分解纤维素的微生物的分离LJ.ppt

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1、,纤维素：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物；,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；,1、在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力。2、农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑 等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；,纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源,科学家正致力于研究，怎样将农业废弃物、木材及生长更为迅速的草本植物，转化为种类繁多的生物燃料（甚至是航空燃油）。,课题3 分解纤维素的微生物的分离,一、基础知识,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相

2、连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,纤维素与纤维素酶,思考：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨，但却不会在地球上大量的积累，为什么？,纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。,下列生物能分解纤维素的是（）人 兔 牛 蘑菇 纤维杆菌,A.B.,C.D.,C,即：能分解纤维素的微生物有各种细菌、真菌和少数放线菌，动物则为草食性动物。,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,一、基础知识

3、,取二支20mL的试管,实验：纤维素酶分解纤维素的实验P27,各加入一张滤纸条,各加入pH4.8，物质量为0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液11ml和10ml,甲 乙,在乙试管中加入1mL纤维素酶,两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min的摇床上振荡1h,结果：乙试管的滤纸条消失,讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？,提示：本实验的自变量是纤维素酶的有无，自变量的操纵方法是：在一支试管中添加适量（1mL）的纤维素酶溶液，在另一支试管不添加纤维素酶，但需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pH。,实验分析：该小实验是如何构成对照的？,滤纸崩溃法,1、筛选纤维素

4、分解菌的方法_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,2、其原理是：刚果红可以与纤维素形成_，当纤维素被_分解后，红色复合物无法形成，出现以_为中心的_，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,（二）纤维素分解菌的筛选（阅读P28思考）,可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌,练一练：,1.下列关于纤维素酶的说法，错误的是,A.纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种B.纤维素酶可把纤维素分解成葡萄糖C.纤维素酶可用于去掉植物的细胞壁D.葡萄糖苷酶可把纤维素分解成葡萄糖,2.利用刚果红法可以筛选出纤维素分解菌，下列说法错误的是,A.

5、刚果红能与纤维素形成红色复合物 B.刚果红能与纤维二糖形成红色复合物 C.刚果红不能与葡萄糖形成红色复合物D.若培养基上产生了透明圈，则说明已筛选出了纤维素分解菌,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样?,培养的目的?选择培养基的特点?,挑选什么样的菌落?,鉴别培养基的特点?如何鉴别?,根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,二、实验设计,为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？,旁栏思考P28,如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土

6、壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,1、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_,【资料二】选择培养,阅读资料二“选择培养基”，回答以下几问题：P29,液体,没有添加琼脂,2、该培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是_,具有,以纤维素粉为唯一碳源，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖；,控制

7、的变量是将_改为_。,3、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,葡萄糖,纤维素粉,可用 与之对照；或者,牛肉膏蛋白胨培养基,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。,在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,旁栏思考P29,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上制备培养基:参照课本旁栏中的比例配制。倒平板操作；涂布平板：将稀释度为104106的菌悬液各 取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。挑选产生透明圈的菌落(参照

8、课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落,即为分解纤维素的菌落.),方法一：先，再加入刚果红进行颜色反应。方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,【资料三】刚果红染色法,这两种方法各有哪些优点与不足？,颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用,1、操作繁琐2、刚果红会使菌落之间发生混杂,操作简便，不存在菌落混杂问题,1.产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。,旁栏思考P29,挑选产生透明圈的菌落,挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,纯化培养,将挑取的菌再接种到纤维素分解菌的选择培养基

9、上，在300C370C培养，可获得纯培养。,本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？,课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在鉴别培养基上。其他步骤基本一致。,旁栏思考P28,将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择培养基上,将细菌培养在只有纤维素粉做碳源的选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养，增加浓度,在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高。在培养基中加入酚红指示剂，如果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成红

10、色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有红色的环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,2、选择培养的操作方法,1、复习微生物技术,将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养12天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。,三、操作提示,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格？对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,2.选择培养基是否筛选出菌落？如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解

11、纤维素的微生物。,3.分离的结果是否一致？由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。,为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_ _ _实验，纤维素酶的发酵方法有_ 发酵和_ 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ 含量进行定量测定。,发酵产纤维素酶,液体,固体,葡萄糖,五、课题延伸,分解纤维素的微生物的分离,纤维素酶,种类、作用、催化,刚果红染色,筛选原理,实验设计,土壤取样,选择培养,涂布培养,纯化培养,前置染色法后置染色法,富含纤维素土壤,增大分解菌含量,染色鉴别,分离出分解菌,课堂总结,1、从土壤中分离获得某种微生物的步骤是(）土壤取样 梯度稀释 选择培养 菌悬液涂布平板 挑选出单个菌落A、B、C、D、,2、有关选择培养正确的叙述是（）,A、可以增加纤维素分解菌的浓度B、可以减少纤维素分解菌的浓度C、所用培养基是固体培养基D、所用培养基是平板培养基,B,A,练一练：,3、请回答下列与检验饮用水有关的问题：检验大肠杆菌的含量时，通常将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，记录菌落数量,这种方为。下面四种菌落分布图中，不可能由用该方法得到的是。A B C D,稀释涂布平板法,D,