BD FACSCalibur流式细胞仪操作手册.docx

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1、BD FACSCalibur流式细胞仪FACS101 Handbook本课程介绍表面抗原流式分析有关之基础工作原理。如希望进一步了解流式细胞技术应用，请至本公司网站订阅 FACSinformation 电子报.tw/bdb/index.html如需要本课程手册，欢迎至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-3-1.html如需要免疫荧光染色方法，请至本公司网站下载.tw/bdb/10-5-4-1.html一、BD FACSCalibur 基本结构1.1仪器本体:1.电源开关：在BD FACSCalibur仪器右侧下方，先启动仪器本体，再打开计算机。鲜流粮液流糜液2.光学系统：BD FACSCa

2、libur基本配有一支波长488 nm的氩离子雷射以BD FACSCalibur基本型为例 FSC Diode SSC PMT FL1 PMT FL2 PMT FL3 PMT只收488 nm波长散射光只收488 nm波长散射光荧光光谱峰值落在绿色范围（波长515-545 nm）荧光光谱峰值落在橙红色范围（波长564-606 nm）荧光光谱峰值落在深红色范围（波长650 nm）FACScan FACS Cali bur5FTluHtd站-L配和山ls.gr iw.rtartivt3. 仪器面板：仪器前方面板的右下方有三个流速控制键、及三个功能控制键。流谏控制：LO： 样品流速：12四1 /min

3、MED：样品流速：35四1 /minHI:样品流速：60四1 /min功能控制： RUN：此时上样管加压，使细胞悬液从进样针进入流动室。（正常显示绿 色；黄色时表示仪器不正常，请检查是否失压。） STANDBY:无样品或暖机时之正常位置，此时鞘液停止流动，雷射功率 自动降低。 PRIME :去除流动室中的气泡，流动室施以反向压力，将液流从流动室冲 入样品管，持续一定时间后，以鞘液回注满流动室。PRIME结束，仪器 恢复STANDBY状态。4, 储液箱抽屉：在主机左下方之储液箱抽屉。可向前拉开，内含鞘流液筒、废液筒、鞘液过滤 器Sheath Filter，及空气滤网Air filter。请注意气

4、路减压阀VENT TOGGLE之位鞘液筒：位于抽屉左侧，容积4升。装八分满鞘液筒，仪器可以运行大约3 小时。筒上装有液面感应器，鞘液用完时，仪器软件上会有显示。鞘液筒盖 上有金属环扣，保证鞘液筒密闭。废液筒：位于抽屉右侧，容积4升。筒上装有液面感应器，废液盛满时，仪 器软件上会有显示。注意废液可能有潜在的生物传染性。鞘液过滤器：0.22jim过滤器，去除鞘液中的杂质，保证进入流动室的鞘液 是干净的。气路减压阀：沿箭头方向移动阀门开关，鞘液筒减压，气压恢复正常。在鞘 液筒添加鞘液时，需要减压。 空气过滤网：用于过滤冷却雷射的空气。5. 上样品区:上样品区是样本管的上样位置。它包括三个部 分，一个

5、是进样针 Sample Injection Tube，将 样本输入流动室，还有就是支撑架Tube Support Arm、和液滴存留系统Droplet Containment System o进样针：是一根不锈钢管，将细胞从样本针中吸入流动室。进样管外有一套 管，是液滴保留系统的一部分。支撑架：用于支撑样本管、并负责启动液滴存留系统。支撑架有三个位置： 位于样本管之下的中位，样本管左侧或右侧。Bftl Seal上谏管液滴存留系统：系统由支撑架、真空帮浦和外套管组 成。当支撑架位于左侧或右侧位置时，真空帮浦就会启 动，将液体从外管吸入废液筒内。上样时，须注意将支 撑架位于中位，以避免过多样品被抽

6、吸到废液筒内（当 支撑架位于中位，真空帮浦停止工作）。更换样品时， 让仪器保持RUN的模式，使得进样针可以反冲；切换到 STANDBY模式前，确保液路已冲洗彻底以免碎片沈积到 流动室中。1.2 Macintosh计算机与打印机:准备您的细胞样品1. 理想样品浓度调至1-10 X 105 cells/ml? 一般实验只需0.5 ml的样品。2. 细胞样品务必放至BD FALCON 352052试管中，否则无法上机。3. 上机前务必去除样品中之细胞团块，以防止管路堵塞？可使用附滤网BD FALCON 试管(Cat. No.352235)或 35-55 |im 的尼龙筛网。4. 供流式分析的样品是单

7、细胞悬浮液，而且大部分样品都需经荧光染色。表面抗原 荧光染色的方法大致有两种：直接免疫荧光、间接免疫荧光染色。研究生可至本 公司网站下载染色方法 .tw/bdb/10-5-4-1.html直接免疫荧光染色 Lysed - No - Wash Procedure Lysed - And - Wash Procedure, SimulTEST & HLA-B27 Peripheral Blood Mononuclear Cell Procedure Leukemia and Lymphoma Procedure 1 Leukemia and Lymphoma Procedure 2, B-cell

8、 Clonality Assay间接免疫荧光染色滴定抗体浓度常用试剂5. 如因特殊因素无法下载上述实验方法，请e-mail： Jw或.tw。二、开机、关机标准操作2.1 FACS Calibur 开机1. 开启细胞仪电源。2. 开启其它周边配备电源，如打印机及MO机。3. 开启计算机。4. 确认鞘流液筒有八分满的FACS Flow，确实旋紧（鞘液筒容量为4L）。5. 将废液倒掉，并在废液筒中加入200 ml家用漂白水（废液筒容量为4L）。6. 将减压阀方向调在加压（Pressurize）位置。7. 排除液流管路与过滤器中的气泡。8. 取下样品管，执行PRIME功能两次。9. 使用 1ml PB

9、S，HIGH RUN 两分钟。10. 可开始分析样品。2.2 FACS Calibur 关机关机前必要动作：清洗进样管和外套管，防止进样管堵塞、或有染料残留。1. 将样品支持架左移，取2 ml FACSClean（10%Bleach）上样品，让仪器的真 空系统抽取约1 ml的液体。2. 将样品支持架回正，按HI RUN，然后让FACSClean清洗管路10分钟。3. 按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。4. 取2 ml dH2O，重复上述步骤1-3。5. 注意最后只留约1 ml dH2O在试管中。6. 按STANDBY五分钟，使风扇冷却雷射后，关闭细胞仪（必要动作，以保护 雷

10、射光源。）7. 倒掉废液，并回填200 ml漂白水。8. 将减压阀放在VENT漏气位置。将鞘流液筒充填至八分满。9. 退出软件“ File” 土 “Quit”（如有对话选项，选择“ Dont sa能）。确认退出 计算机中所有BD应用软件，所有数据数据已储存备份。10. 关闭计算机。“Special” 9 Shutdown”。三、上机分析流程建议首次试机避免进行大量试验，仅需准备下列样品。（1）Negative Control （不加任何抗体）。（2）CD3-FITC（FL1 单染）。（3）CD19-PE（FL2 单染）。（4）CD3-FITC /CD19-PE（FL1/FL2 双染）。3.1

11、Calibur 开机1. 先开启细胞仪本体再打开计算机。*秘技1：如顺序相反，仪器和计算机之间无 法建立正常通讯，无法执行“connect to cytometer ”解决之道，两者都关机、 然后以正确方式重开。2. 向前拉开储液箱抽屉，检查鞘液筒、废液筒水量，如需充填鞘液，将减压阀方向调在VENT位置（箭头方向）。3. 仪器会对鞘流液筒打气加压，请确认筒盖确实旋紧。*秘技2：将减压阀方向调 在加压（向前）位置。减压阀如在VENT （箭头方向）位置，按RUN功能键时 将显示橙黄色（表示仪器不正常，请检查是否失压），正常为绿色显示。3.2开启CellQuest软件、编辑实验文件4.在苹果菜单下点

12、击CELLQuest启动软件。桌面会出现一Untitled实验文件，可 点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。J :ItJ原T卢笄r- +L_ J.：+L?i- 1r- +KA曰5.从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至适当大 小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。Fl I土| Acquisition 由rfBlysi FHX Psrameter：| pl 256Plot SOUrce:I* AnalyaLa Select File| Psrameter:| f2256Gate：! H: Gate：|6.在出现的散点图对话方框中点击Plot Source，选

13、择Acquisition （收取），确认X 和Y轴参数预设为FSC-H 1024、SSC-H 1024。在颜色方框中点击Multicolor Gating （收取样品时，门内细胞将出现颜色）。点击OK。此时实验文件会出现 FSC/SSC散点图。7. 说明：散点图（Dotplot），又称二维散点图是流式分析最常用图谱，它可以显 示两个独立参数的相互关系。在图中，横坐标X轴为为荧光1强度的相对值， 单位是道数，纵坐标Y轴则通常表示荧光2或光散射强度的相对值。仪器使用 者可因应实验需求来修改所有图谱中显示之参数。第一图X和Y轴参数分别设 为FSC-H 1024、SSC-H 1024；第二图X和Y轴参

14、数分别设为FL1-H 1024、 FL2-H 1024。修改动作为轻击图谱上X和Y轴参数，并依需要选择之（FSC： 细胞大小，SSC：细胞折射率，FL1： FITC绿色荧光，FL2： PE橙色荧光， FL3： PerCP红色荧光）。8.从屏幕上方Plots菜单中选择Dot Plot功能，可复制一个同样大小的散点图，在 出现的对话方框内选择X轴：FL1-H 1024, Y轴：FL2-H 1024。点击OK， FL1/FL2的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。9.在工具板中选择四象限工具，在FL1/FL2散点图上拖动Quadrant的中心将它设 定在(X，y) = (101, 101 )处

15、，这些象限将指定阴性/阳性区域。建立仪器和计算机之间通讯10. 从 Acquire 菜单中选择 Connect to Cytometer，此时会出现 Acquisition Control 对话方框。如果无法选择Connect to Cytometer，参考秘技#1。如果没见到 Acquisition Control对话，可到屏幕上方Windows菜单中选择ShowAcquisition Control。仪器设置文件注意：实验数据质量，取决于最适化仪器设定文件。仪器设定文件不能在数据收取后再更改，研究人员必须在第一次就使用正确的仪器设定文件。仪器设定文件(Instrument settings

16、)，含信号器高压(Detector/Amps)，阈值(Threshold)，荧光补偿(Compensation)等仪器条件的组合。一般而言，仪器 设定的顺序为 Detector/Amps - Threshold - Compensation。11.检查现有仪器条件，从Cytometer菜单中选择Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps 窗口。在 Detectors/Amps 窗 口确认 FSC 与 SSC 为 LIN （线 性放大），其它FL1-3为LOG （对数放大），将其 拖至空白区。Plti姑 RCy tomstBrDetectars/HmpsThreshrId

17、HCompensatian StatusInstrument Setting：Sort CountersTime-DelayC ali bratJ； HHH :; Dettbrs/Amps 壬壬三三泌壬* 壬切ZTParam Detector Taltaje amt Gam HideP1 F3C E(JQ 三 J2 3 4 5 p p p po o o o5 0 5 53 6 5 6o o o o .0.0.0.0混 FL2-AP7 FL2-WITl-fl-*ffl#*gl#*-ffl#*-ffl#t.ff廿ftLin *Lin *1Lin *SecondaryLinPrimary.Pa ra

18、m：.FSC-HO 5SC-HO fli-hO FL2-HO FL3-HQi SSC-HQFL1-HFL2-H DM Purain: FLWO FL3-HO FL4-H Hone12. 从 Cytometer 菜单中选择 Threshold，出现 Threshold 窗口在 Threshold 窗 口：确认FSC为设阈参数，初步确认预设阈值52。将其拖至空白区。13. 从Cytometer菜单中选择Compensation，确认所有预设数值皆为零。将其拖 至空白区。3.3上样品、设置仪器14. 使仪器处于High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑架回位。确认 Acquisition

19、Control窗口中 Setup前需打叉或打勾（即不储存数据），点击 Acquire。调节FSC/SSC探测器（电压）15. 观察FSC/SSC图的变化。FSC电压（Voltage）预设为E00，可调节Amp Gain 从1.00-9.99使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将FSC电压设置于 E-1；较小细胞，将FSC电压设置于E01）。调节SSC电压使主要细胞群得以 清楚呈现。调节FSC/SSC图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该 细胞群不与其它族群、细胞碎片有重迭现象。调整定位后，点击Acquisition Control 窗口中的 Pause。Gating圈选细胞检品中，常含

20、有大小不同、性质相异的细胞群体。我们常用前方散射与侧方散射 的二维位图，即散射光图谱（Scatter Plot），来圈选出不同细胞群的范围，选择性显 示出有意义的细胞群体，如下图圈选白血球之淋巴细胞族群。16.在工具板中选择多边形的Region，在FSC/SSC散点图上划定淋巴细胞R1区域（如下图）。分析样品时，区域内细胞应会呈现成红色，可移动或改变形状来圈选 有意义的细胞。如果要删除R1区域，您可以在工具列中点选Gates - Region list，以鼠标点选R1,再按Delete键删除R1区域。删除R1区域 后，可用绘图工具板，重画R1。罩核球200 wlten1000ri| of ai

21、i +仲娜Ma cuntci23.最后以 CD3-FITC/CD19-PE 双染样 本上机，点击 Acquisition Control 窗 口中的Restart，确定三群细胞工整垂 直。当您已完成2色荧光之光谱重迭 时，点击 Acquisition Control 窗口中 的 Pause、AbortoFL1 -H24.移去样本管，换上dH2O管，让仪器暂且处于Standby状态。关闭 Compensation窗口。您已完成2色荧光之最适化。3.4收集实验数据决定储存细胞总数25.预设之储存细胞总数为10000o如需修改，从 Acquire菜单中选择Acquisition & Storage，

22、并在出 现的窗口功，确认Collection Criteria从 10000 of All，再点击OK。StirMC= (kite：Oatn fhl$ will Diiteln： AllH wsenh.|日 |FDrBinctcri Ssvcd. |Fil#| Uanc&l |26. 找个档案匣准备储存数据。从Acquire菜单中选择Parameter Description，出 现Parameter Description对话方框。点击Folder，并在随后出现之对话方框， 选择Your Folder或新建活页夹，点击此对话方框的Select Your Folder。27. 命名即将储存之文

23、件名：点击Parameter Description对话方框的File，出现文 件名编辑窗口。在Custom Prefix中：输入文件名20031231，点击此对话方框 的OK。日期为最常用之文件名系统。: ParametHr DescriptiDn ；目28. Optional：如有需要，可选择或在P1-Window： untnlclFslfer： FAC5tatlon G -.est iFalder：File hlNM虬 Dta.001P5后的空格中输入相关参数名。如P1: Size, P2： Granularity, P3：口 PwiiHLynipTube： Leuc 叫血f|Lomme

24、nfft-Paticnt ID_Sample I D：CD3 FITC。输入参数名会存入实验 档案中，显示在图谱上。Pl:P2：P*P4:P5：PG：P7:P8：Ti me.计数器Counters29. 从Acquire菜单中选择Counters.窗口会显示样品分析速率、与总数进度。:Counters ：Total Events：3825Eve=nts/Second： 1 50Elapsed Time： 0: 0： 24Reset j收集实验数据30. 你可以开始收集实验数据了。HIGH RUN，将第一管样品放到检测区，在 Acquisition Control 窗口中，将区 Setup 改成

25、 口 Setup，此时 CellQuest 会自 动显示Your Folder： 20031231.001为资料文件名。点击“Acquire”便可启动 样品之分析测定与数据储存。当计算机成功地收取足够数据，会自动储存数据 文件20031231.001，并会以“嘟”声告知，CellQuest会自动升幂附加档名成 20031231.002。等待下一指示。31. 你可以换上下一管样品，点击“Acquire”启动样品之分析测定与数据储存。可 继续分析直到所有检品都分析完毕。3.5实验数据之储存与备份:32. 不建议长期使用硬盘储存数据数据，可考虑以烧光盘（如配有CD-RW）、口 袋硬盘（Flash D

26、rive）来备份大量实验数据，以免占用原有硬盘的内存，影响 数据处理速度。可将备份后之数据，拿到另一苹果计算机或个人PC进行离机 分析。33. 确认所有档案皆己备份后，以鼠标圈选欲删除数据，将其拖拉至Trash筒。退出软件34. 检品分析完毕后，记得从屏幕上方File指令栏选择 Save As，储存实验文件，以备日后使用，不需每次 重新编辑。35.从屏幕上方 Cytometer 指令栏，选择Instrument Setting，出现InstrumentSetting窗口。点系print打印此次实验条件，可贴入实验笔记留底，再点击Save 以储存此一实验的仪器条件，供日后再使用。点系SAVE后会

27、出现文件保存对 话方框，选择文件目录及文件名（例：Your Folder： /Your Setting1），点击 Save。点击 Done。盼iing： Current StatusRevertDyitoaeter Type :FHCSicaiLibijr三Dt tec=KaraaUetecter1teqeHbpIjq inhodePlFSCEoe1 .66Lc9PZ33C1561 .eeLogP3FL1il5S1皿LogP1FL21561LctqF3FL31LogPftFL1-A1 .60L in36.检品分析完毕后，用鼠标从屏幕上方Acquire指令栏中，选取Disconnect toCy

28、tometer以断绝计算机与仪器间之联机。之后如不分析数据，您可退出软件 “File”“Quit”（遇有选项永远选择“Dont sa能），进行关机程序。管路清洗37.以2 ml 10%漂白水取代样品，将样品架置于左位以外管吸除约1 ml，再将样 品架置于中位HI RUN十分钟。改用2 ml DI water。重复上述程序，样品架上 留约 1 ml DI water。按 STANDBY 五分钟。关主机、关计算机四、数据分析FCS list mode数据文件：说明：FCS list mode数据文件是流式细胞仪的标准格式档案（FCS2.0）。该文件含有从 流式细胞仪收取的平均10,000个细胞数的

29、资料，含有46个参数。一般软件无法打开list mode数据文件，需藉助如CellQuest, WinList, WinMDI,等Flow分析软件，才可开启、绘 图、并进行分析统计。I痂现 72199.U0 10721 99.00Z4.1开启一 CellQuest实验文件1.从屏幕上方File菜单中选择New。桌面会出现一Untitl实验文件，可点击实验 文件的右上角的放大钮，将实验文件窗口放大。4.2散点图之统计分析（双色）2从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖动对角线至适当大 小。Plot拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3.在Dot Plot方框中，Pl

30、ot Source应预设为Analysis,可点击Select File钮，并用 随后之方框来开启预存之Sample Files,它们的路径位于Mac HD： BD Applications： CellQuest Folder： Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找 到档案后，点击Open来开启NORM001档案。X与Y参数项会出现默认值一 FSC-H 256 与 SSC-H 256，在 Color 方框中点击 Multicolor Gating，确认无误之 后，点击OK便完成了一个NORM001 的 FSC /SSC散点图。4.工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor移至

31、FSC/SSC散点图上，并二沿着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成.014R1区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。(如果要删除R1区|日域，您可以在工具列中点选Gates 一 Region list，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。)5.从Plots菜单中选择Dot Plot可复制一个同样大小的散点图，屏幕上会出现一 DotPlot对话方框。点击X Parameter钮来显示NORM001档案中所有的参数项 (FSC, SSC, FL1, FL2)将X参数项改成FL1-H 256 Gamma-1，Y参数项改成

32、 FL2-H 256 Gamma-2。从 Gate 输入栏中将 NoGate 改成 G1= R1。6.点击OK便完成了一个以G1圈选的FL1/ FL2散点图，可将复制图移至 原图右方。NORM001档案为本组 实验之阴性对照组，我们将以之来 界定阴性与阳性之界限。7.从屏幕左列工具板中，选取Quadrant Marker工具，然后在FL1/ FL2散点图中心处点击并拖曳至定点，般而言是紧挨着阴性细胞聚落。Norm .0028. FL1/ FL2二维散点图现在被区隔出四个象限，欲计算各象线中细胞的数据数据，从屏幕上方Stats菜单中选择Quadrant Stats。可以得到该图之四象限统计结果。

33、UL：左上象限，UR：右上象限，LL：左下象限，LR：右下象限5| Batch Acquirestogram StatsK-S Stats.Region StatsGate StatsQuadrant StatsEdit.New ExpressionEdit Expression打印报告、输出统计数值9.从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。10.点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。 Rustirts Saue as:4.3 开启

34、其它 List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表（文 件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上），接着从Plots菜单选择 Next Data File，软件会自动以新档案来替换现有档案，您只要确认圈选范围、与 Quadrant Marker的位置是否恰当，即可打印报告、或输出统计数值。12. 对于存在不同档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表（文件中所有 图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上），接着从Plots菜单选择Change Data Files，并在随后出现之对话方框，选择所在新目录与欲分析档案。点击 O

35、PEN。可调整圈选区域，Quadrant Marker阴阳界限，软件会重新计算、统计 报告。010203.001 031903.001 1 12502.0011 12702.001 121202 121602Open a Data File：助 BD Testnnna00Open13. 常规使用之实验文件（内含散点图、圈选区格、四象限分界、以及统计报告），我 们建议您将它另存新档File -Save As，以备后需，分析其它档案便轻而易举。4.3直方图之统计分析（单色）1.从屏幕上方File菜单中选择New。桌面会出现一Untitled实验文件，可点击实验文 件的右上角的放大钮，将实验文件窗口

36、放大。2从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，然后拖曳对角线至适当大 小。Plot拖曳完成后可以在右方看到Dot Plot对话框。3.在Dot Plot方框中，Plot Source应预设为Analysis，可点击Select File钮，并用随 后之方框来开启预存之Sample Files，它们的路径位于Mac HD： BD Applications： CellQuest Folder： Sample Files。连续双击鼠标来打开次目录，找 到档案后，点击Open来开启NORM001档案。X与Y参数项会出现默认值一 FSC-H 256 与 SSC-H 256,在 Color 方

37、框中点击 Multicolor Gating，确认无误之 后，点击OK便完成了一个NORM001 的 FSC /SSC散点图。4.工具板中选择多角形区隔工具，将Cursor移至FSC/SSC散点图上，并沿中着淋巴球聚落周边画出范围，连点击两次可关闭该区域。你已完成R1.区域的界定，我们将以此区域来圈选淋巴细胞。（如果要删除R1区域，可您可以在工具列中点选Gates 一 Region list，以鼠标点选R1，再按Delete键删除R1区域。删除R1区域后，可用绘图工具板，重画R1。）5.从Plots菜单中选择Histogram,屏幕上会出现一 Histogram对话方框。点击Select Fi

38、le钮，再点击Open来开启NORM001档案。说明：直方图(Histogram)表明一个参数与细胞数量之间的 关系，在图中，横坐标X轴为荧光或光散射强度的相对值， 单位是道数(channel number)，纵坐标Y轴则通常表示细 胞出现的频率，即相对细胞数。6.点击Parameter钮来显示NORM001档案中所有的参数项，将参数项改成FL2-H 256 Gamma-2。从Gate输入栏中将No Gate改成G1= R1，点击OK便完成了 一个以G1圈选的FL2直方图，图形的X轴为橙黄色荧光强度，Y轴为细胞频率， NORM001档案为本组实验之阴性对照组，我们将以之来界定阴性与阳性之界限。

39、7.从屏幕左列工具板中，选取Histogram Marker工具，然后在图的左缘处点击并拖曳 至定点，一般而言是阴性信号的右缘。放开鼠标后即完成Marker 1(M1)。重复前述 步骤以增画另一 Marker，一般而言M2始自M1的右缘，终于图的右界。8. FL2直方图现在被区隔出两个区域，欲计算各区域中细胞的数 据数据，可从Stats指令栏中选择Histogram Stats。StatsBatch AcquireHistogram StatsK-S Stats.Region StatsGate StatsQuadrant StatsEdit.NORlrlOCIMlElII 10Gsinmi-

40、IE-阳5 岫;：6Hb Ce-wI叫舛Xi。七k rbruiw.Mrtr Lili. It|hr Ewdi耳 CUB，肝堀IW 翊tl*仁翩t艘 EwumoKTiul Mu UckMu CPH.M /JMUK4.II .手丰女1-1-111MEihl H MHTT.ii e-ilAI海hC 1 号1112.29 llk.llH.I1wifiwNew ExpressionEdit Expessicin打印报告、输出统计数值9. 从屏幕上方File菜单中选择Print One，可以打印工作中实验文件。10. 点选四象限统计表，从屏幕上方File菜单中选择Export Statistics可输出统计数值 至Excel档案。在出现方框中命名档案，并决定欲存放档案匣，点击Save。Austins U :Saue as:4.3 开启其它 List Mode Data11. 如欲接着分析存在同一档案匣之系列档案，可用鼠标以拖曳方式选取所有图表（文 件中所有图谱的四角会出现黑色方块，表示被选择上），接着从Plots菜单选择 Next D