白刺液泡膜NaH逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析.doc
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1、 内蒙古大学本科毕业论文(设计) 本科毕业论文(设计)白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆与基因序列分析摘要白刺属(Nitraria L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的古老小属,中国有8种,内蒙古有4种该属植物是我国内蒙古、甘肃和新疆一带荒漠植被的重要建群种之一,为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物,而且具有很高的开发利用价值,因此开发其抗逆性基因资源、从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义。盐胁迫是影响植物正常生长发育的最严重的非生物胁迫之一。植物盐害可分
2、为原初盐害和次生盐害,原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害,即离子胁迫导致的伤害,包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代谢过程;次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。植物的耐盐机制主要包括渗透调节和降低胞内Na+浓度。减少Na+的吸收、外排Na+和将Na+区域化是保持胞内低Na+浓度的策略,其中Na+的外排和区域化主要由Na+/H+转运蛋白调节。液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白是将胞质内的Na+逆Na+浓度梯度运送到液泡膜中进而将Na+区域化集中。目前为止一些植物的液泡膜Na+/H+逆向蛋白编码基因(NHX)已经被克隆,而且一些研究表明NHX基因的过
3、量表达可显著提高植物的耐盐性。 本研究以开发白刺的耐盐基因资源、揭示其耐盐分子机理为目的、利用RT-PCR、RACE技术及iPCR的方法,从小果白刺(N. sibirica Pall)中克隆了NHX cDNA片断,并对其进行了经过同源序列比较及进化关系分析,从而为调查该基因的表达调控模式、作用机理及利用该基因进行甜土植物的耐盐性遗传改良奠定了基础。另外,本研究还克隆了小果白刺的肌动蛋白基因片断。由于肌动蛋白基因在各种不同器官上恒定表达,因而它常常被用作分子内标来研究其它基因的表达差异。小果白刺的肌动蛋白基因的克隆为今后研究NHX等白刺属植物的基因表达奠定基础。关键词:白刺,耐盐性,Na+/H+
4、逆向转运蛋白,RT-PCRMolecular cloning and Sequence Analysis of a vacuolar Na+/H+ antiporter and Actin genes form Nitraria L.Wang LiLin XiaoFeiAbstractThe Nitraria L.is a small genus of Zygophyllaceae, which primarily grows in arid and semiarid regions, saline and alkali land, desert and sand areas, and is
5、the major constructive species of forest in western Inner Mongolia. The Nitraria plants exhibit a strong salt-resistance, and have important economical- and ecological-value. Therefore, the research on molecular mechanism of stress tolerance is very necessary in Nitraria.Salt stress is one of abioti
6、c factor that cause serious limitation on plant growth and development. Plant salt stress include primary salt and secondry salt, primary salt refers to the injury on plant by ions, including the damage of selective penetrated property of plasma membrane and interference on plant metabolism; seconda
7、ry salt refers to the osmotic stress by excessive soil salinity and the nutrient loss by ion competition. Since the first vacuolar Na+/H+ antiporter gene, referred to as NHX, was cloned from Arabidopsis, more than 500 of NHX orthologs were isolated. Previous research indicated that over-expression o
8、f NHX gene can enhance salt-tolerance ability of plants.In the study, we isolated a cDNA fragment of NHX homology from N. sibirica Pall using RT-PCR, RACE and iPCR, and analyzed its gene structure and phylogenetic relationship. The results will prove an important experimental basis for analyzing the
9、 expression pattern and molecular mechanism of NHX gene, and for improving salt-resistant ability of glycophytes through genetic transformation with NHX genes of Nitraria L. On the other hand, we isolated a cDNA fragment of actin gene from N. sibirica Pall. The expression of actin genes are stable i
10、n each organs, therefore, it was used as an internal standard for analyzing gene expression. The experimental result could prove useful for gene-expression analysis of Nitraria plants.Keyword : Nitraria L.,salt-tolerance,Na+/H+ antiporter,RT-PCR 目录1 绪论71.1盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制71.1.1 盐胁迫对植物的伤害71.1.2植物的耐盐机
11、制81.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)研究进展81.2.1液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征81.2.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现91.2.3 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究101.3 本研究的目的及意义122 材料与方法142.1 材料142.1.1植物材料的培养142.1.2 实验试剂及配制142.1.3 实验使用试剂盒152.1.4实验用引物162.1.5 载体及菌株162.1.6 主要仪器设备及其他162.2 实验方法172.2.1 兼并引物设计172.2.2 白刺总RNA的提取及鉴定182.2.3 cDNA第一链的合成192.2.
12、4白刺Na+/H+逆向转运蛋白基因cDNA片段的克隆202.2.5白刺肌动蛋白基因片段的克隆202.2.6大肠杆菌DH5超级感受态细胞的制备(TB法)212.2.7 PCR产物的凝胶回收及TA克隆的与转化212.2.8克隆基因片段序列的测定232.2.9白刺Na+/H+逆向转运蛋白cDNA 3末端的快速克隆(RACE)232.2.10 白刺液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因5末端的获得252.2.11 Na+/H+逆向转运蛋白序列分析283结果与讨论293.1实验结果293.1.1 RNA的变性琼脂糖凝胶检测结果293.1.2 PCR产物鉴定293.1.3白刺Na+/H+逆向转运蛋白3末端cD
13、NA的克隆303.1.4菌落PCR鉴定含重组质粒菌落303.1.5 白刺Na+/H+转运蛋白基因5末端的获得313.1.6序列的blast 比对结果313.1.7基因片段的Na+/H+逆向转运蛋白基因序列分析及系统树构建333.2讨论分析333.2.1 RNA的变性琼脂糖凝胶电泳333.3.2 Na+/H+逆向转运蛋白基因的分离343.2.3肌动蛋白基因的内参作用344 致谢365参考文献376 附录391 绪论1.1盐胁迫对植物的影响及植物耐盐机制干旱半干旱地区,水分蒸发把地下盐分带到土壤表层,造成土壤表层盐分过多;海滨地区海水倒流或咸水灌溉等因素,土壤表层会积累较多盐分。自然界中造成盐胁迫
14、的盐分主要是NaCl、NaHCO3、Na2CO3、 Na2SO4,通常这些盐同时存在,称为盐碱土。全世界大约有20%的可耕土地及一半以上的水浇田受盐渍化影响,并且这种影响日益加剧。我国盐渍化土壤主要分布于北方和沿海地区,盐渍化使土壤水势下降。严重阻碍植物生长发育,已成为盐碱地区限制作物产量的主要因素【1】。1.1.1 盐胁迫对植物的伤害 植物盐害可分为原初盐害和次生盐害【2】,原初盐害是指盐离子本身对植物产生的伤害,即离子胁迫导致的伤害,包括破坏质膜的选择透过性和干扰植物的各种代谢过程;次生盐害则包括由土壤盐分过多引起的渗透胁迫和由离子间的竞争引起的营养亏损。1.1.2植物的耐盐机制 不同植物
15、对盐胁迫的适应方式不同,或者通过减少盐分在体内的积累逃避盐害,或者通过自身生理或代谢过程来适应或忍受细胞内的高盐环境。具体途径可分为:一是减少Na+的吸收及增加Na+的外排,植物细胞在确保其他离子吸收的条件下选择性的排斥Na+,不让其通过质膜,而高等植物的排Na+机制主要与质膜Na+/H+逆向转运体(SOS1)有关,质膜H+-ATPase 的主要功能是驱动质子排出质膜,建立跨膜pH梯度和电势差,即质子驱动力,提供能量驱动膜上Na+/H+逆向转运体,使质子顺电化学梯度进入细胞,同时Na+逆化学势排出细胞。二是盐分的区隔化,主要由液泡膜上质子泵、Na+/H+逆向转运体(NHX)和离子通道所调控。液
16、泡膜上存在两类质子泵,分别为液泡膜H+-ATPase和H+-PPase,他们分别通过水解ATP和焦磷酸(PPi)产生能量将H+进行定向运输,在液泡膜两侧形成质子梯度【3】,提供能量驱动液泡膜上Na+/H+逆向转运体,从而使Na+进行跨膜运输,被动进入液泡。三是渗透调节作用,一些盐生植物依靠从外界吸收和积累无机盐离子,进行渗透调节防止盐害,或者在细胞中合成大量不同有机物以降低细胞的渗透势。四是合成保护蛋白,又称渗透胁迫蛋白【4】。1.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)研究进展1.2.1液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的分子特征 植物胞内NHX家族分为两类,分别用符号I和II表示。所有的N
17、HX I类成员都定位于液泡膜上,并在胞内形成一个独立的转运子分支。相对而言,II类的成员存在于植物内膜囊泡上,同时也包括定位于动物和细菌中多种内体上的同源蛋白。在已知基因组全序列的拟南芥和水稻中,NHX基因家族的序列大小几乎相同。拟南芥有6个NHX基因(AtNHX),水稻有5个NHX基因(OsNHX)。它们的分配方式相似,AtNHX1-4和OsNHX1-4构成I类,AtNHX5-6和OsNHX5构成II类。拟南芥和水稻的I类组成员显示出56.0-87.5%的相似性,而II类成员的相似性为78.7%,但是与I类的相似性只有21%-23%【5】。Zorb等【6】克隆了玉米(Zea mays L.)
18、NHX家族的六个成员ZmNHX16,其中,ZmNHX1,2,6 属于一个亚家族,与拟南芥AtNHX1,2 同源性高,而ZmNHX3,4,5 属于另一个亚家族,与拟南芥AtNHX46 同源性高。这六个成员具有器官和盐处理特异性的表达模式。分析植物Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列的亲水性图谱包括N末端的跨膜区域和C末端的胞质区域。前者对氨氯吡嗪脒(amiloride)及其衍生物敏感,是负责转运的区域,由9-12个跨膜结构域组成。后者大约由300个碱基组成,结构域内含有多个蛋白激酶作用位点,能够与钙调素(calmodulin)结合,参与多种信号反应,是调节活性的区域【7】。Yamaguchi等【8
19、】分析了 AtNHX1 的膜拓扑学结构,他们发现 AtNHX1 蛋白的整个结构不同于人的Na+/H+交换蛋白NHE1和任何已知的其他Na+/H+逆向转运蛋白。AtNHX1由9个跨膜区域和1个亲水的C末端结构域组成,其中3个推测的疏水跨膜区TM3、TM5、TM6看上去与膜相连,实际上并没有跨过液泡膜。他们的结果还表明,AtNHX1的N末端朝向胞质,但几乎整个C末端都位于液泡腔中。与其蛋白家族的其他基因相比,AtNHX1 N末端很保守,对于Na+/H+逆向转运蛋白的活性非常重要。AtNHX1的TM3区具有一个推测的氨氯吡嗪脒结合序列(FFIYLLPPI),这段序列在其他植物 NHX以及哺乳动物NH
20、E中均高度保守,氨氯吡嗪脒与真核生物Na+/H+逆向转运蛋白结合后能抑制其转运活性。AtNHX1的TM5和TM6与人NHE中高度保守的TM6和TM7相对应,TM6和TM7对NHE1的转运活性很重要,但 AtNHX1的TM5和TM6区不跨膜,所以很难说它们对于AtNHX1的转运活性起重要作用。另外,AtNHX1的TM3与TM5、TM6可能分别构成了胞质和液泡中结合离子的结构,它们的方向决定离子运动的方向。Rajagopal等【9】对珍珠栗Pennisetum glaucum液泡膜Na+/H+转运蛋白PgNHX1与AtNHX1、OsNHX1做了比较,后者含有9个跨膜结构域,而PgNHX1为5个跨膜
21、结构域包括一个钙素结合区域,调控PgNHX1的活性,TM3、TM4区与AtNHX1、OsNHX1的保守性较高。Yamaguchi等【10】进一步分析了位于液泡腔内C末端,AtCaM15(类似钙调素的蛋白)位于C末端,依赖于Ca2+和pH值,调控Na+/H+转运蛋白底物的选择性,以及液泡中的 pH 值调控Na+/H+转运蛋白与阳离子亲和性。AtNHX1 C末端的缺失使Na+/H+选择比率增加一倍,证实C末端的调节功能。1.2.2 液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白在植物耐盐性的表现 NHX1基因在植物耐盐性的作用主要表现在以下三方面:一是利用液泡膜H+-ATPase和液泡膜H+-PPiase产生的跨
22、膜质子梯度将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡中【5】,这样降低了胞质内的Na+含量,维持胞质正常的K+/Na+比值,而且可以有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂,降低Na+对植物细胞的毒害作用【11】。即使在胞质内Na+浓度很低的情况下,Na+ 也可主动泵进液泡中,Cl-则被动的由阴离子通道进入液泡平衡膜内外的电荷差别【12】。;二是Na+/H+逆向转运蛋白的C末端对其转运活性和离子选择性的调控,植物液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的C末端比质膜Na+/H+逆向转运蛋白的C末端短得多,仅有100多个氨基酸。AtNHX1的N末端朝向胞质而整个C末端亲水区域都在液泡内,Yamaguchi等【6】的
23、转运研究认为AtNHX1的C端调节转运蛋白阳离子的运输,C末端可能是糖基化或其它蛋白修饰的位点。利用酵母异源表达系统进行末端缺失实验中,N末端缺失17个氨基酸引起Na+/H+转运活性轻微降低和K+/H+转运活性的少量增加。亲水性C末端的82个氨基酸缺失使Na+/H+转运活性大大增加,而这种缺失导致K+和H+的运输速率相对降低,Na+和K+的运输比率也是未修饰的两倍。说明AtNHX1的C末端对Na+/H+逆向转运蛋白活性及底物选择性具有调控作用。另外,Yamaguchi等【8】异源表达酵母细胞的实验表明AtCaM15(类似钙调素的蛋白) 定位于液泡腔内的AtNHX1 C末端,依赖于Ca2+和pH
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