【教学课件】第十三章生物技术在植物育种中的应用.ppt

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1、第十三章 生物技术在植物育种中的应用,1、教学的基本要求（1）了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法；（2）了解作物的转基因技术的原理和基本方法；（3）了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法。,2、教学基本内容第一节 细胞工程与作物育种 一、细胞和组织培养与作物育种 二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节 作物育种的转基因技术 一、转基因技术的发展现状 二、*转基因育种的程序 三、转基因作物品种的选育 四、转基因作物的生物安全性第三节 分子标记辅助选择育种 一、*分子标记的类型和特点 二、常用分子标记的原理和遗传特性 三、MAS育种方法,第十三章 生物技术在作物育种中的应

2、用第一节 细胞工程与作物育种,植物细胞工程（plant cell engineering）是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（in vitro）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。,细胞工程与作物遗传改良有着密切关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种。,早期，哈布兰特在前人细胞学说的影响下，提出高等植物的组织和器官可以不断分割，并进一步提出了植物细胞全能性（cell totipotency）理论。,植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础。细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力，也包

3、括植物细胞经脱分化再形成植株的能力。,1904年，Hanning用萝卜的胚培养，获得小植株，为组织培养的工作奠定了基础。,1934年，White对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，获得了离体培养的真正成功。三年后，White又发现B族维生素对培养物的生长有重要作用。,经过几年的努力，以White为主的几位科学家建立了植物组织培养（plaint tissue culture）的综合培养基，成为以后各种培养基的基础。,1948年，Skoog等发现腺嘌呤/生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式。Miller（1956）发现激动素

4、比腺嘌呤更能促进芽的形成。,1958年，Stewart&Shautz从胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使50多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展。1964年，Guha等从曼佗罗花药培养出单倍体植株。,1970年，Kameya等利用花粉培养获得单倍体植株。1971年，Takebe等首次从烟草原生质体获得再生植株；1972年，Carlson等获得第一个烟草种间体细胞杂种植株。,至此，在愈伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，充分证实了植物细胞的全能性。植物组织培养流程示意图如下。,外

5、植体来源外植体培养 愈伤组织 再生小植株再生植株,植物细胞工程的应用在20世纪60年代就已受到重视，但真正的应用研究在70年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随后又育成了一些水稻、小麦新品种。,经济植物的快繁与脱毒、体细胞变异的筛选、新种质的创造、细胞器的移植、DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。,一、植物的细胞和组织培养技术,（一）培养基及其组成,1、培养基（Medium）的种类和特点 常用的培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。,2、培养基的成分 培养基中都应包括植物生长必需的16种营养元素和某些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无

6、机营养物、有机物质和植物生长调节物质（表）。,表 植物组织培养所需的养分和激素 水 有机物 大量元素 微量元素 PH 糖 N Fe Co 氨基酸 P Zn Ni维生素 K B Al 生长素 Ca Mn Mo 细胞分裂素 Mg Cu I调节物质 赤霉素 S 脱落酸 乙烯 酵母提取物 椰子汁 成分不定物质 植物提取物 水解酪蛋白 蛋白胨,（二）培养基的配制,1、母液的配制 为了减少配制培养基时每次称量药品的麻烦，减少极微量药品在每次称重时误差，一般先配制高浓度的储备液，即母液。,大量元素可配成10倍母液，使用时每配制1000ml培养基需要从母液中取100ml。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在

7、混合次序上应最后加入Ca2+，混合时要边加边混合。,微量元素因为使用量低，一般配成100倍甚至1000倍母液，使用时每配制1L培养基从母液中取10ml或1ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。,第三种母液即铁盐，铁盐必须单独配制，若与其它元素混合易造成沉淀。一般采用鳌合铁，即FeSO4与EDTA钠盐的混合物，一般扩大200倍。,EDTA钠盐须用温水溶解，然后与FeSO4液混合，在7580之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应Fe+。,第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成混合母液，一定要分别配成单独的母液，浓度为每毫升含0.

8、1、1、10mg，使用时根据需要量取。,最后一种母液是激素，每种激素应单独配制母液，其浓度为0.1、0.5或1.0mg/ml。多种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。,IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少量95%酒精，再加水定容；NAA可溶于热水或少量酒精后，再加水定容；2，4-D不溶于水，可用1mol的NaOH溶解后再定容；KT和BA应先溶于少量1mol HCl中，然后定容。,表 一些植物组织培养基的成分（mg/L）-成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER-大量元素NH4NO3 1650-1650-720-1650 1200KNO3 1900 25

9、27.5 1900 80 950 2500-1900 1900CaCl22H2O 440 150-200 75 440 440CaCl2-440-166-MgSO47H2O 370 246.5 370 750 185 400 250 370 370KH2PO4 170-170-68-170 340NH4H2PO4-340-（NH4）2SO4-134-Ca（NO3）24H2O-300-NaNO3-600-NaH2PO4H2O-150-19-125-KCl-65-750-,-成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER-微量元素KI 0.83 0.75 3.32

10、 0.75-1 0.01 0.83-H3BO3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSO44H2O 22.3-89.2 5 25-0.1 22.3 2.23MnSO4H2O-10-10-Zn SO47H2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6-Zn SO44H2O-Zn Na2EDTA-15Na2MoO42H2O 0.25 0.25 1.0-0.25 0.1-0.25 0.025MoO3-0.001-Cu SO4-0.2-Cu SO45H2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025-0.03 0.025 0.0025CoCl26H2O 0.

11、025 0.025 0.1-0.1-0.025 0.0025CoSO47H2O-0.03-AlCl3-NiCl26H2O-0.03-,-铁盐成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER-FeCl36H2O-1-Fe2(SO4)3-2.5-FeSO47H2O 27.8-27.8-27.8 15-27.8 27.8Na2EDTA2H2O 37.3-37.3-37.3 20-37.3 37.3NaFeEDTA-28-1-,成分 MS B5 OR White Nitsch SH Heller LS ER 有机物盐酸吡哆醇 0.5 1 1 0.01 0.5 0.5-0

12、.5盐酸硫胺素 0.1 10 13 0.01 0.5 5-0.4 0.5烟酸 0.5 1 1 0.05 5 5-0.5肌醇 100 100 100-100 1000-100-甘氨酸 2-3 2-2脯氨酸-1381-叶酸-0.5-生物素-0.05-蔗糖 3%2%3%2%2%3%-3%4%,2、培养基的配制 以配制1L培养基为例，培养基配制方法如下：,混合各成分母液。取大量元素母液100ml、微量元素母液10ml、铁盐母液5ml于一个1L烧杯中，依次加入有机成分和激素，并加水至500ml。,熔化琼脂：称78g琼脂和所需蔗糖于另一1L烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。,将（1

13、）和（2）混合，搅拌均匀，补水至1000ml。,调PH。一般用0.1mol NaOH或1N HCl调PH至所需PH。一般PH调至5.8，但也有PH调到7.0的，不同材料的最适PH不一样。对培养基的凝固来说，PH较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；PH过低，低到4.0以下时，培养基很难凝固。,分装：将培养基分装于100ml或50ml三角瓶中，每瓶50或30ml左右，封口包装。,灭菌：一般用1.1kg/cm2压力，在121下灭菌1520min。灭菌时间应根据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引起培养基成分降解。,放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以

14、免形成斜面。,（三）无菌操作方法,1、消毒剂 在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功的基本保证。要保证这一点，取材时应选取植物组织内部无菌的材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严格防止病虫。,应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好避免选用田间材料，选用无菌苗较好。非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见表。,表 植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法-消毒剂 使用浓度 消除难易 消毒时间 消毒效果（%）（min）-次氯酸钠 2 易 530 很好次氯酸钙 910 易 530 很好漂白粉 饱和溶液 易 530 很好氯化汞 0.11.0 较难 210

15、最好酒精 7075 易 0.22 好H2O2 1012 最易 515 好溴水 12 易 210 很好AgNO3 1 较难 530 好抗生素 450mg/L 中 3060 较好,对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水洗，自来水冲净，在70%酒精或1L HCl中浸30s，再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样，研究者应根据不同材料确定具体消毒方案。,2、无菌操作 准备好接种材料用的培养基、待消毒的材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、70%酒精等。,将

16、超净工作台打开，让其运行10min左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将HgCl2（0.1%）倒入有待消毒材料的烧杯中，510min后取出另一盛有无菌水的烧杯中，无菌水冲洗34次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。,无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。,3、无菌培养 材料接种后移入培养室培养，一般培养室要求非常卫生，恒温，有理想的光照控制系统，一般材料要

17、求25左右，晚上一般不低于20。,二、细胞和组织培养与作物育种,（一）体细胞克隆变异及其育种利用,在近50年中，以植物组织培养为基础的生物技术的研究与发展为植物育种提供了一些新的实验方法和手段，并且培养出一些在生产上有利用价值的品种。,体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异。Larkin等（1981）在其综述文章中开始使用“体细胞克隆变异”（somaclonal variation）这一概念。,为了区分来源于体细胞和单倍体细胞的变异，Evans将来自配子体组织的变异称为“配子体克隆变异”（gametoclonal variation），以与体细胞克隆变异区分开。,对于遗传

18、变异的分析而言，Orton为了统一术语，引进了R0、R1、R2等，分别表示再生当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。,1、体细胞克隆变异的遗传基础（1）染色体数目变异 最多见的是多倍体，主要是培养基中使用了细胞分裂素。,变异的大小与培养状态、年龄、原始材料的倍性及培养时期有关。研究发现：二倍体变异的频率随培养时间的延长而降低，四倍体变异的频率却随培养时间的延长而增加。,（2）染色体结构变异 染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要的是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的存在。,（3）点

19、突变 这类突变可分为多种类型，一种类型是自发突变，最早证实点突变存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗chlorsulfuron的突变体。很多通过细胞筛选获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。,另一种点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。由于培养过程中，培养物一直处于诱变的环境条件下，所以突变究竟是自发还是诱发很难搞清楚。,第三种点突变是基因的表达及基因放大或衰减。高等植物的某些基因在发育过程中受到某一环境刺激，可以放大自己，即基因的拷贝数大量增加，这意味着该基因转录的mRNA及蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发现这一现象，后来在植物中发现也存在。,比如，对某一物质的抗性，可以通

20、过逐步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很好例证。同样，也发现植物细胞DNA的丢失（衰减），如大豆悬浮系经过较长时间的培养，其核糖体基因丢失了1/3。,第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但仍影响基因的表达。这种变化包括：某一基因拷贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程中基因的转变。,转座因子也是造成体细胞突变的原因之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控。,最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。Gengenbach et al（1975）利用玉米T小种毒素筛选获得了抗T小种的细胞系，这个基因已知位于胞质中。

21、,离体培养细胞会产生各种类型的突变体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状的改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异可以进行高光效育种。,培养再生植株中出现不育性的频率较高，但大多为核基因的突变，可以用来培育不育系。产量和品质的突变必须在田间通过适当的分析才能确定。实验室内细胞水平的突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。,2、突变体的筛选 为了增加突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步的工作。使用多大剂量和处理多长时间才能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。,在突变体筛

22、选中常采用两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法是将培养物接种在含有最低全部致死剂量的培养基上，表现出生长的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。,可以看出，这种方法是一次就把筛选压设定很高，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出的能生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。,但在有些情况下这种方法不一定实用，有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜培养基上。,在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长的快，通过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超过最低全

23、部致死浓度时也能旺盛生长的细胞系。,但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。可见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长的细胞系。,筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是操作困难。,利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。,悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定的操作

24、复杂性。花粉/小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很容易表现出来，也很易纯合。,3、在作物改良上的应用 利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。,优良品种 细胞培养 R0 R1群体 改良的体细胞克隆 确定遗传方式 田间实验 遗传稳定性测试 多点田间实验 育成新品系 继续田间实验，种子富集 区域试验 审 定 投入生产图 利用体细胞克隆变异育种的技术路线,（二）单倍体细胞培养及育种利用,1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值 花药培养（anther culture）是指在获得单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系

25、更加完善。单倍体在遗传和育种研究中有如下优点：,（1）后代的快速纯合 通过单倍体迅速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。,母本 父本 F1 花药培养 F2 花粉植株 加倍 品系比较试验 选择鉴定 区域试验图 杂交育种与单倍体育种的周期比较,（2）提高选择效率 如果某一性状受一对基因控制，在AAaa F2中，纯合AA个体只有1/4。如F1采用花药或花粉培养，产生的后代中AA个体占1/2，比常规杂交育种提高一倍。,（3）排除杂种优势对后代选择的干扰 对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂

26、合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差。采用DH群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代表真实变异。,（4）遗传研究的良好材料体系 单倍体是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群构建、QTL估计及定位等数量遗传学的良好材料。尤其是近代分子生物学的发展，DH系成为分子标记作图的良好群体，它在一定程度上成为一种永久BC或F2群体。,（5）突变体的筛选 由于单倍体的各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率，利用这一体系获得各种突变体的事例已很多，这里就不一一赘述。,2、离体培养条件下的小孢子发育

27、 小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉的正常发育途径受到抑制。,3、影响花药培养的因素（1）供体植株的生长条件 供体植株的生长条件对培养效果有重要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强的条件下，其花药才能有反应。环境条件对于不同的植物种有很大不同，所以没有一个固定的环境控制模式。,（2）供体植株的年龄 供体植株对培养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植株的花蕾易于培养。,（3）花粉发育时期 用于培养的花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处

28、于第一次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。,（4）花蕾和花药的预处理 对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。如大麦花药，4处理28d，或7处理14d，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离的花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料需不同的预处理方式，没有一个固定模式。,（5）培养基 究竟使用固体或液体培养基应根据培养材料的要求定。多数情况下，MS、N6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用的较多。花药培养时往往需要一定的渗透压，有的要求低浓度的蔗糖（2%4%），有的要求高浓度的蔗糖（8%12

29、%）。,二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13%17%。培养基中所添加的维生素和激素对培养效果可产生重要影响。对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可以改善培养效果。,（6）培养条件 多数植物在25下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸苔属，在高温35下处理几天，然后进入25培养能收到最好效果。花药培养一般在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养。此外，接种花药的外植体置向、培养密度等有时对培养效果也有影响。,4、花粉（小孢子）培养 花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体

30、培养的技术。其优点在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株，但它的培养难度大。,5、单倍体诱导中存在的问题 对于多数植物来讲，能形成有活力胚的花药百分率很低，除此之外，还有很多问题存在。,通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象，或刚开始生长便导致胚败育；在产生单倍体的同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以办到；白化苗难以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很难分离出单倍体，因为单倍体细胞的生长很易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖。,6

31、、单倍体细胞培养与植物育种 单倍体是高度不育的，需要进行加倍处理才能应用。秋水仙素是常用的染色体加倍药剂，可以用1%的秋水仙素对正处于对数生长期的悬浮细胞进行处理，一般24h左右。也可在固体培养基中加适当浓度的秋水仙素。,花粉植株在培养过程中可以自然加倍，但频率很低。将单倍体植株的组织或器官用作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞在培养过程中自然加倍也是一种方法。,A品种 B品种 F1杂交种 小孢子培养或花药培养 单倍体培养 染色体加倍 重组纯合系 选择 重组了A和B品种优点的纯系 自交、田间测试 遗传稳定性测试 田间测试 新品系确定遗传基础 品种 亲本-杂交 推广利用 杂种优势利用 图 单倍

32、体细胞培养及育种技术,（三）幼胚培养与远缘杂交育种,植物胚胎培养（embryo culture）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术。植物幼胚和胚珠培养是植物远缘杂交育种的重要辅助手段。,（四）种质的长期保存,细胞培养和茎尖培养再生植株技术的实现为离体试管保存种质提供了条件，这种方法只需要较少的空间就能保存大量的无性系，而且保存过程中可避免病虫害的侵袭，在特定的条件下可以长期保存，需要的时候只需将材料取出来迅速繁殖即可。,保存的材料可以是多种类型，依植物材料的性质和需要定。材料可以是愈伤组织、茎尖、幼胚、花粉形成的单倍体愈伤组织等。,保存的方法主要有缓慢生长保

33、存法和超低温保存法。对于生长缓慢的材料，在常规培养条件下就能保存很长时间，但大多数植物离体培养时需要频繁继代，需要通过降低生长速度来延长继代间隔。,缓慢生长法主要是基于改变培养环境和修改培养基来实现对种质资源进行短期和中期保存。缓慢生长法的保存技术包括降低培养温度、减少氧气含量、将组培材料脱水干燥等。,超低温保存法可以长期保存植物材料，不需要继代，其原理是在超低温情况下，使生物的代谢和衰老过程大大减慢甚至完全停止。,超低温通常指低于-80的低温，保存介质或容器有干冰（-79）、超低温冰箱（-80150）、液氮（-196）和液氮蒸汽相（-140）等，其中液氮最常用。,超低温保存与缓慢生长保存法相

34、比，具有一定的技术复杂性，使用时应根据具体的材料和相关文献确定技术方案。,（五）脱毒及繁殖重要品种或材料,多数作物，尤其是无性繁殖作物，由于病毒或其他病原菌的侵袭，有一个产量和品质下降的过程，常常需要对受病毒侵染的材料进行脱毒处理。病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受侵染的植株中，顶端分生组织一般不带毒，或只携带浓度很低的病毒。,由于存在这一规律，我们便可利用茎尖培养的方法使植物脱去病毒。植物茎尖脱毒在无性繁殖作物的提纯复壮中有很重要的应用价值，如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等。,组织培养在植物快速繁殖中有很好的用途。大多数果树和观赏植物是高度杂合的，它们的种子后代无法与原品种相同，在这种情

35、况下，如要保持原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖。此外，茎尖培养在保存稀有野生资源、繁殖不育远缘杂种等方面具有优势。,植物材料的快速繁殖主要是通过诱导茎芽形成实现的，可以通过两种途径使茎芽增殖。一种是通过愈伤组织诱导丛生芽形成，然后分株培养，便可获得大量遗传上基本一致的无性系。,另一种是诱导茎尖或不定芽萌发或形成丛生芽也可达到快速繁殖的目的。一些腋芽、植物器官或节段起源的芽，一般处于休眠状态，通过离体培养可解除休眠而萌发。植物的脱毒与快速繁殖技术很易使某些作物，如甘薯、果树、经济林木等形成产业化，创造显著的经济价值。,（六）人工种子的生产,人工种子（artificial seeds）是指将细胞培

36、养所产生的体细胞胚或其类似物，经过有机化合物的包埋而形成的能在适宜条件发芽的类似于天然植物种子的颗粒体。它通常由三部分组成：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮。,人工种子的研究在农业生产上有重要意义，它在固定杂种优势、快速繁殖良种和不育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都有潜在价值。对木本植物来说，用人工种子可不必等待漫长的有性世代，即可以快速繁殖优良性状的转基因植物推广到生产上去。此外，人工种子体积小，便于运输。,三、植物原生质体培养和体细胞杂交,植物原生质体（protoplast）是一个没有壁的细胞，由于没有壁及质膜暴露在外界环境下，使原生质体的结构变得很脆弱，在没有一定的渗透剂和稳定剂的情况下

37、，很快会破裂。由于上述特点，使得原生质体的操作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞的全能性，具有了同正常细胞一样的特性。,（一）原生质体的分离,原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，其先决条件是要有一个合适的渗透压。,1、分离方法 分离原生质体的方法一般有机械分离和酶法分离两种。,机械法分离是早期采用的分离方法，先对材料进行质壁分离处理，然后切割，这一过程中会释放出少量的不受损伤的原生质体。用这一方法仅能从液泡很大的材料中获得原生质体，而不能应用于分生细胞。,酶法分离原生质体是目前常用的方法，可分为一步法和二步法。一步法是将果胶酶（pectinase）和纤维素酶（

38、celluluse）等混合处理材料，直接分离获得原生质体。,二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。目前多用一步法。,2、影响原生质体分离的因素（1）材料来源 叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很容易获得而且能充分供应，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。从叶片来源的原生质体在遗传上较一致，而培养细胞来源的原生质体则不然，因为培养细胞在培养过程中易产生变异。,但由愈伤或悬浮系来源的原生质体，可以避免植株生长环境的不良影响，还可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作简便，无需消毒。此外，从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生

39、质体。,（2）渗透压 原生质体分离之前必须确定一个适合的渗透压。在这种渗透压下，原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。,（3）酶 植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素组成，需要一定的酶组成才能降解它。广泛使用的商品酶制剂可以从很多公司购买。,（4）分离培养基 Ca2+对原生质体的产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁的主要成分，同时能稳定膜结构。另外，Mg2+、PO43-对于原生质体活力的保持也有重要作用，所以分离原生质体的培养基中除酶外，一般含这些离子。,（5）培养条件 酶处理时的温度和pH最重要。PH使用范围为，可是，高pH（大于6.0）一般有利于原生质体的生存，可能是高p

40、H降低了细胞壁降解时产生的有害酶活性和存在于分离培养基中的毒性物质的活性。为了防止pH的变化，常加入MES2（N-morpholino）-ethanesulfonic acid。这是一种缓冲剂，一般使用量为3mM。,分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是，高温下短时间分离的原生质体不适于培养，它们易发褐和破裂。常用温度为23-32。有的材料温度很低，5-10。也有高、低温结合使用的。酶处理时一般在暗处培养，但有些材料在光下有利。培养过程中，间断低速震荡有利于酶渗透。,（6）组织前处理 高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。,3、原生质体

41、的收集、纯化和活力测定 原生质体酶解完成后，将其用200目筛过滤，滤液再用400目过滤，收集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液同样渗透剂的无酶CPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，反复几次，便完成原生质体的洗涤工作。,原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，具体操作方法可参考专业书籍。用Evans blue或FDA测定原生质体活力，以确定原生质体的分离效果。,（二）原生质体培养,原生质体培养前必须调到一定密度，一般103-105/ml的密度比较适合原生质体培养。原生质体的培养方法各种各样，依作物和材料来源而异。平板培养、液体浅层培养、悬浮培养、液-固双层培养、琼脂糖包埋、

42、看护培养等是原生质体培养常用的方法。,但不管哪种培养方法，在培养过程中，都应根据细胞生长情况不断降低渗透压。待肉眼可见的细胞团形成后，便可转移到普通细胞培养基上进行细胞繁殖和分化工作。,影响原生质体培养的因素很多，物理条件如密度、光照和温度等都会影响培养效果。低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放的有害物质脱毒。,原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。,原生质体培养一般在22-25进行，高、低温都有害。但有的植物要求27-30，在25时不能形成愈伤组织。,原生质体比细胞

43、需要更复杂的培养条件，有时需要在有饲养层细胞的情况下原生质体才能再生。培养基无机营养和有机营养组成都对培养效果有显著影响。,选择适当的渗透压对于获得大量原生质体并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇调节渗透压。在培养过程中一般需降低渗透压以促进分裂。,对于琼脂糖包埋培养，可将其切成小块，转移到低渗的液体培养基中漂浮培养，液体培养则可加入低渗的一定体积的培养基，但一般每一步降低程度不超过25%。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，利于细胞分裂。,生长素对于培养早期壁的形成是需要的，最常用的是2，4-D，有时需要生长素与分裂素结合使用。

44、生长素的使用量一定要小心确定，因为它很容易使液泡长大或增加新液泡而使细胞分裂。,实验证明，生长素通过调节一些特异mRNA的合成而起作用。分裂诱导后，需要转到低生长素的条件下才能促进细胞生长。此外，维生素、水解酪蛋白、椰汁等，对原生质体的生长有促进作用。在培养过程中也需注意一些氨基酸的使用。,原生质体形成愈伤团后，便可采用常规的愈伤组织培养方法使细胞扩大繁殖或分化形成植株。,（三）细胞融合（体细胞杂交）物种间生殖隔离阻碍了物种间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不

45、存在的植物类型，有效地拓宽了植物育种的资源。,1、融合方法 分离的原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以一般要在诱发条件下才能发生融合。异种原生质体首先发生膜接触，然后两个原生质体形成细胞质桥，最后两种细胞质将两个核包围起来而完成融合。常用的融合方法简单介绍如下：,（1）NaNO3处理诱发融合 由NaNO3诱导的可重复、控制的离体原生质体融合是由Power等（1970）报道的。利用这一融合剂，Carlson等（1972）虽然在植物中获得了第一个体细胞杂种，但这种方法存在的严重缺陷就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。这种融合的机制一般认为是Na+造成了膜电位的改变。,（2

46、）高pH高浓度钙离子处理 烟草叶肉原生质体在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）条件下能很快诱发融合（37），但融合频率不很高，高pH也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合。高Ca2+高pH诱发融合的机制尚不很清楚，一般认为是改变了膜位及膜的物理结构。,（3）PEG（聚乙二醇）处理 PEG诱导不仅融合频率高，而且使二核融合频率增加且无特异性。PEG是一个高分子量的多聚体（15006000），25%50%PEG可立刻刺激原生质体引起收缩，随后发生聚集。PEG诱发融合后应逐步去除。影响原生质体聚集及随后融合的因子很多，如PEG的分子量及浓度、原生质体的材料来源、分离原

47、生质体时使用的酶制剂、离子种类和浓度、融合温度等。,（4）电融合 当两个原生质体处于接触状态时，给一个512amp的电流持续15s，原生质体首先受刺激，然后马上融合。应用电融合时，原生质体轻微收缩，表明其膜状态有一个短暂的变化。,电融合包括两个步骤：电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。融合：由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合。,原生质体融合很受重视，因为它避免了化学物质的潜在毒害。融合率与原生质体来源、体积、念珠链的长度、脉冲持续时间及电压等因素有关。在融合时应注意一个问题，即电刺激会造成液泡中一些毒性物质的渗漏，影响原生质体活力。如果能用一种方法将液

48、泡分离出来，再诱导融合较好。,2、融合方式 原生质体融合有两种融合方式，即对称融合和非对称融合。这两种融合方式都能产生三种类型的杂种：综合了双亲全部遗传物质的对称杂种；部分遗传物质发生丢失的非对称杂种；只具有融合双亲一方核遗传物质的胞质杂种。,对称融合即双亲的核质组装在一起的融合。非对称融合指在融合前对一方亲本原生质体施加一定的处理，纯化其细胞质，再和另一方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞质杂种。,对称融合也可获得这两种杂种，因为一方的染色体会发生丢失。在进行非对称融合前，需要对供体和受体进行处理。对供体进行处理的目的主要是造成染色体的断裂和片段化，从而使供体染色体进入受体后部分或全部丢失

49、，达到转移部分遗传物质或只转移胞质基因组的目的。,对供体进行处理的方法有多种：射线（X、和紫外线）辐射原生质体；限制性内切酶处理原生质体；纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体，其中射线的作用最好。,为了减少融合后再生后代的筛选工作，研究者利用一些代谢抑制剂处理受体原生质体以抑制其分裂。常用的抑制剂有碘乙酸（IA）、碘乙酰氨（IOA）和罗丹明（R-6-G）。,R-6-G抑制线粒体氧化磷酸化，IA、IOA可以抑制线粒体氧化磷酸化或糖酵解过程，从而不能为细胞生长和发育提供能量。受IA、R-6-G和IOA处理的细胞和非代谢抑制剂处理的细胞（供体，核钝化，但线粒体正常）发生融合后，代谢上就会得到互补，从

50、而能正常地生长。,3、杂种细胞的筛选 原生质体融合后，必须有一个可行的办法分离出融合的杂种，如果培养条件只允许杂种细胞生长，而不允许亲本细胞生长当然最好。杂种细胞的筛选很重要，因为原生质体密度很高，亲本原生质体的生长很快掩盖杂种细胞的生长，除非杂种细胞了具有生长优势。常用的杂种细胞的筛选体系有如下几种：,（1）形态互补 利用两种原生质体形态色泽上的差异，在融合处理后，分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约有23个原生质体。在显微镜下可以找出异源融合体并标定位置。,（2）遗传互补 利用两个白化突变互补可以进行筛选。单个隐性突变性状（如白化）可以与某一形态性状结合起来用于筛选。如Daucus