miRNA综述文献翻译.docx

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1、MicroRNAs与它们的靶点：识别，调控和一种新 发现的相互作用关系摘要：在多种生物途径中，MicroRNAs(MiRNAs)已被证实是关键的基因调控因 子。这些小的非编码RNA结合到mRNAs的靶向位点上，并且通常是导致基因 表达受到抑制。目前虽然有几种方法用于鉴定miRNA的靶向位点，但是仅仅确 认miRNA的结合位点是不足以预测靶向调控的。miRNAs的靶向调控受各个控 制水平的限制，并且最近的研究进展出现了一个新的转折：靶点可以反馈调控 miRNAs的水平和作用。miRNAs与靶基因的相互调控作用将激发我们对miRNAs 在体内所扮演的基因调控作用的理解，并且这些RNAs对于治疗有着

2、重要的意义。MicroRNAs (miRNAs)证实了一个新的观点：在调控重要性中，非编码 RNAs(ncRNAs)的作用可能能与蛋白质媲美。自从最初发现miRNAs在 Caenorhabditis elegans线虫发育过程中作为必要的调控因子，数千种miRNA基 因已经被证实存在于动物和植物基因组中。预计有超过一半的人类转录组是受 miRNA调控的，几乎每一个串联基因都嵌入了这种转录后调控途径。鉴于这种 具有深远意义的作用，miRNA的破坏作用有助于包括癌症、心脏疾病和神经系 统功能紊乱等人类疾病是不足为奇的。此外，miRNAs将发展成为靶向和疗法， 进而实现产业化，以希望通过驾驭这种RN

3、A引导的基因调控力量去对抗疾病和 感染。miRNAs以2124个核苷酸发挥作用，它们调节含有互补序列的mRNA的基 因表达。图1显示了一般的miRNA的生物合成途径，并且这个典型的途径在其 他地方也得到了全面的检验。最后，成熟的miRNA结合AGO蛋白形成一个 miRNA诱导沉默复合体(miRISC)。在动物中，miRNA与mRNA位点的部分互补 可以通过包括mRNA降解和翻译抑制等一系列机制导致蛋白表达的减少。最初， 在植物中miRNA的功能非常明显，它们可以与靶基因完全碱基互补，进而导致 靶基因的分裂和降解。然而，最近的研究显示植物可以通过翻译抑制途径沉默靶 基因，并且还有待确定到底有多少

4、植物mRNA通过与miRNAs部分互补进而受 到调控。此外，在所有有机体中，如果有催化活性的AGO蛋白结合，miRNA与 靶向位点的完全互补可以导致靶基因降解。本综述重点在于确定内源性miRNA靶基因的复杂性和它们是如何调控的。 新近发展的全基因组方法，比如紫外下的交联免疫沉淀反应CLIP)，对于确定内 源性的miRNA结合位点有着推进作用。此外，像核糖体分析等技术都可以用于 解析受miRNA作用的基因调控途径。这些前沿的方法已经揭示了 miRNA靶向 全基因尺度的新特征，并且还为进一步探索体内miRNA对靶基因的识别和调控 的规律提供了丰富的数据。然而，预测内源体内一个mRNA是否受miRN

5、A调控 却是另一个挑战，因为目前已经有许多例子显示有许多因子能调控miRISC去结 合并抑制特殊的靶基因。miRNA和靶基因调控的新发现的相互作用性质又使其 复杂性增加，这种关系也必须在miRNA靶向作用关系全面解决之前得到理解。注：miRNA 诱导沉默复合体(miRNA-induced silencing complex, miRISC):它 由 miRNA 引 导体和效应蛋白组成，其中至少包括Argonaute蛋白(AGO蛋白)。这个复合体募集其他蛋 白来调控靶向mRNAs的平衡和翻译。交联免疫沉淀反应(Crosslinking immunoprecipitation , CLIP):是一

6、种分离和鉴定由特殊的RNA结合蛋白所结合的序列的方法。miRNA复合体蛋白(如AGO蛋白)的交联免疫沉淀 已经被用于检测全基因组水平上的miRNA诱导沉默复合体的结合位点。图1 miRNA的生物合成。在动物体内，microRNA(miRNA)基 因转录为初级 miRNA(pri-miRNA)转录本，通过Drosha酶复合体作用形成具有发夹结构的miRNA前体 (pre-miRNAs)。pre-miRNA然后由转运蛋白5(XPO5)转移到细胞质中。Dicer酶复合体将 pre-miRNA的环状结构切除，形成的双链体的一条链被AGO蛋白结合形成miRNA诱导沉 默复合体(miRISC)，miRIS

7、C靶向调控mRNA。常被称作星链(miRNA*)的另一条链被降解。 在植物中，除了 Dicer样蛋白(DCL)在细胞核中完成切除阶段和通过结合AGO蛋白形成成 熟的miRNA并转移到细胞质中，其他过程也基本相似。在本综述中，miRNA的靶向位点和内源靶基因的鉴定将被首先讨论。接下 来，通过几种精确定位靶基因的方法阐明靶向调控机制。最后探讨新提出的 miRNA和靶基因的相互作用关系，miRNA的调控作用也将包含其中。miRNA靶向位点在miRNA领域，miRNA如何识别部分互补的特殊序列是一个突出的问题， 这也使得靶位点的预测更加复杂化。鉴于匹配miRNA和特殊靶序列的挑战，已 经有几种方法被用

8、于鉴定它们的相互作用。miRNA靶向位点的特征。miRNA的小尺寸提供了数量有限的特异性序列信 息。此外，因为miRNA和靶位点的部分结合常常是充分的，所以一个广泛的基 因网络可能受到调控。这种特性不仅意味着单个miRNA可以调控多个mRNA， 也说明了预测这些靶点不是简单的直接关系。在植物中，基因的外显子和3非 翻译区(UTRs)都是靶位点，并且调节的效率与靶位点的位置没有相关性。植物 miRNA可能既能和靶基因形成近乎完美的双链结构，进而使mRNA通过内切核 苷酸裂解(图2a)；也能通过不涉及裂解的途径调节靶基因，但不包括严格互补配 对的情况。裂解产物可以被克隆和鉴定，进而可以证实直接的m

9、iRNA靶向关系。 这已是一个有成效的用于发现植物中真正的miRNA靶位点的方法。缺少大量miRNA配对能力的靶基因将不会受到裂解，这种靶基因在植物中正在被探寻。在动物中，大多数miRNA只能与靶基因形成部分互补的双链体，并且到目 前为止的研究中发现大多数靶mRNA是通过3 UTR作用受到调控的。miRNA 和靶位点近乎完美的互补进而导致mRNA裂解仅有极个别的例子，比如miR-196 和HOXB8 mRNA的一个序列。然而，大多数情况，涉及的是不匹配和大多数核 苷酸凸起的双链体。最常见的作用元件在miRNA5末端完全配对的2-7个核苷 酸，这被叫做“种子”区（图2b）。在不少实验研究中发现，

10、种子配对是miRNA 途径调控的充分必要条件。miRNA5末端与靶基因的不完全配对有时可以得到3末端大量配对的补偿，这可以从致死因子7（let-7）miRNA靶位点在线虫的非正 常细胞系41（lin-41）得到印证（图2c）。最近的研究发现，“中心位点”已经被 描述，miRNA的中间区域可以与靶序列连续碱基配对（图2d）。也有许多例子 与这个描述不一样的（图2e）。动物体内中miRNA这种明显的靶向作用灵活性暗示了作用因素不仅仅只是配对调控。5UTKC CcienorhalMiitis eiegansS UTR 四岫驴UTRSCL6-ttl exon 5 gGAUAUUGG CGCGGCUCA

11、AUCAC VmiR171 r CUAUAACCGCGCCGAGUUAGU 5ftn-41 rUTRmiRNA. L JlKrAtTAAACC_ GAUAUGUUGG GMTGr(JUAITCUCA3gagu5bAn-14VLJTR|_ CodiiKiI!En-I4rUTRlirii 4 miRNAe Mos musculus Oct4d Human Jlaptar5LTR匚心 dingRaptor 3 r.JTRER-m 3,心gLLCCCJCACCGCGUGCC GUGGCGCACGG AA AAUr?5UTR | SdinqrUTROct4 exon saacuc ccgag g AGU

12、CCCAjGGAr ,-UGAGGC UC UCAGGt VCUU., d U A G U ， 0图2 miRNA靶向识别位点的例子。miRNA不同程度的碱基配对介导的靶向识别。a：在植物中，miRNA往往与靶位点几乎完全配对。例如，在拟南芥中，miR-171 （也被称为miR-39）通过在编码区与一个位点完全互补调控稻草人样6III（SCL6-III）mRNA。b：在动 物中，miRNA与靶位点部分配对是比较典型的。一般miRNA只有2-7个碱基与靶基因完全 配对，这个区域叫种子区，是一个常见的作用元件。在线虫中，lin-4miRNA可以识别非正 常细胞系14（lin-14）mRNA的3非翻

13、译区（UTR）的一个位点。Lin-14 3UTR下面的线 条表示其他lin-4靶向位点，不是所有都是种子配对。c：有时，种子区完全配对的缺失会受 到miRNA 3末端大量配对的补偿，线虫中的lin-41 3UTR的一个位点与致死因子（let-7） miRNA配对可以印证。一个额外的let-7靶位点正好在下游可以形成双链体。d： miRNA种 间序列与靶位点的配对也可以介导基因调控，比如人类Raptor基因与miR-124。e：动物 mRNA通过编码区受调控的也有记录，在这些情况下，靶位点跨越外显子连接点，例如老 鼠中Oct4 （也被叫作Pou5f1）与miR-470配对。鉴定靶基因与miRNA

14、的结合位点的方法。鉴定miRNA的靶基因和调控的序 列的复杂问题已经被多元互补法解决（框1）。第一个被发现的miRNA靶基因是 miRNA功能缺失型的基因抑制子（框1 a）。基于miRNA通过碱基配对作用调控 mRNA的早期证据，许多电子计算方法也相继发展来预测miRNA靶位点。某些 特征，比如在非结构化的AU丰富区的保守的种子配对，已经形成潜在miRNA 靶位点的知识点（框2b）。尽管如此，大多数算法对于部分互补miRNA靶位点 的预测都有显著差异，假阳性和假阴性难以区分。计算机预测功能的miRNA靶位点的诸多挑战之一是受限于miRNA靶相作用 中的内源性方面的验证。通常情况下，通过融合序列

15、的靶标预测包含在存在或缺 乏同源miRNA时靶点的报告基因和调控分析。在这里，正常的调控环境一一包 含mRNA水平和细胞水平已经丢失。但是，现在可以通过miRISC的免疫共沉 淀测序鉴定内源性靶位点，免疫共沉淀可以通过利用高通量测序技术CLIP （CLIP -seq，或者HITS-CLIP）实现（框1c）。这些研究提供了大量数据支持miRNA 靶位点的种子配对、保守性和结构性共同特点。尽管如此，他们还指出新的因素， 如比原先认为的更大的miRISC与编码外显子的作用，以及存在着许多其他的的 结合位点CLIP的一个局限是不能利用其他实验鉴定结合位点的功能。比较CLIP 结果的数据直接分析mRNA

16、或蛋白水平的改变，还需要判断是否miRISC与靶 基因的结合会抑制表达。这可以由全基因组水平上通过转录组芯片分析技术或 RNA测序技术（RNA-seq）和蛋白定量得以实现，比如在细胞培养中利用同位 素标记氨基酸（SILAC）。miRNA的靶向调控用来调节通过miRNA的靶基因的表达机制一直是一个有争议的问题，因为 那里是靶mRNA不稳定，平移镇压，甚至激活基因表达的证据。在植物和动物 中，miRNA能够通过RNA降解的目标，以及翻译抑制通路沉默。其目标网站的 miRNA的完美配对支持endonucleolytic AGO蛋白（图3a）的mRNA裂解。这 是一个共同的机制，但植物是罕见的动物。尽

17、管如此，通过其他机制的靶mRNA 不稳定，是在动物的miRNA调控的共同结果。miRISC，其中包括GW182蛋 白，3UTR靶序列的结合可以导致在招聘腺苷因素删除的poly（A）尾巴的mRNA 容易降解（图3b）。也有植物和动物的miRNA导致减少蛋白质（但不表达）的 水平，这表明平移镇压miRISC执导的案件。阻止蛋白质的生产是不清晰，有实 际的机制是抑制翻译起始或伸长率，以及定向正在从目标mRNA （图3c，d）合 成肽的蛋白质的证据。最近的工作表明，由GW182招募，靶mRNA的CCR4, 并不复杂，也可来抑制翻译起始（图3c）。为了使问题更复杂，在某些情况下的 miRNA目标tran

18、sla的刺激也有报道。例如，的miR-16的目标为myt1激酶的 mRNA与Argonaute蛋白和脆性X智力的迟缓蛋白1 （frx1），激活其在爪 laevisoocytes表达（图3e）。总体而言，通常的miRNA抑制基因表达，并积极调控目标是否超出延长有限的情况下，迄今已发现，仍有待观察。1 Enrimu匚 |照日腼5耳d lrihlbtfun ifjrulaElan inlElElon-c IntilM-ls M trn山 Ms InMWgn图3 miRNA的靶向调控机制。microRNA（miRNA）通过多种途径调控基 因的表达。一系列的真核细胞起始因子（eIFs）结合5帽子区和细胞

19、质的poly （A）结合蛋白（PABPC），连接mRNA的5和3末端并通过核糖体（粉红色） 刺激它们的翻译。a | miRNA和其靶位点之间的完美配对诱导Argonaute蛋白 （AGO）的核苷酸内切酶酶切，导致mRNA的快速降解。b| miRNA复合体与 靶基因3非翻译区（UTR）位点的部分配对可以导致mRNA的脱腺苷化，这个 过程是通过miRNA诱导沉默复合物（miRISC）相关联的GW182蛋白募集 CCR4-NOT复合体得以实现的。poly（A）尾巴的缺失会导致PABPC分离并诱 导mRNA的降解。c | miRISC也能通过GW182对CCR4-NOT复合体的募集阻 断翻译起始进而导

20、致翻译抑制。d|miRISC也可以在翻译起始之后的某一步诱导 翻译抑制，比如促进核糖体脱离或刺激新生肽的蛋白质水解。e |在一定条件下， 通过一种涉及AGO蛋白和脆性X记忆迟滞蛋白1（FMR1）的机制，miRNA被 证明也能上调靶基因的表达。框2对鉴别靶向调控的不同机制的方法进行了总结。简言之，方法有传统的 集中化验mRNA水平。然而，它也是重要的调查的poly（A）尾巴的长度，以 确定案件中腺苷诱导的miRNA，但靶mRNA不退化。的首次大规模尝试分析蛋 白表达或协会与核糖体转录miRNA的依赖性变化表明，在很大程度上与mRNA 不稳定的相关法规。核糖体分析的最新发展（框2b）提供了一个敏感

21、的方法研 究与翻译抑制RNA的降解作用。在培养的哺乳动物细胞的核糖体分析，增加了 进一步的证据，由miRNA的调控主要是通过基因不稳定，反对翻译抑制。这是 否是在其他细胞的背景或mRNA的降解或翻译抑制是否是一个原因还有待证明。框1鉴定miRNA靶点的方法匚口刀早汁弟EUOUc Crosslmked RNP isolated with anti-AGO antibodies此Trimming rd purification of AGO-bound RNAs |Linker ligation and RNA purificationReverse transcription PCRcDNA o

22、f target and r-iiF sequenceSequenciny and rniipping to yeno me多年以来，许多方法已被用于miRNA的靶基因检测，涉及范围从小尺度 的遗传学研究到计算机预测和高通量生物化学方法。遗传学方法这种方法识别miRNA靶基因通过表型的抑制试验。通常情况下，先筛选候选基因， 获得一个miRNA的功能缺失型。例如，致死因子7（let-7）突变体线虫，发现异常细胞 突变细胞系41（lin-41），表明lin-41是我们的目标，let-7的miRNA （如图a）。miRNA 的突变株，受到传统的诱变或RNAi抑制筛选。靶基因的miRNA突变的背景下，

23、通常上 调。因此，基因突变或导致基因的表型的部分或全部抢救击倒表明，该基因突变的miRNA 的目标。这种方法的一个重要优势是基因确定的目标，是一种生理相关基因的miRNA调 控。这些遗传分析的问题，包括无法区分直接和间接的miRNA的目标，并在检测许多目 标作出贡献的表型的个体抑制潜在的困难。计算方法计算方法依赖于将纳入的候选人子目标识别不同标准的算法。他们大部分人，但是， 使用一套共同的实验派生结论出现假阳性预测（如图b）减少。其中包括一项要求完美配对 之间为子5区的Watson-Crick和mRNA目标序列，尤其是对核苷酸2-7,称为子“种子”。 预测目标列表中可以进一步提炼与养护标准的使

24、用。二级结构的3非翻译区（UTR）在目 标站点的可访问性定义的站点，附近的AU内容通常用于作为标准子目标预测。虽然这 些一般准则已成功预测很多子目标站点，例外的是的普通的种子配对，自然保育或非盟 上下文不用于靶向功能。此外，另外，计算预测经常测试记者外源基因融合目标3 UTR 中，留下了疑问的预测的网站天然的基因与细胞设置中的函数是否上下文中的监管能力。 生物化学方法生化方法，用于标识子目标时往往生物信息学分析，也同时提供一定的优势。其中包 括敏感性增加和内源性识别能力目标mRNA成绩单或甚至在大规模mRNA的目标序列。 较早的方法依赖于免疫纯化核糖核蛋白（miRNP）配合物，相关联的mRNA

25、s，跟着有针对 性的谈话内容与芯片鉴定的分离。较新的方法，例如紫外光交联和沉淀耦合到深测序 （CLIP-seq）或紫外光交联和沉淀（HITS-CLIP），加上高吞吐量测序瞄准隔离中内源性 RNA，瞄准的miRNAs和，充分利用新开发的新一代测序平台，提供有针对性的序列如 图c）的核苷酸水平分辨率序列。完整动物、组织或细胞蛋白质组照射紫外线，哪些新跨 界通道和稳定蛋白-RNA的相互作用。免疫纯化miRNPs被跟着降低不受miRNP组件； 的RNA片段核糖核酸酶处理步骤受保护的RNA片段，包括相关联的miRNAs，将隔离， 转换为cDNA和受深测序及生物信息学分析。此剪辑方法的变体的培养条件，这会

26、导致 在站点的交联；单核苷酸突变中包括照片可激活磷酸类似物（如4-thiouridine ）的加法这 个突变可以用作的成功交联的位置标记。这些生化方法产生内源性子目标和潜在他们直 接绑定网站的全基因组数据集。然而，miRISC仅受约束的mRNA检测并不能保证它实 际上接受监管，也没有又呈现出潜在的控制机制。AGO蛋白一Argonaute蛋白。靶向调控的效率在内源环境下，许多因素都能影响miRNA复合体结合并调控特定靶基因的 能力。靶位点的环境与miRNA提供的有限序列特异性，其他因素肯定会影响体内的靶向定位。 已与目标站点内的mRNA的位置以及它是如何识别和miRISC调控。一个的 3UTRs

27、疗效与目标相关的功能，是目标网站的位置。AU丰富区和一般非结构化框2研究miRNA靶向调控的方法。RNA表达分析由于microRNA （miRNA）经常促进靶mRNA不稳定，降低mRNA水平可能直接 miRNA调控的结果。Northern杂交或定量PCR可以用来分析特定的基因。全基因组研 究，用来比较的存在和缺乏具体的miRNA微阵列和RNA测序的mRNA丰度的变化。 腺苷往往是miRNA介导的目标调控的一个特点，这可以通过聚（A）尾长度分析，使 用核糖核酸酶H裂解mRNA的3Northern杂交或PCR为基础的方法比较腺苷酸化州结 束评估。这些方法可以表明，预测的目标是在mRNA水平的调控。

28、然而，故障检测mRNA 丰度的变化，不排除它作为一个目标，为miRNA的复杂，也可以使用机制，以阻止蛋 白的表达，不涉及基因不稳定。蛋白表达分析通常情况下，miRNA靶向调控的最终结果是减少蛋白的表达。免疫印迹蛋白水平的 变化衡量的具体目标是最简单的方法。通过质谱较大规模的蛋白丰度的分析是可能的。 这种方法直接量化一次数以百计的蛋白质，但它是目前检测低丰度蛋白，miRNA的控 制下，也可能是不够敏感。化验蛋白生产间接法是通过核糖体的分析，其中的mRNA 与核糖体的关联，表示他们的翻译状态。在核糖体分析，个别核糖体相关的基因片段， 是确定的。不仅可以改变核糖体协会检测核糖体分析，但在核糖体与mR

29、NA的实际位 置显示。因此可以表示停顿翻译起始，核糖体mRNA的5端的积累。由于miRNA的已 启动和启动后的步骤规范翻译，核糖体分析是为确定个别基因调控机制的强大方法。地区似乎加强无障碍的miRNA复杂。此外，目标网站往往以避免序列后，立即 翻译终止密码子，核糖体的影子会落入约15nt之前，它从mRNA的游离核糖体 的约束终止密码子下游覆盖的区域。此功能良种IES表明核糖体干扰针对翻译序 列的miRNA （图4a）是一致的。尽管如此，计算和生化实验表明，相当一部分 miRNA的目标网站存在的开放阅读框（ORF）序列。例如，近一半的AGO蛋白 时限确定在哺乳动物细胞和蠕虫提取物被夹检测网站驻留

30、在编码外显子序列。是 否有效地诱导镇压这些网站尚未显示。在一项研究中，ORF的目标网站，通常 会发现自己要少，虽然可以提高也所载3 UTR靶位点的基因调控。因此，另一 个要考虑的是如何影响调控的miRNA靶场所内的mRNA数量。一般情况下，增 加相同或不同的miRNA靶位点的数量，提高监管的有效性。然而，当两个目标 点几乎重叠，效果是不可预知，协同作用，以及作为对立的实例已报告。环境的 功能可能有助于解释在miRNA结合在不同的基因相同的目标网站的变化。因此， 所有这些顺式作用的功能是重要的考虑因素时使用记者构造，以确定如何以及目 标识别miRNA途径调控。RNA结合蛋白RNA结合蛋白（RPB

31、s）与靶mRNA关联，可以干扰miRISC结合或功能。HuR （也称为ELAV1）是一种广泛表达的RPB，结合AU丰富的基因序列，通 常是保护他们免受退化。HuR对CAT1（也称为SLC7A1）抑制miR-122的表达 效果是RBP的直接miRNA靶调控的第一个例子之一。这项研究表明，在人肝癌 细胞的正常条件下，miR-122的抑制结合在其3 UTR和封存在P机构的mRNA 位点的CAT1 mRNA的翻译。应力条件下，如氨基酸饥饿，从P机构的CAT1 mRNA的移动回翻译池，这是伴随着增加蛋白表达。这是介导的miRNA的诱导 抑制HuR，但一定压力条件下诱导HuR重定位局部化的细胞质中，它可以

32、结合 AU丰富的CAT13UTR序列。HuR结合位点，是数百个核苷酸下游三miR-122 的目标的CAT1的3 UTR序列。尽管如此，HuR的CAT1与废除miRNA介导的 基因通过一种机制，是尚未确定的沉默。这HuR的影响并不局限于miR-122的 调节，还回答了记者包含其他miRNA靶网站只要HuR，因为它们所含的非盟丰 富的序列，限制性商业惯例的约束。一种可能性是，允许接触扰动要么miRISC 约束力或能力来调节的mRNA的3 UTR结构可能带来的miRNA靶位点附近 HuR。HuR的miRNA靶向疗效的影响可能是广泛的。最近两次的CLIP研究发现数 百的HuR结合位点相邻或重叠与重读培

33、养细胞中的miRNA靶点。总体而言，与 AGO蛋白结合序列的3UTRs大于75%，还含有HuR互作的位点。有趣的是， 只与miRNA的靶序列重叠的的HuR位点似乎对抗miRISC调控的mRNA水平。 HuR位点miRNA的靶序列是从遥远的基因缺乏一个功能性的结果可能意味着的 CAT1是HuR罕见的例子，远程工作。另外，这些网站的影响可能被低估，如果 更强烈一些目标在翻译水平的调控，如果HuR破坏了这种机制。这种可能性是 找到了 miR-122的CAT1抑制，主要是通过抑制翻译起始的支持。因此，HuR 可能会干扰与miRISC功能的不同层次，取决于靶mRNA的结合位点的范围内。HuR似乎有双重作

34、用，在调节的miRNA抑制特定目标的能力构成。在对比 其miRNA介导的抑制的CAT1，HuR-MYC基因3 UTR的结合是必要let-7b的 镇压这一目标，let-7c的miRNA （let-7b/c在共同称为拮抗作用。这在HeLa细胞 中的一节）。HuR结合非盟丰富的序列是相邻let-7 b/c的目标网站，这种互动似 乎是必要的，let-7b/c与Ago2MYC基因mRNA募集。言下之意是，HuR有助于 揭露let-7b/c的目标位点或稳定miRISC协会与MYC基因3 UTR。鉴于这种合 作的例子，共存HuR和miRNA结合位点可能包括额外的目标，在HuR积极影 响miRNA途径调控基因

35、。Deadend 1 （DND1）是RBP的miRNA介导的镇压的具体目标，提供优惠减 免。在DND1识别内源性靶基因的序列的miR-430结合位点附近，似乎减少到 miRISC无障碍的靶点（图4b），如tdrd7在斑马鱼。DND1自然表达在脊椎动物 的原始生殖细胞（PGCs），所以它提供了一个可能的解释与miR-430位点如何逃 脱这种原始生殖细胞中的miRNA的抑制，但不能在体细胞在斑马鱼早期发育过 程中。miRISC的调控几个蛋白质TRIM-NHL的家庭成员直接关联与AGO蛋白和调节能力miRISC 抑制靶基因的表达。这些蛋白质中含有三方序（包括环型，B盒锌指和卷曲螺旋 域）耦合到一个N

36、HL域，HT2A （也被称为TRIM32）受体蛋白质的创始成员， 被命名为：NCL1 （又称钙蛋白酶3）,和LIN41 （也称为TRIM71），其中不少 是已知含有E3泛素连接酶的活性。表明，miRNA的复杂本身LIN41控制下的 发现，鼠标TRIM-NHL的蛋白质LIN41，目标AGO蛋白泛素化和蛋白酶体介导 的退化。减少AGO蛋白水平的结果损害miRNA靶基因的调控和miRNA的水平 下降，协会与RISC促进miRNA的稳定。因为LIN41本身就是由let-7的miRNA 的调控，这是一个复杂的监管电路，使LIN41拮抗AGO蛋白的稳定性的一部分， 和let-7的miRNA的直接抑制LIN

37、41表达。减数分裂因子P26 （Mei-P26）是另一个TRIM-NHL的亲蛋白，抵消了 miRNA 途径。最初命名为在减数分裂中的作用，Mei-P26是需要适当的雌性果蝇生殖细 胞的增殖和分化。这种表型至少部分是由于多动症的Mei-P26突变的miRNA途 径。此外，Mei-P26联合免疫与AGO1，这是AGO蛋白，miRNA在果蝇（图4c） 功能主要是负责。它还有待证明，无论是Mei-P26作为一个E3为AGO蛋白连 接酶或是否通过另一种机制，以减少miRNA的功能和水平普遍行为。相比之下LIN41与Mei-P26，TRIM-NHL的其他家族蛋白正调控miRISC功 能（图4c）。遗传和生

38、化证据指向一个NHL-2 miRNA的焦油调控线虫的疗效的 刺激作用。NHL-2的损失削弱了一定的miRNA靶基因的镇压，不影响miRNA 表达水平。在除了核心miRISC蛋白质，包括AGO蛋白（线虫中的ALG-1和 ALG-2）的互动，NHL-2结合解旋酶CGH-1（RCK和P54在人类已知的果蝇， ME31和在酵母Dhh1）。以前的工作有牵连全息-1同源的miRNA途径，提高 NHL-2刺激的功能，这种蛋白在miRNA的目标镇压的可能性。TRIM-NHL的 蛋白质TRIM32的miRISC功能的另一个积极的调节。，TRIM32在小鼠神经前体 细胞促进部分通过激活的let-7 miRNA的分

39、化。TRIM32合作AGO1和浓集， 包括let-7的miRNA的析出。通过一种机制，是尚未确定，TRIM32增强let-7 的介导的镇压。TRIM32具有E3连接酶的活性和无处不在的尖吻鲈MYC蛋白， 促进其降解。由于MYC的间接抑制let-7的表达，通过LIN28 TRIM32增强我们 在多层次-7活动。目前，还不清楚是否的上影响miRISC镇压功能要求在TRIM32 或NHL2的E3连接酶的活性。除了泛素化，AGO蛋白是受一些其他类型的法规修饰（图4d）。AGO蛋白 的稳定性，可调节-4-羟基脯。人类细胞中，I型胶原脯-4-羟化酶（C-P4H（I） 修改在AGO2脯氨酸700。在缺氧条件

40、下，表达的C-的P4H（I）增加，导致修 改AGO2和稳定的蛋白质。AGO蛋白翻译后修改的调节的miRISC功能。人类 AGO2可以在多个位置被磷酸化，虽然尚未确定的因素，促进这些修改。一个 AGO2地区作为一个小分子RNA的5端结合口袋的一个保守的酪氨酸磷酸化的 网站地图。磷酸化可能是导致结合miRNA的能力下降，这意味着可以通过磷酸 化调节的小分子RNA的AGO蛋白的加载。另一种类型的修改，可以阻碍AGO 蛋白的功能是聚（ADP-核糖基化）。在哺乳动物细胞培养，各种应激条件刺激特 定的聚（ADP-核糖）聚合酶（PARPs）AGO1-4的修改。如何聚（ADP核糖） 干扰前开始抑制靶基因的表达

41、能力，目前是一个谜。Enhanced targeting efficiencytdrating efficiency图4 miRNA靶向调节的效率microRNA（miRNA）复合体识别和调控mRNA的功能，会受多种因素的影响。a I miRNA诱导沉默复合体（miRISC）结合并调控的效率在3 UTRs 区的靶位点比编码区的要高，在这里翻译核糖体可以使包含部分碱基配对的miRNA等复合 体的动摇。bl RNA结合蛋白（RBPs），如Deadend 1蛋白（DND1），可以使miRNA靶点 免受miRISC结合。c |与miRISC关联因素可以促进（NHL2）或抑制（减数分裂因子P26 （Me

42、i-P26）靶向结合与调控。d |通过稳定蛋白（脯氨酰-4-羟基化）AGO蛋白的修饰可 以提高靶向效率，相反通过结合小分子RNA （P，磷酸）、促进蛋白不稳定性（Ub，泛素） 或干涉靶向接触（聚核糖基化）等降低AGO蛋白的活性会减弱这种能力。靶基因与miRNA调控的相互作用最近的研究工作表明miRNA途径中的调控是一个双行道。不仅miRNA与它 的靶基因配对导致抑制靶基因的表达，并且这些相互作用可以影响miRNA的水 平。靶基因影响miRNA的稳定性AGO蛋白似乎是一个miRNA的稳定因素限制。增加任何人类细胞中的结果， 在一个成熟的miRNA水平的普遍上调四个AGO蛋白的表达。同样，损失的，

43、 专门到线虫中的miRNA功能的AGO蛋白，ALG-1，结果在miRNA的丰度减少。 这种效果至少部分解释由ALG的能力，以保护从5-3结合的miRNA外切酶 XRN-1 和 XRN-2 （图5a）。此外，这种保护作用依赖于miRNA的目标站点的可 用性。线虫中，记者通常卑微的表达miRNA的互补位点提高自己的积累。这个 目标介导的miRNA保护（TMMP）意味着，一些miRNA水平可与配对基地的 目标网站是密切相关的。奇怪的是，目标序列的相互作用，还可以刺激miRNA的退化。它已被证明 在果蝇和人类细胞中，miRNA和目标站点之间的广泛的配对，可以诱导3末端 修剪的miRNA，这是经常由增设

44、非模板（图5b）。在82的miRNA的3末端。 此外，多种蛋白质已被牵连，但尚未确定特定的酶是负责修改是基本目标网站配 对的miRNA。尿苷此外miRNA的3末端，但有时并不总是导致他们的不稳定。 更近的动力学研究表明，要么完全配对或两个核苷酸膨胀的目标网站的记者介绍， 加速了腐烂的人体细胞中同源的miRNA，并在这两种情况下，这是一个单一的 尿苷3此外的miRNA。衰变率是衡量一个更快的目标是能够完美结合的miRNA 碱基配对，配套程度的互补性和目标miRNA的稳定效果之间的关系。调节能力的miRNA通过碱基配对的相互作用稳定已篡夺病毒。疱疹病毒编 码7个U丰富的非编码RNA-所谓HSURs

45、-区域包含互补的三种灵长类动物的T 细胞的miRNA。所有这三个miRNA的联营公司，但只有在体内的病毒RNA的 miR-27A与HSUR1通过其相互作用不稳定。虽然下调miR-27A的单纯疱疹病毒 （HSV）感染的细胞与一些已知的miR-27A的目标，这得益于该病毒尚未阐明 水平的提高密切相关。miR-27A的具体退化可能与较高的互补程度之间的 miR-27A和病毒RNA，比较网站是由其他两个miRNA确认。即便如此，预计将 形成配对的miR-27AHSUR1只有部分双工。在碱基配对的要求为目标网站的灵 活性，以诱导的miRNA降解是从果蝇提取物，多达七不匹配仍然可以诱导部分 互补的miRN

46、A修剪的体外实验中也可见一斑。多久的miRNA配对内的目标网 站不稳定的结果-这通常包括几个不匹配和膨胀核苷酸尚未确定。靶基因影响miRNA的功能正如miRNA靶基因的表达，可以通过比其他基因不稳定的机制压抑，miRNA 的活性可以抑制靶相互作用不一定导致在miRNA水平的变化（图5c）。被发现 在拟南芥磷饥饿反应路径单向的自然影响一个miRNA的调节能力，另一个目标 的目标的第一个例子。当植物的无机磷，miR399水平的提高，假定泛素结合酶 E224（PHO2的）靶mRNA，其中包含多个近乎完美的miR399互补的网站的分 裂，导致被剥夺。另一种是在磷饥饿诱导的RNA是由磷饥饿（IPS1）诱

47、导的ncRNA 的。作为各级IPS1上升，PHO2的退化衰减，因为miR399活动将被重定向到目 标网站在IPS1。双工之间IPS1RNA和miR399在不匹配，防止分裂的中心地区。 这种目标网站的类型允许IPS1的坚持和封存从其他目标的miRNA。由于这一发 现，利用“目标模仿”已作为一个强大的工具抑制体内特异性miRNAs的活动。 在植物中，已设计包含非裂解miRNA的目标，网站的RNA可以滴定多个miRNA 的类似序列的功能，有效地消耗miRNA的家庭，以测试他们的生物学作用。例 如拟南芥miR156家族，其中包括10个高度相关的miRNA，非裂解目标位点， 在植物的叶子少，表型，是相反

48、的植物过量表达miR156。为普通的miRNA的目标之间的竞争可能会广泛影响个人目标的miRNA调控 的效力的想法，已分最近的研究在动物细胞中乱舞。在哺乳动物细胞中，磷酸酶 和张力蛋白（PTEN基因）的肿瘤抑制功能是极其敏感的剂量。一个计算搜索的 RNA能够充当诱饵的PTEN基因的miRNA，从而可能影响其表达水平，导致了 超过100个蛋白编码基因，分享多个miRNA的靶标位点与PTEN的候选人名单。 凭相同的miRNA靶位点，这些相互竞争的内源性的RNA（ceRNAs）相互调节 彼此的表达。因为从这个抑癌基因PTEN的ceRNAs滴定压制性的miRNA，他 们代表在癌基因网络的新的候选人。锌指E盒结合同源2（ZEB2）验证作为一 个PTEN等CERNA。以往的研究表明，ZEB2是一种转录因子，抑制上皮细胞 的分化状态所必需的基因，并可能在某些癌症的致癌作用。因此，mRNA和蛋 白ZEB2可以在某些情况下有冲突的生物学功能。蛋白质编码的miRNA表达在人脑胶质瘤型材的大型分析导致CON结论的， 数以千计的成绩单可作为目标诱饵行事。几个与癌症相关的基因，包括PTEN基 因，嵌入的基因，可以交叉滴定共同miRNA的活性调节彼此的网络。因此，多 个ceRNAs的组合效应，可以有一个基因表达和细胞表型的产生深远的影响。一个含义是先前所描述的研究，RNA，m