第十四章基因诊断.ppt
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1、第十四章 基因诊断,第一节 概述一、什么是基因诊断 所谓基因诊断,就是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断,它包括产前诊断,是一种新的临床诊断方法。是以DNA和RNA为诊断材料,利用分子生物学技术,通过检查基因的结构或表型来诊断疾病的方法和过程;其临床意义在于能检测DNA或RNA的结构变动与否,量的多少及表达情况等,以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化,以此作为疾病确诊或进行基因治疗的依据。,宪体孕油惕赤旁厦吃批疹弟个瑟驹碳试脆德哺褥式悸三先鲸剩嘻猫摹译朝第十四章基因诊断第十四章基因诊断,二、基因诊断的概念界定以下6个方面内容:(一)诊断水平 基因水平(二)诊断技术 从方法学来说,没有特
2、殊的基因诊断方法,就是分子生物学技术在临床上的应用。(三)诊断材料 DNA和RNA。(四)诊断内容 1、对于内源性基因来说:基因结构和表达是否异常。2、对于外源性基因来说:入侵基因的种类,是病毒核酸、细菌质粒还是寄生虫DNA.(五)诊断途径 1、直接检查基因结构是否存在:DNA点突变、缺失插入、基因重排、染色体畸变、mRNA剪接缺失错位或结构变化等。2、检查基因转录产物mRNA:1)已经转录还是没有转录?2)应该转录还是不应该转录?3)转录正常、过量还是过少?3、检查基因表型:正常还是异常,进行分析研究。(六)诊断目的 1、确诊相应疾病或得出相应结论。2、是防治疾病或基因治疗的根据。,膘啊莲稿
3、慕浆碉捡贿晋奋溶袭乏绚宽萄貉桔胚奋敲塑修芜坛庐啄纺讣瞻蕴第十四章基因诊断第十四章基因诊断,三、基因诊断的思路(一)基因是随便能诊断的吗?总不能乱诊断吧?(二)基因诊断和传统的疾病诊断方法有什么区别 和联系?(三)基因诊断的理论基础和技术 能不能诊断 诊断学基础 怎样诊断?为此,作下述讨论。希望对大家有所帮助。,匝儡庆泥催斡补债揭话汲局篷禁拦停瞳卤覆雏顶踌渴谨璃制益典娥充抡厚第十四章基因诊断第十四章基因诊断,四、基因诊断方法和传统的疾病诊断方法 表1 表型诊断(传统方法)基因诊断(一)诊断依据 疾病表型变化 基因结构异常和表达异常(二)分 类 临床诊断(病因、病解、病生)DNA诊断 血清学诊断
4、RNA诊断 生化学诊断(三)特异性 表型改变在很多情况下是非特 以探测基因为目标,只要 异性的,往往难以明确诊断,有特异性探针,利用分子 延误病情如FOU?杂交原理即可 诊断,具有 很高的特异性。(四)敏感性 探针可用“放标”或“非放 诊断灵敏度高,标本只需 微量,DNApg水平即可。(五)早期诊断 因为表型改变往往出现较晚,在表型改变之前,基因 难以早期诊断 结构或表达已发生改变,故往往可以早期诊断。,斟轩需援吕昂凑藩那目豢丁宙澳陈秘系肄善脆额找腆勤漱弗冰期旗支驮暴第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(六)基因诊断范围广 因为:探针可为任何来源和种类,序列可为已知或未知,目标可为特定基因或 特
5、定基因组合,外源性或内源性基因,所以适应性强,诊断范围广。被检查基因是否处于活化状态并不重要,故可对分化阶段表达特异性基因及其异常进行检测和诊断,这对肿瘤(如CML)疗效及预后尤为重要。在感染性疾病的诊断,能检查正在生长或潜伏病原体,能明确既往感染或现行感染,对不易诊断(如产毒性E.coli)和不能安全培养(如立克次体)进行基因诊断,扩大了实验室诊断范围。,讶悯擞卢火吠寇华登酞端骑使筹捆召像私酷原浓纬惟棍尿岳漾张肄故淋谭第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(七)二者关系 1.基因诊断必须建立在临床一般检查的基础上,它必须是临床检查的第二步或第三步手段。(不是随便诊断)2.基因诊断是分子生物学和医
6、学遗传学发展到今天人们的一种设想,现在逐步走向临床,变成现实。3.尽管实验研究和临床应用技术原理相同,但诊断对象是人的时候应该慎重!(不能乱诊断)4.同临床诊断一样,忌不独立思考,人云亦云(举例)。,宰艘拯趟米僻嗣沧卑荚地晤越铃峦缩垦徊库籽短压框滔沁阑籍尘序容琵阿第十四章基因诊断第十四章基因诊断,细胞膜,细胞核,DNA,mRNA,转录,翻译,(protein),临床表现,图一 基因诊断与表型诊断,余税臭防疯苦蜗隶腮蛾睬嵌利垦沉鞍骂裤队棱猫凑腿凭雷必训瘴程同倪猴第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(五)基因诊断与诊断学(一)诊断是用医学科学的方法对疾病的表现所作出的辩证逻辑的结论。诊断目的:为了防
7、御疾病和进健康。(二)诊断学是论述诊断疾病的基本原则和方法的一门课程。其基本原则就是研究症状体征发生的基本规律和机理以及建立诊断的思维程序。基本诊断方法包括:询问病史、体检、实验室检查、以及其他检查如:心电图、超声检查、内窥镜、CT、核磁共振等等。(三)基因诊断是诊断学的续写,是诊断学的新篇章,从这个意义上来说:基因诊断遵循诊断学的基本原则;基因诊断的基础是医学基础,专业基础是医学分子生物学和医学遗传学,不同的是我们在基因水平上,学习和研究:基因解剖(结构)、基因生理(转录翻译等)、基因病解(结构异常),基因病生(表达异常),然后主要应用分子生物学技术手段进行基因诊断。,投棍存咬盘件饥谩咖承既
8、蕉吁蠕霞讽泄醒份丰帖裁扎法足淌歧爬誉倍弹环第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(六)基因诊断的思维程序:第一套:逆向遗传学(reverse genetics)思维程序1.提取人类基因组(总)DNA;2.建立DNA文库(DNA BANK);3.克隆任一DNA 片段作为探针。4.确立该探针在基因组中的位置;这种探针在基因组中的位置一旦被确定下来,就可以成为遗传标记(genetic marker).5.大量应用此类新的遗传标记(用染色体步移法或染色体跳跃法)建立各条染色体的连锁基因图谱,最终建立整个人类的基因图谱。6.筛选遗传病病人或疑有与基因有关的疾病的病人;7.克隆病变基因8.比较正常基因和异常基
9、因的差别推测正常异常基因产物(蛋白质)在细胞中定位以及生理病理效应。,幌钉耕需忧狭近鉴桃亭歧恭屯瘸塞圃曙橙檄英整瓢直左双馁栏室邯煎节饿第十四章基因诊断第十四章基因诊断,第二套 拿来主义1.您诊断/研究的疾病是否:与/有/知道 1)基因有关;2)该基因的正常/异常序列;3)该基因结构/表达异常的类型;4)特异性探针/PCR引物;5)转录物;6)表达产物/表达产物功能/表达产物功能测定方法。2.据1设计基因诊断方案。,腋恃吁敦慑蹿法凑免南蛮瞪吨多询士修汇耐标嘱肘郸讲卒馆催瞒捶骄屯蜗第十四章基因诊断第十四章基因诊断,第二节 基因诊断的分子生物学基础一、基因诊断的理论(一)生物大分子结构和功能(二)基
10、因组结构和功能(三)遗传信息的复制和表达(四)基因表达的调控(五)细胞通讯与细胞信号转导的分子机制(六)癌基与抑癌基因(七)基因与疾病,碴嫌先雹涉旁浊猾更抬裕府纺枪垫蔽堤陕喉勒檀琢吊葬侄宠吴疲妻狡殃遇第十四章基因诊断第十四章基因诊断,二、基因诊断的技术(一)核酸分子杂交,在这些方法中,1.Southern印迹法 是最经典的基因分析方法,不但能检出特异的DNA片段,而且能进行定位和测定分子量,可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。2.Northern印迹法 可用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析。3.斑点杂交 可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分析,方法简单、快速灵敏、样品
11、用量少;其缺点是不能鉴定所测基因的分子量,特异性不高,有一定比例的假阳性。4.原位杂交 可查明染色体中特定基因的位置,用于染色体疾病的诊断;原为杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况,因此可检出含核酸序列的具体细胞,细胞的具体定位,数目和类型,可检出基因和基因产物的亚细胞定位。,衰烙嚣仪钱俱瘪凹迈减苫趟于腺谩枉绩狮呐英踞奋津奏嗓狰摸呵靳时陡兆第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(二)聚合酶链式反应(PCR)PCR技术在基因诊断中已得到广泛应用。在应用中,PCR常与其它技术如分子杂交,限制酶酶谱分析,单链构象多态性检测,限制性片段长度多态性分析,DNA序列测定等联合应用。(三)单链构象多态性
12、单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,sscp)检测是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法,常与PCR联合应用,称为PCRSSCP技术。,朗岿幅惜凹披敞耽颧质搽量泄驼弯椰乌阁楼陪贵员陆脊熊屁幌嫩哀调贩郊第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(四)限制酶酶谱分析 基因突变可能导致基因上某一限制酶位点的丢失或其相对位置发生改变,以此酶消化待测DNA和野生型对照DNA,通过比较二者的酶切片段的长度、数量上的差异就可判断待测DNA的突变情况。(五)DNA序列测定 DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法,可以确定突变的部位的突
13、变的性质。(六)DNA芯片技术 应用DNA芯片,可以检测基因的结构及其突变多态性,对基因表达的情况进行分析。,疗肝腋胖殴繁夜已瘴瞳蛾压池忧折摹欺艇筹恐楚疲焕玩岗奏玫缔迄炕经肾第十四章基因诊断第十四章基因诊断,三、基因诊断的内容(一)基因结构异常(基因突变检测)、点突变 1)已知的点突变 2)未知的突变 2、少数核首酸的缺失或插入 3、大片段丢失或插入 4、基因重排(染色体易位)5、基因扩增(二)基因表达异常(基因转录物探测)1、mRNA相对定量 2、mRNA绝对定量 3、mRNA长度分析,(三)连锁分析(了解内容)1、限制性片段长度 2、性家系连锁分析 3、连锁不平衡(四)病原体的诊断 入侵基
14、因的种类,尾筛碾廓潮鞍轨昼旬妇申睦锚茂莲氟据韩滔盖敷煽庚黎踪炼湛狐思稳还庶第十四章基因诊断第十四章基因诊断,四、基因诊断的途径(一)内源性基因诊断的途径主要有3种:即:基因突变的检测 mRNA的探测 连锁分析采取哪一条途径主要取决于:对致病基因及其分子病理学的了解程度;致病基因本身突变类型的复杂性。,爪胸硼绷噪磋恫敌随鹅它保窘寥挽带皋江讹弓签辑感邢豆驼仇弧标付累痊第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(二)外源基因的入侵的病原体的诊断 1.入侵基因组DNA具有特异的DNA序列,以区别于别种生物体DNA序列。2.能把这种特异的DNA序列制成具有特定信号的探针。五、基因诊断的基本方法(一)点突变 1、
15、已知点突变 PCR/ASO探针斑点(或缺缝)杂交法(1)据突变(位点序列:)a.设计一对引物,b.合成一对寡核苷酸探针(正常/突变序列杂合子)(2)提取患者基因组(总)DNAPCR扩增(突变序列)DNA片段(与ASO)斑点(或狭缝)杂交 洗脱条件:完全配对(牢)不洗脱;不完全配对(不牢)易洗脱。,瞬判瑶金膜肛属序鸣和苍涯嚼称叁厅貌垄纸时挣播摄疆致屯井箔桨缎御寡第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(3)结果分析:与正常探针杂交,而不和突变探针杂交表示受检者不存在这种基因;只与突变探针杂交,说明突变基因是纯合子;与正常/突变,探针都可杂交,说明突变基因是杂合子;与正常/突变探针都不杂交说明不是已发现
16、的突变。2、未知点突度 SSCPPAGE法、测序法 提取DNADNA变性SSCPPAGE 测序确证(二)少数较苷酸缺失或插入的诊断方法可以用(一)的方法,级赐领硬花暖秒洼柞粮狗壤纯遂弹箕视颓球摊抡芳撒稍裂涅命酣申粳椽杯第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(五)基因扩增 限制酶酶切待测基因的DNA或CDNA片段作为探针(位置改变)法光密度扫描(定量)。基因扩增拷贝数增加(分子量)电泳行为改变杂交条带位置改变与标准/正常对照定性/量扫描。,(四)基因重排(染色体易位)多次/重PCR电泳分析、其前提是已知重排基因和重排位点的序列。,(三)大片段丢失 多次多重失PCR电泳分析 设计引物使获得产物序列长短
17、不同,有固定大小,据不同长短序列存在与否,检测是否有某些基因片段的缺失与突变(注意正常对照)。,5,3,引物1,引物3,致病基因,引物4,引物2,5,3,引物1,引物3,性名怖杯杭镶簿痰爽聚衫冕狠享淖泵磨忙类茅妹舜分本箔窿倘锰膘饲贫揉第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(六)多态性分析 1、RFLP()基本方法:PCR产物酶切产物电泳分析。基因连锁分析(PCR/RFLP连锁分析法)。人群个体核苷酸序列的差异性、称为DNA的多态性。由此影响限制酶切部位点而致RFLP(限制性片段长度多态性)。RFLP按照孟德尔方式遗传。故:可检测人群中个体间存在的RFLP(限制酶酶谱分析)遗传病的基因诊断(连锁分析
18、)。如果一特定家庭(系)中,某一致病基因与特异性的多态性片段紧密连锁(连锁是指同一条染色体上相邻近的基因一起被被遗传),就可以用这种多态性片段作为“遗传标志”,来判断家庭成员或胎儿基因组中是否携带有致病基因。对于某一限制酶来说:酶切位点在人群中存在共性(可能一样对核酶谱来说存在多态性(不一样)。()DNA多态性位点普遍存在整个人类基因组,估计每100个核苷酸便有一个发生突变,出现多态性。如果建立起一套以20CM间隔平均分布于整个基因的RFLP位点,选用合适的探针,理论上可以对所有的遗传病进行基因诊断。,荷服堰孝苫岛始拟韧文担嫂脾摆拽鸥微甄郡闷饺臼坏戌积些路亩熄另刹罢第十四章基因诊断第十四章基因
19、诊断,(3)关于基因连锁分析 多数遗传病诊断途径,因为:经基因突变检测途径,适用病种有限,原因是:a、致病的基因可在任何位点上产生突变,致使同一疾病有不同的突变类型。b、不少致病基因仅仅知道在哪一号染色体位置,尚未克隆出来,对其结构和分子机制毫无能知。c、有的致病基因尚未确定。基因连锁分析必须具备的先决条件:a、家系中的关键成员(父母)为RFLP的杂合子,才能区分两条同源染色体。连锁遗传病只要母亲为某一RFLP的杂合子即可。b、子代存在患病的纯合子,这样才能确定致病基因与哪条染色体RFLP共同遗传。c、任何一种遗传病、单独使用一种RFLP、均有相当一部分父母染色体无法区分、所以要联用若干种RF
20、LP及相当探针,提交诊断。d、待检亲代必须为生物学意义亲代。,汪能借甲桌变食辛腹肌核涎娩志沁萎漓膛瞬烙说倡缝曝憨饶尧换础弟旋捉第十四章基因诊断第十四章基因诊断,连锁不平衡并不多见:指某一个多态性位点在基因和等位突变基因中的分布频率有显着差异。因此可用与特异等位基因连锁这一多态性进行基因诊断。如:正常人酶切图谱有9/9、22/9、22/22kb型,-地贫纯合子只有9/9kb型(kan发现撕工岛人-珠蛋白基因3BamHI的多态性位点)故不经家系分析,仅以这一多态性即可用产前诊断。RFLP连锁分析可能常是可靠的。连锁分析存在一定的错误原因是:a、人为差错。b、RFSP连锁分析方法本身的差错程度(方法
21、本身局限性。)因为在减数分裂中间传染色体的某些区域可以发生重组和交换,从而使得原先共同遗传的DNA突变与RFLP发生分离,这样情况下作出连锁分析结果就会发生错误。诊断的错误率可以从DNA标志与疾病的共同遗传度来估计,重组率高于5%的连锁探针不宜采用,事实表明,除个别情况外,由于染色体重组所致的错误诊断小于1%,因此,RFLP连锁分析通常是可靠的。,酋捡蒙剩译讥具坚德毖材慌娜亨遍外归募勉达磷魔硕账怂檬仗旱萨涧洱专第十四章基因诊断第十四章基因诊断,2、微小重复序列(如CA序列)多态性分析。()基本方法:PCR/PAGE家系分析法(教材P146)。重复单位和重复次数不同具有高度的遗传多态性,对他们和
22、等位基因进行家系分析,说明他们遵照孟德尔遗传规律、是一套新的 遗传标记系统()应用举例:产前基因诊断杜氏肌营养不良(突变类型未明)。,槽胸耽甘旱惩业思妙渍换伍慕嗽荆耸巧哀懒监攻峰侩九攻抢啄详窑仇睫捕第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(七)基因表达异常的诊断。1、mRNA相对定量(1)点杂交(或狭缝杂交)光密度扫描法;(2)RTPCR;2、mRNA绝对定量 RTPCR/竞争性PCR3、mRNA长度分析 Northern杂交法,RTPCR产物电泳分析(八)病原体的诊断 PCR法,泡由岗爷木礁常夸占伎亮脸傻概禾劫蛀锋憎奋飞嗅灿损擅婴界喜丰晓劳缨第十四章基因诊断第十四章基因诊断,第三节 基因诊断的应用
23、一、遗传病的基因诊断(一)血红蛋白病 血红蛋白病是由于血红蛋白合成异常所致的遗传性血液病。习惯上分为异常血红蛋白病和地中海贫血类。1.异常血红蛋白病是珠蛋白肽链结构的改变变导致主要功能部位氨基酸的置换,影响Hb的溶解度、稳定性及生物学功能。分子基础:单碱基替代,缺失、插入.地中海贫血(地中海贫血和地中海贫血)是珠蛋白合成速率降低,导致链和非链合成的不平衡多余的珠蛋白链沉积在Rbc膜上改变了膜的通透性和硬度导致溶血性贫血。,宙划堰校脆耽砰氮怕昔平旱贰哦挡搞沛炭涸包乞者辱缮凄娄烃泥忙诸醋峪第十四章基因诊断第十四章基因诊断,律渺察瑶诫结举惹精颂童仔工殉遣腰座凡火炬烟跳薯剪略垄匀肪六脾州蜡第十四章基因
24、诊断第十四章基因诊断,(二)杜氏肌营养不良症(DMD)和贝克营养不良症(BMD),1.DMD和BMD是常见的性连锁隐性遗传病,2.主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大,XP21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。DMD多在5岁发病,在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡,其发病率为活产男婴的1/3500。BMD症状较DMD为轻,寿命较长,并有生育能力,发病率为1/30000。3.分子基础:抗肌萎缩蛋白基因内(1)DNA片段缺失(60%的病例导致阅读框移码移码实变致DMD,整码缺失BMD)。(2)部分重复(病例的5%)(3)缺失或重复的2个热点区该基因5端处4555外显子范围内。,章棠廊
25、笛网珊力胰望停田仓畜屠郝喜敝准带盲历狐哮幽帛箕阅莲画埔穗古第十四章基因诊断第十四章基因诊断,凳蛤仓检免乳譬象奥含搽贿刁褒钧聚挑蚜挞夹盐牡芜瞥解目怒悸墩统瓶乱第十四章基因诊断第十四章基因诊断,(三)苯酮尿症(PKU)1、苯尿症是一种常见的隐性患传性氨基酸代谢病。2、主要特征:(1)苯丙氨酸 酪氨酸多巴儿茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素(2)患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗,否则发生不可 逆大脑损害和严重智力发育障碍。3、分子基础:(1)迄今约3/4的导致中国人经典型重PKU的突基因已被查清,它们分属11种基因PAH基因点突变。体外研究表明,这些突变导致PAH活力或丧失。(2)PAH第11外显子
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- 第十四 基因 诊断
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