选修三的教材处理及教学资源开发.ppt

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1、选修三的教材处理及教学资源开发,长春第八中学 王丽梅,选修3资源开发,一、基因工程,(一)易混概念,基因探针,基因诊断,基因敲除,DNA分子杂交技术,抗原抗体杂交技术,基因探针,即核酸探针，是一段带有检测标记，且顺序已知的，与目的基因互补的核酸序列(DNA或RNA)。根据杂交原理，作为探针的核酸序列至少必须具备以下两个条件：应是单链。若为双链，必须先行变性处理。应带有容易被检测的标记。,基因诊断,又称DNA诊断或分子诊断。通过分子生物学和分子遗传学技术，直接检测出分子结构水平和表达水平是否异常，从而对疾病做出判断。进行基因检测有两个必要条件：一是必需的特异的DNA探针二是必需的基因组DNA。,

2、基因敲除,是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理。用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。,DNA分子杂交技术,互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。,抗原-抗体杂交技术,Western杂交蛋白质分子（抗原抗体）之间的杂交。它是检测目的基因是否表达出蛋白质的一种方法。,具体做法第一步：将目的基因在大肠杆菌中表达出蛋白质第二步：将表达

3、出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出抗体（一抗）第三步：从转基因生物中提取蛋白质，走凝胶电泳第四步：将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素膜上第五步：将抗体（一抗）与硝酸纤维素膜上的蛋白杂交，这时抗体（一抗）与目的基因表达的蛋白（抗原）会特异结合。由于这种抗原抗体的结合显示不出条带，所以加入一种称为二抗的抗体，它可以与一抗结合。二抗抗体上带有特殊的标记。如果目的基因表达出了蛋白质，则结果为阳性。,(二)疑难问题,限制性核酸内切酶能识别RNA序列吗？,限制性核酸内切酶是能够识别和切割DNA分子内一小段特殊核苷酸序列的酶。,不同限制酶处理获得的不同黏性末端也可形成重组DNA分子吗？,限制酶

4、产生的末端的连接有三种情况：匹配末端。用同一种酶酶切产生的带相同突出端的两个片段用不同的酶酶切但带有相同突出端的两个片段，如用BamH及Bgl酶切相同的突出端都可以匹配，并在连接酶作用下连接。平末端。平末端可以直接连接，但连接效率比黏性末端低。,不匹配黏端。不配对黏端的连接可采用两种方法：A.用S1酶切除突出的核苷酸，将黏端修平，再用连接酶连接。B.用Klenow酶将黏端部分补平，如Hind与Xba产生的黏端不能匹配，可分别用两种核苷酸填补，使之产生匹配黏端，再用连接酶连接。该法的优点在于可防止片段的自身连接。,Ti质粒是什么？,Ti质粒是在根瘤土壤农杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形

5、双链DNA分子。它控制根瘤的形成，可作为基因工程的载体。此质粒既有在细菌中表达的基因，又有在高等植物中表达的基因，这是很独特的。,农杆菌转化法一般不能用于转化单子叶植物吗？,目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上，然后将该质粒转入农杆菌。双子叶植物伤口处的细胞分泌大量的酚类化合物，吸引并诱导农杆菌侵染植物细胞，导致T-DNA的加工和转移。而单子叶植物受伤后不能分泌酚类化合物，所以农杆菌不易直接侵染单子叶植物。但是，后来经过调整和改进有关技术，如选择合适的农杆菌菌株、添加乙酰丁香酮等趋化和诱导物质，农杆菌介导的遗传转化法在水稻、小麦等单子叶植物中也获得成功，从而使其成为一种被广泛地应用于单子叶植物

6、和双子叶植物的遗传转化的方法。这种方法的优点在于简单有效，转化的外源DNA结构完整，整合位点稳定、转化效率高、整合后外源基因结构变异小等，当然单子叶植物的转化率(20%-30%)还是比双子叶植物的转化率(80%90%)低。,与基因工程有关的蛋白质,限制性核酸内切酶（在原核生物体内提取；专一性很强，每种都有特定的识别序列和切割位点；识别的序列为反向重复序列；切断的是两个核苷酸之间的磷酸二酯键。）DNA聚合酶（可在多核苷酸链的3端添加单个的脱氧核苷酸，形成磷酸二酯键)DNA连接酶(可连接多核苷酸链的两个断端，形成磷酸二酯键）Bt毒蛋白(苏云金杆菌体内的一种毒蛋白，由Bt毒蛋白基因控制合成，抗虫棉就

7、是转移了这个基因；该蛋白本身无毒，在害虫消化道内被降解为有毒的多肽，可结合在害虫的肠上皮细胞的特异性受体上，导致细胞穿孔、肿胀，造成害虫死亡。该蛋白对哺乳动物无毒害。）,限制酶专题,限制性外切酶和限制性内切酶？,限制性外切酶，一类从核苷酸链的一端开始顺序催化降解核苷酸的酶，可以分为单链核酸外切酶和双链核酸外切酶。限制性内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在特定切点切割DNA双链的酶。,限制性内切酶种类,找出规律,1.目的基因的两端用不同的酶切割，质粒也用这两种不同的酶切割，可以防止目的基因或质粒的自身环化。,2.两种不同的限制酶切出的平末端不同，但链接酶仍可连接，连接

8、后原来使用的两种限制酶都不能再从连接处切开了。,3.不同的限制酶切割的平末端都可以被连接酶连接。提取的目的基因一端为粘性末端，另一端为平末端，可以很好地避免自身环化。,构建重组质粒时要注意：,一定要看切割的DNA有几个片段,（两端均为切点的片段）再看DNA片段的两端是否和质粒的两个切口连接.不能破坏所有的标记基因,PCR技术,PCR反应体系主要由“缓冲液、模板、dNTP、耐热DNA聚合酶、引物及其特定反应条件”组成。,1.缓冲液的组成及作用,缓冲液：除了缓冲作用外还含有可以激活DNA聚合酶的Mg2+,以及有利于引物和模板退火的K+，还有DNA聚合酶的稳定剂等。,2.PCR所需要的原料就是普通的

9、四种脱氧核苷酸吗？PCR反应体系为何不加ATP？,dNTP：脱氧核苷三磷酸，包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP。（“d”代表“脱氧”；“N”代表“四种碱基”；“T”代表“三个”；“P”代表“磷酸”）四种脱氧核苷三磷酸是消耗ATP活化的脱氧核苷酸。,3.dNTP的生成需要ATP供能,dNTP由dNDP的生成过程也需要ATP供能：dNDP+ATPdNTP+ADP如：GDP+ATPGTP+ADPCDP+ATPCTP+ADP,4.DNA的复制：,3-OH进攻5-Pi；DNA聚合酶催化；DNA的延伸方向:53,5.引物,PCR反应体系中所需引物为单链DNA片段，一般为2030个核苷酸长度。可以与

10、待扩增基因母链一端互补配对。所以，待扩增基因应有一段已知序列。引物可以人工设计合成。,6.引物、dNTP需要随时添加吗？,反应前需要加入足量的引物，一般达到0.25mol/L 反应前需要加入足量的dNTP，一般达到200mol/L这样就足够反应进行30-40次循环。,7.酶、模板需要随时添加吗？,模板102105-每次循环均可利用上一次合成的DNA作为模板2.5个单位的DNA聚合酶-酶可以重复利用,引物分子较小，运动较快，和母链碰撞的机会要多得多，所以优先与母链结合，而不是两条母链结合。,8.退火时为何引物优先与母链结合？,9.DNA的复制 和 体外的模拟,模板（母链）细胞内源 外源加入打开双

11、链 解链酶 加热变性维持单链 单链结合蛋白 高温引物 引物合成酶 外源加入底物dNTP 细胞内源 外源加入聚合酶 细胞内源 外源加入反应环境 细胞内环境 缓冲液,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环-变性,PCR循环退火,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,PCR循环延伸,DNA测序,双脱氧链终止法,双脱氧链终止法原理,如果此处没有羟基，则不能继续增加脱氧核苷酸。脱氧核苷酸链不能继续延长。,脱氧核苷酸的连接,脱氧核苷酸的连接,1,2,3,4,5,双脱氧核苷酸,?,1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCT

12、P3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTP,四套反应体系:,双脱氧链终止法荧光标记原理,基因测序,ddATP-绿色荧光ddTTP-红色荧光ddCTP-蓝色荧光ddGTP-橙色荧光,双脱氧链终止法荧光标记原理,基因测序,引物都是DNA片段吗？,由于DNA聚合酶的特性，只能把单个核苷酸连接到与模板链互补的一段多核苷酸链上。所以复制时要预先在模板链的3端结合一小段多核苷酸链。这个小片段的多核苷酸链就叫做引物。细胞内DNA复制时，是通过引物酶合成的，是一段由10左右的核苷酸组成的RNA短链，复制完成后被修复系统移去。PCR技术扩增

13、DNA时，需要人工添加引物，一般为2030核苷酸组成。为单链DNA。,目的基因导入受体细胞后，是否整合到受体细胞的核DNA中？,导入植物、动物细胞的，一般采用农杆菌转化法和显微注射法，一般都整合到核基因组中。利用线粒体或叶绿体作为新型运载体导入动植物细胞，都存在于细胞质中。导入微生物细胞的，一般通过质粒，存在于细胞质中。以噬菌体、动植物病毒作为载体的目的基因一般需要整合到受体细胞的染色体DNA中。,原核生物中的限制性内切酶有何作用？它为什么不剪切自身DNA？,从一个角度讲，“转化”是细菌的一种适应性。提高了变异性，个体差异增大，群体适应性增强。从另一个角度讲，过多的转化会导致遗传稳定性下降。限

14、制性内切酶就是为了保证遗传稳定的一种防御性工具。限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了，所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。,DNA复制过程需要DNA连接酶吗？,复制方向：DNA聚合酶只能从子链的3端添加单个的脱氧核苷酸。冈崎片段的连接需要连接酶。,Ca+处理细菌细胞可以使细胞处于感受态，易于转化。感受态什么意思？细菌可遗传变

15、异的来源只有基因突变吗？,转化是细菌的一种基因重组的方式，可增加细菌的变异性，增强群体的适应性。在细菌生长的某阶段，会有一个容易接受外源DNA的阶段，称为感受态。也可以通过人为处理促使其达到感受态。认为细菌可遗传变异的来源只有基因突变是错误的。,添加蛋白酶的洗衣粉不能洗涤毛丝织物，而添加纤维素酶的洗衣粉为何能洗涤棉织品？,成熟的棉纤维主要成分是纤维素。纤维素酶包括：内切酶（是纤维素分子断裂成片段）、外切酶（从纤维素分子的糖链末端切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖）、葡萄糖苷酶（使纤维二糖分解成葡萄糖）。20世纪80年代，日本的一家公司首先推出含有纤维素酶的洗衣粉。纤维素酶本身不能去除污垢，但可以

16、去除棉纺织品表面的浮毛以及面附着的沉积性顽顽渍，同时可以使纤维结构变得蓬松，进而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，进而达到更好地去污效果。所以使用含有纤维素酶的洗衣粉可以使棉纺织品增艳出新、柔软蓬松、织纹清晰、色泽鲜艳。但过量、超时、反复使用这种洗衣粉，也会损伤棉麻等天然纤维织物。,为什么抗病毒植物一般转移病毒的外壳蛋白基因？,这样，抗病毒植物的细胞中就会存在大量病毒外壳蛋白，当病毒的核酸侵入到植物细胞时，外壳蛋白就会迅速将其包裹起来，从而阻止病毒核酸的复制和翻译。,转入病毒复制酶基因的植物为什么可以抗病毒？,复制酶即特异性依赖于病毒RNA的RNA多聚酶。转入的复制酶基因均切除

17、了复制酶活性中心部位对应的核苷酸序列，表达的这些蛋白产物会干扰病毒复制过程中复制酶复合体的形成及其功能的行使，从而使工程植株具有抗病性。,二、克隆技术,(一)易混概念,植物细胞工程,培养植物细胞（包括原生质体），借助基因工程方法，将外源遗传物质（DNA）导入受体细胞（包括原生质体受体）中，或通过细胞融合、显微注射等到将不同来源的遗传物质重新组合，再通过对这些转基因细胞或重组细胞进行培养，获得具有特定性状的新植株。,【植物细胞工程】,细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。根据操作对

18、象的不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。,植物体的细胞中含有该植物所有的遗传信息。在合适的条件下一个细胞可以独立发育成完整的植物体。利用细胞的这种全能性，生物学家通过组培来繁殖名贵花卉、消灭果树上的病毒，以及通过对细胞核物质的重新组合进行植物遗传改造等。这就是人们常说的植物细胞工程。主要由两部分构成。其一是上游工程，包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤。其二则是下游工程，是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程。,(二)疑难问题,植物组织培养过程中培养基成分为什么是蔗糖？葡萄糖可以吗？若植物可吸收利用蔗糖，那是否与必修一中成熟植物细胞置蔗糖溶液中会质壁分离相

19、矛盾呢？,以蔗糖作为碳源，主要有三个方面的原因：同样作为碳源为植物细胞提供能量来源，蔗糖较葡萄糖能更好地调节培养基内的渗透压。配制相同质量分数的培养基，蔗糖形成的渗透压要明显低于葡萄糖，因此若采用葡萄糖作为碳源易使植物细胞脱水而生长不良。同时，植物细胞吸收蔗糖的速率要明显慢于吸收葡萄糖的速率，所以蔗糖形成的渗透压可相对长期的保持稳定植物组织培养过程中，要时刻注意防止培养基受到微生物的污染。微生物生长所需的碳源最常用的是葡萄糖，一般很少利用蔗糖。因此，采用蔗糖作为培养基的碳源可一定程度上减少微生物的污染。诱导作用。在培养基成分中增加生长素的浓度导致木质部形成；增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。当生长

20、素水平恒定时，2%蔗糖使分化出的全部是木质部，4%蔗糖使分化出的几乎全部是韧皮部，3%蔗糖则可以分化出两者。所以生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。因此在植物组培中不选用葡萄糖。,植物组织培养中培养基中的蔗糖浓度较低的，一般为3%-10%，而质壁分离中的蔗糖浓度为30%，可见两者浓度差距之大；质壁分离由于时间短，细胞吸收的量很少，而不是不能吸收，不足以对细胞液渗透压造成影响，才会出现壁分离现象。而只要浓度不是过高，时间又足够长，那么蔗糖就可以以被动扩散的形式进入植物细胞内而被植物利用。同时植物体内有蔗糖转化酶，可以吸收和利用蔗糖。而且转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。研究

21、表明，转化酶参与植物的生长、器官建成、糖分运输等多项功能，因此在植物培养基中加蔗糖。,植物组织培养中光照也是重要条件，它对生长和分化有很大影响。愈伤组织的培养分为两个阶段。脱分化培养阶段：由于光会阻碍组织的脱分化，所以脱分化培养阶段应避光培养，在无光的条件下愈伤组织长得更快。再分化培养阶段：将良好的愈伤组织转接至分化培养基上进行再分化培养。这时应见光；愈伤组织见光后，颜色可以转为绿色。不同植物对各种条件的要求也往往不同。光对生长和分化有很大影响，这与材料的性质、培养基情况以及由于光照而引起的温度上升等方面因素有关。菊花是短日照植物，在短日照下易分化，在长日照下产生愈伤组织。,植物组织培养过程中

22、何时需光照？,动物细胞培养中卡氏瓶为什么要放在5%CO2培养箱，明明有盖子？,放入二氧化碳培养箱时，瓶口不是完全封死的。（对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。）,为什么胚胎细胞核移植成功率远高于成体细胞核？两者核遗传物质不是相同吗？,端粒酶能延长缩短的端粒（缩短的端粒其细胞复制能力受限），从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶的表达与人细胞的永生化程度高度相关，Thomson（分离人的胚胎干细胞的学者）等研究证明hES（人的胚胎干细

23、胞）高表达端粒酶。因此可以推测来自囊胚和胎儿的ES细胞的增殖能力可能比采用体细胞核转移技术获得的ES细胞强，因为通过体细胞核转移技术获得的ES细胞端粒酶活性不会很高，从而限制了细胞的分裂能力。,三、胚胎工程,(一)易混概念,滋养层细胞,饲养层细胞,成纤维细胞,滋养细胞,【滋养细胞】如滋卵细胞，卵巢中来自卵原细胞的滋养细胞，提供卵发育所需物质。,【滋养层细胞】在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始出现分化。聚集在胚胎的一端个体较大的细胞，称为内细胞团（inner cell mass，ICM）将来发育成胎儿的各种组织；而沿透明带内壁扩展和排列的，个体较小的细胞，称为滋养层细胞，它们将来发

24、育成胎膜和胎盘。所以做基因诊断时，通常取少量滋养层细胞诊断是否患有遗传病，这样不会影响胎儿发育。,【饲养层细胞】在细胞培养中其分化抑制作用的单层贴壁细胞，就是指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞、输卵管上皮细胞等已在体外培养的细胞）经有丝分裂阻断剂（常用丝裂霉素）处理后所得的细胞单层。是细胞培养，尤其是胚胎干细胞培养常用的生长增值促进剂和分化抑制剂。,【成纤维细胞】普遍存在于结缔组织中的一种中胚层来源的细胞。分泌前胶原、纤连蛋白和胶原酶等细胞外基质成分，伤口愈合过程中可迁移到伤口进行增殖。成纤维细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，其细胞核呈规则的卵圆形，核仁大而明显。成纤

25、维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用,受精,授精,体外受精,体内受精,人工授精,（人工）体外受精,【受精】精子进入卵子后雌雄原核相融合形成合子的过程。,【授精】因精子一般仅能在液体中运动，所以作为受精的前提条件是需要使精子和卵处于同一液体介质中，特别是在多细胞动物，把充满这种受精条件的称为授精（还需完善）。,【体内受精】凡在雌、雄亲体交配时精子从雄体传递到雌体的生殖道，逐渐抵达受精地点（如子宫或输卵管），在那里精卵相遇而融合的，称体内受精。多发生在高等动物如爬行类、鸟类、哺乳类、某些软体动物、昆虫以及某些鱼类和少数两栖类。,【体外受精】凡精子和卵子同时排

26、出体外，在雌体产孔附近或在水中受精的，称体外受精。多发生在水生动物的普遍生殖方式，如某些鱼类和部分两栖类等。,【人工授精】是指采用非性交的方法，在体外留取精液，经过处理后直接将精液置于女性的生殖道内，任其精子和卵子自然受精、妊娠，达到生育目的。,【（人工）体外受精】采集雌性动物的卵细胞和雄性动物的精子，其在试管中受精。,(二)疑难问题,精子在体内和体外分别是如何获能的？,【精子获能】当精子射入阴道内，精子离开精液，经宫颈管进入子宫腔及输卵管腔，精子顶体表面的糖蛋白被生殖道分泌物中的、淀粉酶降解，同时顶体膜结构中胆固醇与卵磷脂比率和膜电位发生变化，降低顶体膜稳定性的过程。即是指精子获得穿透卵子透

27、明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。【精子获能的生育意义】去除精子表面的覆盖物，暴露出精子膜表面与卵子相识别的位点。增加精子活力，改变膜的通透性。精子头部出现流动性不相等的区域，为精子膜与顶体膜融合做好准备。精子顶体后区膜的流动性加大，以准备与卵膜结合。,【精子获能的处理方法】1、培养法：对啮齿动物、家兔和猪等动物。将取自附睾的精子放入人工配制的获能液中，培养一段时间后精子就可获能。这种方法称为培养法。2、化学诱导法：对于牛、羊等家畜。将精子放在一定浓度的肝素或钙离子载体A23187溶液中，用化学药物诱导精子获能，称之为化学法。,胚胎干细胞究竟属于全能干细胞还是多能干细胞

28、？,全能性干细胞：处于8细胞期之前的每一个胚胎细胞（包括受精卵）多能性干细胞：胚胎干细胞专能性干细胞：神经干细胞,受精作用时，精子入卵的路线图,哺乳动物胚胎发育的过程及特点,体外受精技术流程图,胚胎移植的基本程序（以牛的胚胎移植为例）,回答下列问题，并绘制胚胎分割示意图，标注分割线及其胚胎各部分结构名称。,在胚胎发育的哪个时期分割最好？透明带、滋养层、内细胞团的位置关系如何？将来的发育方向如何？分割时的注意事项有哪些？,胚胎移植流程图,问题探究,1、植物组织培养的一半程序是：（1）配制含有适当营养物质和植物生长调节剂的含0.7%-1%琼脂的培养基，倒在灭菌试管中凝固成半固体。2、胚胎分割的基本

29、过程将发育良好的胚胎移入含有培养液的培养皿中，在显微镜下用切割针或切割刀把胚胎分割开,或者采用酶处理等方式将卵裂球中的细胞分散开;分割的胚胎或细胞直接移植给受体,或在体外培养到囊胚阶段,再移植到受体内,着床发育产仔。,选修三教材处理,考点一、基因工程：基因工程的诞生、基因工程的原理及技术、基因工程的应用、蛋白质工程一基因工程的概念,由于基因工程是在DNA分子水平上进行操作,因此又叫做重组DNA技术。,二基因工程的基本工具（一）“分子手术刀”限制性核酸内切酶（简称限制酶）1来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。2功能：识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷

30、酸之间的磷酸二酯键断开。3结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。（二）“分子针线”DNA连接酶1分类：根据酶的来源不同，可分为EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,两种DNA连接酶(EcoliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键 区别：EcoIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。（三）“分子运输车”载体1.载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA片

31、段插入；具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。2.基因工程常用的载体有：质粒、噬菌体 和 动、植物病毒 等。最早应用的载体是质粒，它是细菌细胞中的一种很小的双链环状DNA分子。,DNA连接酶与DNA聚合酶作用的比较：,三基因工程的基本过程(一)获得目的基因1.获取方法主要有两种：从自然界中已有的物种中分离出来，如可从基因文库中获取。（将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体细菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库，建立基因文库，便于随时获取目的基因。）用人工的方法合成：常用方法有反转录法（根据mRNA反转录形成双链DNA）和化学合成法（知道了蛋白质的氨基酸

32、序列推测出mRNA,再推测出结构基因的核苷酸序列，利用游离的4种脱氧核苷酸合成DNA）获得原核细胞的目的基因可采取直接分离（鸟枪法），获取真核细胞的目的基因一般是人工合成。,2.利用PCR（聚合酶链式反应）技术扩增目的基因（1）PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA双链复制（4）特点：指数形式扩增（5）过程：每一次循环都包括：第一步：加热至9095DNA解旋链为单链（变性）；第二步：冷却到5560，引物与两条单链DNA结合（退火）；第三步：加热至7075，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成（延伸）。,(二)制备

33、重组DNA分子（基因表达载体的构建，这是基因工程的核心）1重组DNA分子（基因表达载体）的组成：除了目的基因外，还必须有启动子（RNA聚合酶识别和结合的部位，位于基因首端）、终止子（终止信号，位于基因尾端）、标记基因（鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。）2方法：同种限制酶分别切割载体和目的基因，再用DNA连接酶把两者连接。,(三)转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞，只有这个步骤没有发生碱基互补配对）1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是农杆菌介导转化技术（农杆

34、菌转化法），其次还有基因枪介导转化技术（基因枪法）和花粉管通道技术（花粉管通道法）。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞：CaCl2处理法。（在Ca2+作用下使受体细胞变成感受态细胞，感受态细胞在基因表达载体的缓冲液中能吸收DNA分子）,(四)筛选出获得目的基因的受体细胞、培养受体细胞并诱导目的基因的表达（目的基因的检测与鉴定）1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用DNA分子杂交技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出mRNA，方法是采用DNA分子杂交技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，

35、方法是采用抗原抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如抗虫或抗病的鉴定等。,四、基因工程的应用1运用基因工程改良动植物品种最突出的优点是：能打破常规育种难以突破的物种之间的界限。2基因工程的应用（1）植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。（2）动物基因工程：提高动物生长速度来提高产品产量、改善产品品质，用转基因动物生产药物，用转基因动物作器官移植的供体等。（3）基因诊断：又称为DNA诊断，是采用基因检测（利用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA分子做探针，利用DNA分子杂交原理测定被检测标本上的遗传信息）的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带病原体

36、。（4）基因治疗：指利用正常基因置换或弥补缺陷基因的治疗方法。途径有体内基因治疗和体外基因治疗。,五、蛋白质工程1、实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。2、基本原理：预期蛋白质功能测定蛋白质三维空间结构推测应有的氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列（基因）具有预期功能的蛋白质3、蛋白质工程的应用：通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。合成嵌合抗体。改变蛋白质的活性。,4、蛋白质工程与基因工程区别,考点二、克隆技术：植物的组织培养、动物的细胞培养与体细胞克隆、细胞融合与单克隆抗体一、植物的细胞工程 1.

37、理论基础（原理）：细胞全能性 全能性表达的难易程度：受精卵生殖细胞干细胞体细胞；植物细胞动物细胞2.植物组织培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞（无菌条件下培养）愈伤组织 试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。,3.植物细胞培养（1）概念：在实验室工厂化生产的条件下，将组织培养过程中形成的愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，进行悬浮培养，得到分散游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。（2）与植物组织培养的关系：植

38、物组织培养是基础。目的不同：植物组织培养的目的是得到更多的植物体，植物细胞培养的目的是获得人类所需的细胞（3）实例：成功地培养红豆杉的细胞，从中提取出重要的抗肿瘤药物紫杉醇。,（1）过程：,（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。,4.植物体细胞杂交技术（最终得到的是杂种植物）,二、动物细胞工程1.动物细胞培养（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它用分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或

39、组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。,（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：动物合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素

40、等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温度：哺乳动物多是36.50.5；pH：7.27.4。气体环境：95%空气5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。,2.动物组织培养：动物细胞培养与动物组织培养方法类似，主要区别是动物细胞培养过程中需要用胰蛋白酶等使组织块中的细胞离散，而动物组织培养过程中不需要使用胰蛋白酶等。3.动物体细胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因

41、：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。,（3）体细胞核移植的大致过程是：,（4）体细胞核移植技术的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。,4.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方

42、法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。,（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：,5.单克隆抗体（1）抗体：一个效应B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）B淋巴细胞在体外培养条件下不能大量增殖（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生特异性的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、

43、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。,考点三、胚胎工程：动物胚胎发育的基本过程、胚胎工程的理论基础、胚胎干细胞的移植、胚胎工程的应用一、哺乳动物生殖细胞的发生和受精作用1、精子的发生：精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂，最后形成4个精细胞，再经过成熟变形过程形成精子。形成场所：睾丸的曲细精管；储存部位：曲细精管的管腔中；营养来源：支持细胞；产生时间：初情期到生理机能衰退,2、卵子的发生：卵原细胞先进行 有丝分裂 后进行减数分裂，最后形成1个卵子。形成场所：卵巢、输卵管；时间：从 胚胎在性别分化后开始（胎儿时期完成

44、了初级卵泡的形成和在卵巢内的储备，），哺乳动物性成熟后，初级卵泡内的初级卵母细胞继续发育，1个初级卵母细胞1个次级卵母细胞第一极体（排卵前后完成），进入到输卵管；1个次级卵母细胞1个成熟的卵子第二极体（精卵结合过程中完成减数第二次分裂）。人类的次级卵母细胞停留在减数第二次分裂的中期并从卵泡中排出。,3、受精作用：精子获能：精子在附睾中成熟后必须在雌性动物生殖道内经历一段时间才能获得受精能力的过程。卵泡液、输卵管分泌物、血清等液体可使精子获能。（1）受精作用的定义：卵细胞和精子相互识别、融合成为受精卵的过程。（2）受精作用的场所：输卵管的壶腹部（3）受精标志：第二极体的形成（在卵黄膜和透明带间隙

45、可观察到两个极体）；受精完成标志是雌雄原核融合成合子。（4）受精作用的结果：使单倍体的精子和卵子结合形成二倍体的受精卵，染色体数目恢复到体细胞中的数目，其中一半染色体来自父方，另一半来自母方。（5）减数分裂和受精作用的意义：对于维持每种生物前后代体细胞中染色体数目的恒定，对于生物的遗传和变异，都是十分重要的。,二、哺乳动物胚胎发育的基本过程受精过程的完成，标志着胚胎发育的开始。起点：受精卵；终点：幼体；包括卵裂（细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加）、囊胚（细胞开始分化，其中个体较大的细胞叫内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织）、原肠胚、胚层分化等主要阶段。,三、胚胎工程的概念及技术手段

46、1、胚胎工程是对动物生殖细胞、受精卵和早期胚胎细胞所进行的多种显微操作和处理技术，由体外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术等组成的现代生物技术。胚胎发育学是胚胎工程的理论基础。2、体外受精技术：是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。属有性生殖过程体外受精技术是哺乳动物胚胎移植技术、克隆技术、转基因技术和性别控制技术不可缺少的组成部分。基本原理：人工模拟体内环境，包括营养、温度、pH等，使初级卵母细胞成熟，同时使精子获能，最终完成受精作用，并有计划地保存胚胎等。3、卵母细胞的采集和培养 对体型小的动物用促性腺激素处理，从输卵管冲取卵子

47、（可直接受精）；对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞（要在体外培养成熟）。,4、胚胎移植技术a概念：将雌性动物的早期胚胎移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。b优势：可以充分发挥雌性优良个体的繁殖潜力，缩短供体本身的繁殖周期。c胚胎移植的生理学基础：同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的（对供体和受体进行同期发情处理）；早期胚胎形成后处于游离状态，为胚胎的收集提供可能；受体对移入子宫的外来胚胎基本不发生免疫排斥反应；移入受体的供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。d胚胎移植的程序：对供、受体母牛进行选择，用激素进行同期发情处理；对供体母牛用激素做超数

48、排卵处理；选择同种优秀公牛配种（有性生殖过程）；对胚胎进行收集（此时胚胎处于游离状态）；对胚胎进行质量检查（此时胚胎应发育到桑椹胚或囊胚）；胚胎移植（或冷冻保存）；检查受体母牛是否受孕；产下胚胎移植的犊牛。,5、胚胎分割技术a概念：用显微手术方法将早期胚胎切割成2、4、8等份，经体内或体外培养后植入受体，以获得同卵双生或同卵多生后代的技术（可看作是动物无性繁殖或克隆）。b基本过程：选择良好的桑椹胚或囊胚移入培养皿中，用分割针或分割刀片将其切开，吸出其中的半个胚胎注入透明带中或直接移植给受体。（注意：内细胞团要均等分割，否则会影响胚胎的恢复和进一步发育）6、胚胎冷冻保存技术a概念：将动物的早期胚

49、胎，通过特殊的保护剂和降温措施，使其长期保存在超低温环境下。B优势：可以使胚胎移植不受时间和地域的限制，简化引种过程。7、动物性别控制技术：指通过人为干预，使动物按照人们的愿望繁衍所需性别的后代的技术。,四、胚胎干细胞的研究及其应用（一）胚胎干细胞及其研究进展1干细胞：动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的种子细胞。按照分化潜能的大小，干细胞基本上可分为专能干细胞（只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞）、多能干细胞（具有分化成多种细胞或组织的潜能却失去发育成完全个体能力的细胞）和全能干细胞（可以分化为全身各种细胞，

50、并进一步形成机体的所有组织、器官）。,2成体干细胞：存在于胎儿、儿童和成人组织中的多能干细胞。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于骨髓、脐血、外周血中。3胚胎干细胞：由早期胚胎囊胚或原始性腺胎儿中分离出来的一类细胞，又叫ES或EK细胞。具有增殖能力并保持未分化状态、在一定的条件下可以向各种组织和器官分化、易于进行基因改造操作等特点。如内细胞团细胞（位于囊胚的囊胚腔一侧）特征：形态上体积小、细胞核大、核仁明显；功能上具有发育的全能性，即可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。,（二）胚胎干细胞的应用：用于治疗人类疾病，如利用ES细胞诱导其分化成新的组织细胞特性，移植ES细胞可使坏死或退