也能满足试验要求。同时一个抗原分子可以结合多个标记抗体分子，使IRMA的灵敏度明显高于RIA。,放射受体分析(RRA),放射受体分析的原理与免疫放射测定相似。应用放射性同位素标记配体，在一定条件下与相应受体结合成配体-受体复合物。由于二者的结合是表达配体与受体间的生物活性而非免疫活性，因此具有更高的特异性。放射受体分析可用于测定受体的亲和常数、解离常

11、数、受体结合数以及定位分析等。,RRA的特点,受体是存在于细胞膜表面、细胞浆或细胞核内的生物活性物质，其功能是和细胞外的信息分子配体特异性结合，然后将信息转变为生物效应。受体现已可从细胞或组织个分离、提取，进行定量和定位分析。放射受体分析或受体的放射配体结合分析，是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反应，它是目前对受体分子进行定量和定位分析研究的灵敏、可靠的一项技术。在药物设计、作用机理、生物效应及疾病的病因探讨，诊断和治疗等方面的应用已有较大常展。,第三节 胶体金标记技术,胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，具有高电子密度，并能与多种

12、生物大分子结合，已成为继荧光素、放射性同位素和酶之后，在免疫标记技术中较常用的一种非放射性示踪剂。,胶体金,胶休金标记技术(Immunogold labeling technique)是以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术；胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。,胶体金标记的原理,利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。根据胶体金的一些物理特性，如高电子密度、颗粒大小、形

13、状及颜色反应，加上结合物所具有的免疫学、生物学特性，使其在免疫学、组织学、病理学及细胞生物学标记研究工作中得到广泛应用。,免疫金染色,1971年Faulk和Taylor首先报道将胶体金与抗体结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。1974年，Romano等用胶体金标记抗球蛋白抗体，建立间接免疫金染色法。此后，胶体金作为一种新型免疫标记技术发展很快。1978年，Geobegan等将胶体金标记抗体用于普通光镜下检测B淋巴细胞表面膜免疫球蛋白，建立了光镜水平的免疫金染色(Immunogold staining，IGS)，但所需胶体全颗粒必须大于20nm，且标记物浓度要高，才能获得阳性结果。,胶体金染

14、色,免疫金银染色法,1981年Danscher用银显影方法增强金颗粒的可见度，并提高了灵敏度。1983年，Holgate等又加以改进，将免疫金染色与银显影技术相结合，称为免疫金银染色法(Immunogold silver staining，IGSS)。由于IGS和IGSS两种方法具有试剂制备简便，特异性强，灵敏度高，应用范围广，并可用于双重和多重标记等优点，被广泛应用于医学和细胞生物学研究领域，是目前免疫组织化学技术中较常用的敏感方法之一。,胶体金标记技术的发展,近年来，胶体金标记技术进一步发展应用于免疫转印、流式细胞术(flow cytometry，FCM)、液相免疫测定、固相斑点金/银染色

15、(dot IGS/IGSS)，斑点金免疫渗滤测定法(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，免疫层析(immuno chromatography assay)等多种标记免疫检测方法。,胶体金标记试纸条,control,test point,HCG test strip,休息,第四节 生物素与亲合素标记技术,生物素亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)，是70年代后期应用于免疫学，并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲合素之间高度亲和力及多级放大效应，并与荧光素、酶、同位素等免疫标记技术有机地结合，使各种示踪免

16、疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。,BAS 的应用,BAS已经广泛应用于生物医学实验研究的各个领域，既可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。,生物素(biotin),生物素广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄(型)和肝组织(型)，提取两型的生物活性基本相同，现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种羧化酶反应，故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31，分子式为C10H36O3N2S，有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，上有一戊酸侧短，其末端羧基是结合抗体和

17、其他生物大分子的唯一结构。,生物素的分子结构,I环为咪唑酮环，是与亲合素结合的主要部位；II环为噻唑环，其末端羧基是结合抗体的结构。,活化的生物素,利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素，以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP)，其中以BNHS最常用。近年来，应用活化长臂生物素(BCNHS)标记生物大分子，可以减少位阻效应，增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酰肼(BHZ)及肼化生物素(BCHZ)。,活化生物素的分子结构,亲合素(avidin

18、),亲合素亦称抗生物素蛋白、卵白素或亲和素，是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白：等电点(pI)为1010.5，含糖约l0，分子量为68kDa。纯品为白色粉末，易溶于水，在pH9-13的溶液中性质保持稳定，耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用80加热2min，仍保持活性，特别是和生物素结合后十分稳定。但对强光和Fe2+比较敏感。亲合素由4个相同的亚基组成，能结合4个分子的生物素。,亲合素与生物素间的亲和力,亲合素与生物素之间的亲和力极强，二者结合的亲和常数(Ka)为1015mol-1，比抗原与抗体的亲和力(Ka：105-11mol-1)至少高1万倍，因此二者能快速结合，而且反应不受外界干扰，具有高度特

19、异性和稳定性。亲合素富含色氨酸(约占6)，与其生物活性密切相关，因为亲合素是借助色氨酸残基与生物素的咪唑酮环结合。以结合1g生物素所需的亲合素量作为其活性单位，lmg纯的亲合素约含1315个活性单位。,链霉亲合素(streptavidin,SA),SA是链霉菌在培养过程中分泌的一种蛋白质产物。1L培养液中约含SA 1060mg，主要通过亚氨基生物素琼脂糖凝胶亲和层析法提纯。SA的分子量为65KDa，内4条序列相同的肽链组成。如同亲合素一样，一个SA分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数亦为1015mol-1。,链霉亲合素的特性,SA的每条肽链含159个氨基酸残基，其中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基

20、酸的含量比亲合素少，反之酸性氨基酸含量较多，因此SA是一种稍偏酸性的蛋白质，其pH为6.0，并且不带任何糖基。因此，SA在检测应用中出现的非特异性结合远低于亲合素故而有日渐取代后者之势。SA的活性单位也是以结合1g生物素所需的量来表示，l mg SA的最高活性可达18个单位。,基因工程链霉亲合素,近年来SA的克隆基因在大肠杆菌中的表达己获得成功。Sano等(1990)将构建的重组质粒转染细菌后在加入适量外源生物素维持细菌生长的条件下，诱导5h，SA基因的表达蛋白占整个菌体蛋白的35以上，用6mol/L盐酸胍透析(pH l.5)。可以获得近似均质的纯化SA，产量为3.96.5mg/100ml培养

21、液，且活性良好。,第五节 发光免疫标记技术,发光免疫分析是将发光分析和免疫反应相结合而建立的一种新型超微量分析技术。这种方法兼具有发光分析的高灵敏性和抗原抗体反应的高度特异性。,化学发光免疫分析,自从Schroder和Halman在70年代末期分别用化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)测定甲状腺素(T4)以来，发光免疫分析技术发展很快。尤其是近年来，由于氨基酞肼类及其衍生物对抗原(或抗体)标记方法的建立，叩啶酯类等发光剂的合成，以及某些酶技术、超弱光检测技术的发展，进一步推动了发光免疫技术的进展，使之成为医学、生物学研究领域中一种新的手段。,

22、化学发光,化学发光是指伴随化学反应过程所产生的光的发射现象。某些物质在进行化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物分子激发到电子激发态。当电子从激发态的最低振动能级回到基态的各个振动能级时产生辐射，多余的能量以光子的形式释放出来，这一现象称为化学发光。,化学发光与荧光,荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光，而化学发光是吸收了化学反应过程中所产生的化学能使分子激发而发射的光，其激发能不同。只有反应速度快的放能反应才能在可见光范围内观察到化学发光现象，而氧化还原反应所提供的能量介于其中，因此大多数化学发光为氧化还原反应。另外，吸收了化学能而处于激发态的分子或原子，必须能释放出光子或者

23、能将能量转移到另一个物质的分子上并使这种分子激发，当这种分子回到基态时释放出光子。,生物发光,生物发光是指发生在生物体内的发光现象，如荧火虫，维多利亚水母的发光。以往化学发光和生物发光看作是彼此独立的过程，随着这一领域研究的深人，逐渐加深了对各种生物发光反应机理的认识。实际上，生物体内的各种发光现象都与化学反应有关，是发生在生物体内的一种化学发光。,发光免疫分析的分类,化学发光免疫分析：以化学发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后直接引发化学发光反应进行检测。化学发光酶免疫分析：用参与某些发光反应的酶来标记抗原或抗体。免疫反应后，加入发光试剂，测定发光体系的发光强度进行抗原或抗体测定。生物发光免疫

24、分析：利用生物发光物质或参与生物发光反应的辅助因子标记抗原或抗体。免疫反应后，运用生物发光反应进行检测。,第六节 酶免疫标记技术,免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种技术。众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可催化大量的反应过程，所以极为敏感。免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。,基本原理,酶与抗体或抗原结合后，既不改变免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应的底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼或显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。这是一种特

25、异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。,酶的催化形式,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程有两种基本形式：E十S(ES)E十P E十S(ES)(ES)十D1 E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示酶的存在。,常用的酶及其底物,常用的酶及其底物,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA),最初发展的免疫酶测定方法。是使酶与抗体或抗原结合，用以检查组织中相应的抗原或抗体的存在。后来发展为将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶染色，底物显色后用肉限或分光光度计判定结果。这后一种技术就是目前应用最广的酶联免疫吸附试验，俗称ELISA(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)。,下一课内容为,“现代免疫学技术,