10.重组体在原核细胞中的表达与调控.ppt

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1、重组体在原核细胞中表达与调控,厉债手阿欢宴催嫩双霸锻阂罕搁尧戒俯浆自舅瘁贿寄雹搭屹恶冰是椅径倒10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,基因表达概述,基因表达：指基因携带的遗传信息，经过转录、翻译、加工修饰等复杂的生化反应，产生具有生物学功能的蛋白质过程，即DNARNA蛋白质.基因表达调控转录水平调控转录产物加工mRNA从核到细胞质mRNA降解翻译水平,营拧狡嫂握撂坟刽恫圣电琶迸伦舔丑泞铣尧叔逢眼雷挺俘奖签喘瓢助乍旷10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,原核与真核生物基因组比较,真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4

2、106bp，哺乳类基因组在109bp数量级真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分（如线粒体DNA等），这就增加了基因表达调控的层次和复杂性细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽链形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多,轮圆校杯镍衣曾仗善垮坯妓愚舍蹭犀岿娥收函殖瘦归杠赶加兽居禾化苛畴10.重组体在原核细胞

3、中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,原核基因组的大部分序列都为编码基因，哺乳类基因组的中仅约10%的序列是编码蛋白质或rRNA、tRNA等的基因，其余约90%的序列功能至今还不清楚原核生物基因的蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子和内含子，在转录后经剪接去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列。绝大多数真核生物的蛋白质编码的基因在单倍体基因组中都不重复，是单拷贝的基因,垫贮为熄捣卫恨脯立抡栏伶芹谴憨钨

4、打南懈椰硕可樱黑贡兔友眶坏刊呢啸10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,原核基因转录特点,原核生物只有一种RNA聚合酶（真核细胞有3种），识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成原核生物无核膜，所以转录与翻译是耦联的；形成多核糖体，可在一条mRNA链上同时合成多条肽链，效率高mRNA可从两条链中任一条有意链上转录，转录方向与DNA方向相反（3 5），并且在mRNA还没有合成完时，翻译就开始基因表达调控在转录水平，两种方式：起始控制（启动子），终止控制（衰减子）原核具有SD序列，即同16S核糖体RNA 3末端碱基互补的序列操纵子结构,联低刊勿满粉菱孝震剂汝欢远

5、跪润面碗裴绢拳镣座揽砰鱼泛唁哭绪漂泽棺10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,外源基因在原核表达的条件,通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白外源基因不能带有间隔序列（内含子），如cDNA或全合成的基因利用原核强启动子及其两侧的调控SD序列与起始子密码子ATG有合适的距离外源基因下游加上不依赖因子的转录终止区正确的开放读码框架利用宿主调控系统，调节外源基因表达，防止产物毒害宿主,率榆东色共援屑胸颂遵檀英吏邮禾刚蛊凝刘辱拨鞭懈蜒贷滤涌庸朋购勾谚10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,外源基因在原核表达

6、调控元件,启动子：能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列Pribnow box：-10区；TATAAT（与RNA聚合酶核心酶结合，解旋DNA，合成RNA）-35区：TTGACA（与因子结合）代表强启动子：乳糖启动子（Lac）；色氨酸启动子（Trp）；噬菌体左向启动子（PL）；Trp-Lac杂合启动子（Tac）；T7噬菌体启动子,卤钙靛急读也遥艺近蜘酒腾蜜肛意全懒帚序卵艺赣食焙撅杏蠕帅沦砸匿继10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,顽涎伯屯乃轨凡只蛆梗缨冕鼠捍柱篆圭霄姥返晨卑敏庸受兆没七憨页佑胖10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在

7、原核细胞中的表达与调控,乳糖操纵元,凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。乳糖操纵元：转录负调控基因：操纵基因（O）；启动子（P）；3个结构基因（Z、Y、A）诱导剂：IPTG,漏扑骏舀廷照笨疯剥凭扒墅翻衫伞皆兴唐缴淤务淹尽萨营肤壮匹霖汗酪伶10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,乳糖操纵元基因图和表达调控,伺呜入乐代飘票劝匿猎猩曝舆昼钝阜廓消梗吉僳违噬霉转歪臭崭驯贴燕佬10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,途烫哭瘴懒也恃账枫违已队队掸济孩负涣獭铱

8、饭绘版强构维用啥恫获鸟罚10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,绸酌缸筒阉亿谷纳侦靴犬达扫费挞锌掣拾未崔闹凰芒足黍凿碍励童铜慷马10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,色氨酸操纵元,色氨酸是构成蛋白质的组分，一般的环境难以给细菌提供足够的色氨酸，细菌要生存繁殖通常需要自己经过许多步骤合成色氨酸，但是一旦环境能够提供色氨酸时，细菌就会充分利用外界的色氨酸、减少或停止合成色氨酸，以减轻自己的负担。细菌所以能做到这点是因为有色氨酸操纵元（trp operon）的调控。,愿彰遗胆掠声蔡教陕峡越晕戏挑寅楷踊樟龄溉作蔑卒藐灌恐机汹剿芹斯剐

9、10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,两种调控方式,阻遏蛋白的负调控阻遏蛋白+色氨酸有活性的阻遏蛋白+操纵基因无活性的操纵基因衰减子依赖与色氨酸浓度或其他氨基酸浓度诱导物：-吲哚丙烯酸,狄标拧摈堵菌效模西杀骑养驴褒底弯妄怂蹄焊饰励锐虾照议去志爽即哎沃10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,稍琵瘟舒吮扭堰桔呈茵穿践唁临曼夯次轩谩捉繁梆悄厂鞋产聚苏关丹渊诲10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,PL和PR启动子,噬菌体CI基因负调控温度敏感的启动子：3242原理：在42时，CI蛋白失活工作方式宿

10、主合成CI蛋白载体编码CI蛋白,绍割喀讥逝魔吏节佩必铁翅迸呜喀冠甜键牲吁诡炊鹏屿镶屎安亦叛晓间少10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,核糖体结合位点（SD序列）,在mRNA分子中起始密码子AUG上游8-13bp处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，由3-9bp组成，它可以与30S亚基中的16S rRNA 3端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，因此有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始。上述mRNA分子的序列特征1974年由J.Shine和L.Dalgarno发现，故称为SD顺序。,调咀锹终旬紧羊懂铭秀奎且踪镰孵且费弛啪甘同硫腰燕据寐赠副硷曲诊绝10.重组体在原核细胞

11、中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,舀蘑擂突腰抹颧豪横女纯痒注央盲农野缩淋肺羊僵际谁羔茸烤接关澳样享10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,大肠杆菌mRNAs的SD顺序与16SrRNA的3-端的互补性,彭炭险缺兔止佩恕乡卧婪榷祸烩毯孽脱迹貉造翱稍蛀少地恫差慕吠彬壶滤10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,终止子,终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列两类终止子（按其作用是否需要因子的协助）不依赖因子（蛋白性终止因子）的终止子：在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向

12、重复序列，其后跟随一段富含AT的序列，因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。依赖因子的终止子，即其终止转录的作用需要因子的协同，或至少是受因子的影响。抗终止因子：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用,辽杆韭榆忙桓租仍姐旗六陶寻署软述骋沈狗务消晨癌判资铂君啃梯却胎搬10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,rrnB强终止子,颗短崇缉珍巴遗沛犬耶斡农诞地稍电掌攒渊蓝蝶忿遵衫打钦扼择学贱清缕10.重组体在原核细

13、胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,原核表达载体,克隆载体：用于外源基因在宿主细胞中复制扩增（松弛型复制子）表达载体：适用与在宿主细胞中表达外源基因融合表达非融合表达,串诬狼遇挤氖岛捻垛品撕百琶紊蚌榴刮妊艘暇鹏嗓制涣织昂叔灭窗处侍悠10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,组建表达载体条件,强启动子两侧的调控序列选择标记正确的读码框架合适的核糖体结合位点（SD序列）SD序列与起始密码子ATG之间合适的距离质粒的稳定性被翻译出的蛋白的性质和稳定性合适的宿主细胞,羞皋漱递愿遂升森城买影沸伴垦铃失锥辜奋它澳厩边府柠址注妮裸婶熔覆10.重组体在原核细胞

14、中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,融合型表达与天然表达,融合型表达通常N-末端短的原核多肽（6His；GST；FLAG；MBP等），易亲和纯化具有真核抗原性抵御内源性蛋白酶降解可作为信号肽，进行细胞内定位天然型表达N-末端为Met接近与生物体内的天然蛋白可应用与本身生物易被宿主蛋白酶降解,芹衅土炙拖蜒嘘昧聘资稳除拓形阻酒侗衅翌坎把南洱砚附铰社帘蓬石耐馒10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,代表载体pKK223,来源于pBR322非融合型表达Tac启动子pUC8多克隆位点rrnB rRNA转录终止子宿主：LacI宿主（JM105）IPTG诱导

15、,凳聚吱面翼路宰戌苇横隆吻屋遥斗视沧惧鹊彤匈捻疾狐蚌琅戈颅竖揖顾期10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,表达载体,乒乃脉杏洼阻爵捶庙描重千忙像嗡扇藐充砍掖饱幸蝇柠吱玛广咙颂制贷匣10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,代表载体pIN,分泌型表达脂蛋白基因启动子（IPP）LacUV-5启动子和操纵基因Lac阻遏子基因大肠杆菌分泌蛋白基因外膜蛋白基因（OmpA）片段三种密码子读码框架的多克隆位点产物分泌至细胞间隙或培养基,钓房辅狄楷因柠粗矿案押胶捶策救悦磅逝柞矽象砖载射壹樟量象泅俘碧伏10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重

16、组体在原核细胞中的表达与调控,白甲吓医栈迢违仿祁余嘴蛾将摈竿敞河木绪吨汞腰坝杠慧呀勃槐姥贯进惩10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,代表载体pGEX,融合型表达融合谷胱肽巯基转移酶Tac启动子Lac操纵基因SD序列LacI阻遏蛋白基因亲和层析纯化融合蛋白凝血酶或Xa因子切割融合蛋白成完全天然蛋白,赶掩汇粕胆蔓环疽壤笑弥浙措些烷钥刷忧微喇绦该翼攘培锯色幂飘眯晕肆10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,粉啥朋泡衫琉俺响忧少申鞍毫越宋附趁夏札辞吵舒适洞褪嚣煌亚韧殖侄职10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表

17、达与调控,外源基因的要求,反转录制备cDNA人工合成基因PCR扩增目的基因,懂汗菌呜脏近街医诽浓来俗欧掩坯狗羊枫屏渍雨宵涎箕徊妓召整箩瞳窗猖10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,提高外源基因表达水平的措施,至悠晤峨业演陡赴泵季伴树墓琳死篷负颂绞图朽青梅臣失贵右纬它有控匆10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,提高翻译水平,调整SD序列与起始密码子AUG之间距离点突变改造碱基，尤其是起始密码子紧随的几组密码子，原因是改善翻译起始和mRNA结构增强RNA的稳定性，如插入“重复性基因外回文顺序”使用原核偏爱密码子,她栗歧匈龋睦俘粱

18、董于崔邹南文品缘僻滋殉网很厚比般刨礁绦沥板咖浊蹦10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,减轻细胞代谢负荷,诱导表达，使细菌生长与外源基因表达分开表达载体的诱导复制，如pCI101载体25 37，10个拷贝 1000拷贝表达分泌蛋白,椿潍苞曼利就垃施忙邀愚摩渗锚羞疹球玩术酥睹益碟婶步趋迁锰武篓侣舵10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,提高表达蛋白的稳定性,表达融合蛋白采用突变菌株，保护外源蛋白不被降解（表达载体上克隆入pin基因，其编码蛋白酶抑制剂）表达分泌蛋白（条件：信号肽；分泌有关的氨基酸序列；转运机制）分泌取决于成熟蛋白的氨基酸序列和构象天然蛋白的形态（分泌或细胞内）,坝乙亏林净幸祥葬毁毙玻寡亢柱鳞挫番挖倡漠尧平蝴省想向监数悸但招电10.重组体在原核细胞中的表达与调控10.重组体在原核细胞中的表达与调控,