2020年金纳米颗粒的合成精品版.docx

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1、目录摘要2Abstract31. 引言41.1. 传统实验方法51.2. 基于纳米颗粒的实验方法51.3. FRET 和 NSET51.4. 捕光材料一共轭聚合物61.5. 实验机理71.5.1嵌入染料TO 71.5.2阳离子共轭聚合物PFP 71.5.3实验过程92. 实验部分92.1. 实验材料92.2. 表征102.3. 金纳米颗粒的合成102.4. 金纳米颗粒的表面功能化1112.5. 金纳米颗粒表面DNA的固定122.6. 表面固定DNA的GNPs的杂化122.7. TO 和 PFP 的 NSET 实验122.8. 一个碱基不匹配的双链DNAS1核酸酶切反应的分析133.实验结果及分

2、析133.1. 以CPPs/GNPs/dsDNA复合物进行的核酸酶探测133.1.1. PFP量的优化133.1.2. GNPs-DNA 量的优化143.1.3. S1核酸酶探测163.2. 以CPPs/TO/GNPs-dsDNA复合物进行的核酸酶探测163.2.1.PFP量的优化173.2.2.S1核酸酶探测183.3. 用PG作为荧光探针19结论21参考文献22致谢24摘要我们使用共轭高分子/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物发展了 S1核酸酶的一种新 精选文档型检测方法，此方法利用了金良好的荧光淬灭性质和共轭高分子的信号放大特性。这种方 法是由于纳米材料表面能量转移（NSET）中，能量从

3、供体分子到纳米颗粒表面的转移遵 循可预测的约为70-100nm的距离。在此过程中，由于从共轭高分子到嵌入染料进而到金 纳米颗粒表面的NSET，不存在S1核酸酶的情况下将观察不到嵌入染料的荧光信号。而存 在S1核酸酶的情况下，双链DNA被切离金纳米颗粒的表面，NSET过程中断，从共轭高 分子到嵌入染料高效的荧光共振能量转移所得的嵌入染料的荧光得以恢复。关键词S1核酸酶分析，共轭高分子（CP），金纳米颗粒（GNPs），DNA，信号放大，纳米材料表 面能量转移（NSET），荧光共振能量转移（FRET）AbstractA new strategy for S1 nuclease assay has b

4、een developed using conjugated polymer/gold nanoparticle/dye-labeled DNA complex by taking advantage of good fluorescence quencher of gold nanoparticles and the amplification feature of conjugated polymer. This method is based on nanomaterial surface energy transfer (NSET) which energy transfer from

5、 a donor molecule to a nanoparticle surface follows a predictable distance as large as 70-100 nm. In this process, no signal of intercalated dye was observed in the absence of S1 nuclease due to the NSET from conjugated polymer to intercalated dye and further to the surface of gold nanoparticles. In

6、 the present of S1 nuclease, dsDNA was cleaved from gold nanoparticles which intermit NSET process, thus recovering the fluorescence of intercalated dye through efficient fluorescence resonance transfer (FRET) from conjugated polymer.Key WordsS1 nuclease assay, conjugated polymer(CP), gold nanoparti

7、cles(GNPs), DNA, signal amplification, NSET, FRET.1. 引言实时高选择性及高敏感的酶检测方法对于科研和经济都是非常重要的。DNA酶切反应，如限制及非限制酶参与了许多重要的生物进程，如复制，重组和修复。此外，环境中 DNA和酶的相互作用可能会导致遗传信息的改变进而引起健康问题。1-51.1. 传统实验方法传统方法已被建立用于测定核酸酶的活性，其中包括凝胶电泳，高效液相色谱法 （HPLC），电化学研究和酶联免疫吸附实验。6然而这些方法具有如下缺点，耗时，耗 DNA，不连续，费力，而且通常需要同位素标记。为了避免这些限制，近几十年来基于荧 光共振能量

8、转移（FRET）或非荧光共振能量转移淬灭机理的核酸酶分析方法得以发展。 7-101.2. 基于纳米颗粒的实验方法基于纳米颗粒NPs的实验方法已被广泛应用于化学及生物探测。纳米颗粒能用作许多 量子点及染料分子封装载体，已被主要用于荧光免疫分析的信号记录以提高检测灵敏度。 因为纳米颗粒NPs具有大的表面积及球形形状。DNA探针在其表面的固定具有高浓度。 此外，NPs悬浮液所提供的几乎均质的环境可促进DNA的固定及杂交。15然而，由于洗涤步骤中荧光分子的泄露，基于NPs的生物标记方法的潜在应用受到限 制。加之染料掺杂的NPs通常具有宽的发射波和较小的斯托克斯位移，这将导致激发和发 射信号间的交互调制

9、。引入荧光共振能量转移（FRET）将供体激发和受体发射间的波长分 离开是避免这些缺陷的一种有效方法。34由于荧光团能通过有效的非辐射能量转移在金球表面淬灭，基于荧光共振能量转移现 象，金纳米颗粒Au NPs已被应用于实验中。由于胶体金具有很强的淬灭能力，其具有大 的摩尔消光系数（10-20 nm金球约为105 cm-1 M-1）和有机染料纳摩尔亲和力。1.3. FRET 和 NSET存在另一种分子的情况下，荧光分子的激发能量可被转移到另一临近的分子上，从而 发光。这种现象称为能量转移。典型的能量转移机理是福斯特共振能量转移。FRET是激 发态供体通过远距离偶极相互作用将能量转移到近基态受体的一

10、种无辐射过程。11尽管具有可观的前景，这种利用FRET机理的方法的距离受到偶极机制性质的限制， 从而限制了距离的尺度。最近几个研究组报道了纳米材料表面能量转移（NSET）技术能 精选文档够测量约为FRET两倍的距离，其中能量从供体分子遵循可预测的距离转移到纳米颗粒表 面。使用金纳米颗粒作为能量转移的受体时，NSET和FRET有两方面的不同：（1）与距离 的关系从1/R6变化为1/R4,延长了可用的测量距离； 同一种纳米颗粒可以淬灭不同发 射频率的染料，可见范围横穿到近红外区。因此，NSET可用于距离超过10nm或需淬灭 多种染料的研究中。单一纳米颗粒能够同时淬灭多个具有不同能量的染料，从而在单

11、一实 验中进行多个距离的分析。131.4. 捕光材料一共轭聚合物共轭聚合物（CPs）具有离域结构，有利于光电部分的电子耦合，同时高效的分子间 及分子内能量转移引起了荧光信号放大。16-18这种光放大的原因是共轭高分子具有长 的由很多重复单元组成的高分子链。无论从哪里激发聚合物，激发能量将沿高分子链迁移 直至能量转移到邻近的受体（图1.1）。L Q agpmr%因此，使用共轭聚合物作为化学或生物传感原件已经获得了强烈的研究兴趣，尤其是 在生物分子如核苷酸和蛋白质的敏感的光学检测方面。19-24最近，王等人报道了量热 法及基于FRET使用阳离子共轭聚合物/DNA复合物用于核酸酶放大分析的荧光方法。

12、 25,26尽管经证实这些实验方法是可靠，灵敏，方便的，由于需使用荧光标记的DNA仍 受到限制。1.5. 实验机理考虑到传统方法的缺陷，如耗时，耗DNA，不连续，费力及通常需要同位素标记，提 出了基于FRET的核酸酶分析方法。然而检测的长度受到偶极机理性质的限制。此外，由 于需要荧光标记的DNA，而这是不利于检测的，量热法和基于FRET使用阳离子共轭聚合 物/DNA复合物用于核酸酶放大分析的荧光方法受到限制。因此，我们提出了一种新的概 念，利用共轭聚合物/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物进行具有灵敏性，可信度及统一 平台的无标记核酸酶活性检测，以此攻克这些缺陷。通过使用GNPs （金纳米颗粒

13、）这种 检测系统扩展了测量距离，同时通过直接将发色团嵌入DNA结构攻克了需使用荧光标记 的缺陷，从而获得了无需标记的核苷酸酶活性检测平台。1.5.1嵌入染料TO实验所使用的嵌入染料是噻唑橙（TO），TO的结构如图1.2所示。TO是一种具有由 甲炔基连接的苯并噻唑和哇琳基不对称菁染料，在水溶液中TO是非荧光分子。当存在DNA 时，TO通过将芳香基插入DNA碱基对中与DNA结合。因此，与DNA结合后TO的荧光 量子产率得以提高。荧光发射的增强是由于芳香基间的甲炔基旋转的限制关闭了非辐射衰 变通道。27图1.2.噻唑橙的化学结构1.5.2阳离子共轭聚合物PFP实验中选择阳离子共轭聚合物PFP （结构

14、如图1.3所示）作为光放大捕光高分子。PFP 的最大发射波长为425nm，TO的最大吸收波长为510nm，如图1.4所示。18 PFP发射光 谱和TO吸收光谱间从400nm到550nm的光谱重叠符合从能量供体PFP到能量受体嵌入 染料TO的有效FRET的要求。380nm波长的光照射选择性激发了 PFP，进而引发从PFP 到嵌入DNA碱基对的TO的FRET。28-29能量转移过程将引起荧光信号的显著放大。HjC g图1.4. PFP化学结构宜霎卷一 PJwM/cnz一0.040Absorbance400440Wavelength (nm)nm) 及图1.5.PFP的荧光光谱（空心圈，=380TO

15、在水中的的吸收光谱（实心圈）18精选文档1.5.3实验过程图1.6.使用共轭聚合物/金纳米颗粒/染料标记的DNA复合物进行核酸检测的示意图如图1.6所示，该检测系统是由三部分组成的：DNA （紫色）功能化的金纳米颗粒（绿 色），嵌入型染料（蓝色），以及水溶性阳离子聚合物PFP （黑色）。将核酸功能化GNPs 与互补核酸（橙色）杂化。经嵌入型染料和PFP处理后，带正电荷的PFP和带负电荷的寡 核苷酸间的静电所用将使PFP和嵌入型染料接近，引起了从PFP到嵌入型染料的FRET过 程，进而引起在金球表面的NSET过程。使用S1核酸酶处理复合物后，双链DNA将在不 配对碱基处被切断，金纳米颗粒，PFP

16、和嵌入型染料间的距离将增大，从而引起了荧光恢 复。2. 实验部分2.1.实验材料表2.1.实验所用DNA名称序列含有5-SH结构的单链DNA5 SH CGCATTCAGGATTCTCAACTCGTA缺少一个核苷酸的互补DNA5 TATGAGTTGAGTATCCTGAATGC表2.2.实验所用缓冲溶液名称浓度pHPB缓冲液（a）0.1M PB7.0PB缓冲液（b）0.1M PB8.0洗涤缓冲液0.3M NaCl , 10mM PB7.0反应缓冲液2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mMZnSO44.6使用微孔过滤系统净化实验用水（MilliQ水），以制备缓冲液。其他试剂包括噻

17、唑橙（TO），PFP，聚乙烯毗咯烷酮（PVP），二硫苏糖醇（DTT），柠 檬酸钠，氯金酸（HAuCl4）以及S1核酸酶。所有的DNA，TO，S1核酸酶都是从Sigma Genosys公司购买的。PFP是从美国染料 源购得的。2.2. 表征所有的荧光测量是由Perkin Elmer LS55亮度光谱仪完成的。2.3. 金纳米颗粒的合成直径约为14nm的金纳米颗粒是用氯金酸（HAuCl4）的柠檬酸还原法制得的。30实 验所使用的所有玻璃仪器都用王水（三份HCl，一份HNO3）彻底清洗过，用蒸馏水冲洗 过，然后烘干备用。在1L装有冷凝器的圆底烧瓶中，于剧烈搅拌下加热50mL 1mM的HAuCl4至沸

18、腾。 快速加入5mL38.8mM柠檬酸钠，溶液逐渐由纯黄色变为酒红色。再持续加热10分钟， 移去热源，持续搅拌15分钟。对最终反应溶液进行表征，所合成的乳胶微粒的最大吸收 波长在520nm处，直径为13nm1.7nm。投射电子显微镜TEM及UV/Vis吸收光谱如图 2.1及图2.2所示。用每个金胶粒最大吸收波长处的摩尔消光系数结合UV/Vis光谱计算颗 粒浓度，e520nm=3.6X108cm-1 M-1。33图2.1.金纳米颗粒的TEM图图2.2.所合成的金纳米颗粒的UV光谱(样品：100uL GNPs + 2.4mL H2O 520nm=3.6x108 cm-1 M-1, A= c L,

19、Au NPs=12.22 nM 7.36x1011 /uL)。2.4. 金纳米颗粒的表面功能化简单来说，搅拌下在2.5mL胶体微粒溶液中加入PVP (4g/L500四L)。振荡混合物，于室温下培养3小时。由于PVP (化学结构如图2.3所示)可溶于水图2.3. PVP化学结构且具有良好的润湿性能易成膜，我们用它来进行金纳米颗粒的表面功能化同时部分中和电 荷。2.5.金纳米颗粒表面DNA的固定GNPs探针是根据文献中所提到的方法制备的。31首先将3-或者5-二硫键端基的 寡核苷酸序列浸在0.1M DTT（结构如图2.4所示）磷酸缓冲液（pH 8）中2小时，然后用 NAP-5柱除杂。将经除杂的寡核

20、苷酸（8nM）加入3mL金颗粒溶液中。反应后的混合物最 终分散在0.3M NaCl 10 mM NaH2PO4/Na2HPO4 （pH 7）中，过48小时，离心30分钟以出去 多余的试剂。纳米颗粒探针重新分布在0.3M NaCl 10mM磷酸缓冲液中以备使用。0HHS0H图2.4. DTT的化学结构（DTT通常用作硫化DNA还原或脱保护剂，硫化DNA的端基硫原子倾向于在溶液中尤其存在氧气时形成二聚物）2.6.表面固定DNA的GNPs的杂化将1mLPBS缓冲液中100pL表面固定了 DNA的GNPs和5pL互补DNA的混合物70C 加热30分钟。混合物冷却到室温后，离心，用反应缓冲液（2mM C

21、H3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4）洗涤以除去多余的DNA分子。收集到的GNPs重新分散在2mL反应缓冲 液中。2.7. TO 和 PFP 的 NSET 实验PFP和TO-DNA间FRET及进一步到金纳米颗粒表面的NSET过程的研究中，于缓冲 溶液中（2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO 4, pH 4.6 ）逐滴加入 PFP，每次滴加 0.2pL-0.5pLo每次滴加后，在荧光测量前将混合物于室温下温和振荡。每次加入PFP后在 380nm波长下直接激发复合物测量390nm到650nm间的荧光。精选文档首先向400pL含有固定了 D

22、NA的GNPs的缓冲液中加入固定量的TO以制备 TO-dsDNA/GNPs复合物。过15分钟，再加入固定量的PFP。这是为了防止形成TO-dsDNA 结构之前PFP对TO的斥力使TO从DNA结构中脱离。2.8. 一个碱基不匹配的双链DNA S1核酸酶切反应的分析杂化的 GNPs 分散在 2mL 反应缓冲溶液(2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6)中。将固定量的TO(TO=10-4M)一次性加入400pL溶液中，室温下温和振荡 15分钟。随后一次性向溶液中加入优化量的PFP。加入S1核酸酶，37C下培养溶液以便 酶切反应发生。30分钟后测量荧光

23、光谱，激发波长为485nm (TO的直接激发)及380nm (TO的FRET激发)，分别监测500nm-650nm及390nm-650nm间的发射。3. 实验结果及分析3.1.以CPPs/GNPs/dsDNA复合物进行的核酸酶探测首先讨论以CPPs/GNPs/dsDNA复合物进行的核酸酶探测。单链特异性核酸酶是使用 广泛的多功能酶，选择性作用于单链及双链核酸单链区。如图2.5所示，PFP和双链DNA 强的静电作用使得PFP邻近GNPs，引起NSET，导致了荧光信号的淬灭。然而，当复合 物被S1核酸酶切断，GNPs和CPPs/dsDNA结构的距离增大，引起了荧光信号的恢复。首先用HAuCl4的柠

24、檬酸还原法合成金纳米颗粒。30用稀释后的胶体微粒溶液，我 们估计出合成的GNPs浓度约为12.22nM 7.36x1011/liL。接着用PVP进行表面修饰部分中 和电荷。随后将PVP功能化的纳米颗粒和SH修饰的DNA偶联。通过观察溶液的颜色及 均匀的分布，我们推断DNA已成功固定在纳米颗粒表面。之后将固定了 DNA的纳米颗粒 与互补DNA序列置于杂化缓冲液中培养，最终在纳米颗粒表面形成DNA双螺旋结构。3.1.1. PFP量的优化PFP含有大量的吸收离域分子单元，激发能量延PFP骨架的传递引起荧光信号的放大。 16-18通过改变PFP在含有GNPs-dsDNA的缓冲溶液及空白缓冲溶液中的浓度

25、来进行 PFP和双链DNA间的静电作用的研究。每次加入后连接上的PFP的荧光即为两者之差。图3.1.空白缓冲溶液中(红线)及含有GNPs-dsDNA (20pL)的缓冲溶液中的PFP发射强度测量条件：2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C如图3.1所示，PFP发射强度随PFP浓度的增加几乎线性增长，PFP发射差随PFP量 的增加而变大。考虑到检测的灵敏性及仪器的条件，我们认为3pL PFP即为合适。3.1.2. GNPs-DNA 量的优化用PFP处理后，带正电的PFP和带负电的寡核苷酸间的静电作用使彼此接近，引起了 由PFP到金纳米颗

26、粒表面的NSET。为了研究PFP和GNPs间的NSET效果，在含有不同 量的GNPs-DNA的缓冲溶液中加入定量的PFP。420nm处PFP的发射随GNPs-DNA量的 增加而降低，如图3.2所示。加入更多的GNPs-DNA导致更多的高效的PFP在金纳米颗粒 表面的荧光淬灭。380nm激发波长下420nm处PFP的荧光发射随GNPs-DNA量的变化关 系如图3.3所示。PFP发射随GNPs-DNA量的增加几乎线性下降，当GNPs-DNA达到20叭 时保持不变。7000000q6000000- 八5000000_/ 七0uLGNPs-DNA图3.2.不同浓度GNPs-DNA中PFP的荧光光谱测量

27、条件：PFP 的量为 3pL, PFP.n.t.al= 10-4M2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6，37Cr&onenlecnecseLoutAmount of GNPs-DNA(uL)图3.3. 420nm处不同浓度GNPs-DNA中相同量的PFP的荧光发射测量条件：PFP 的量为 3pL，PFP.n.t.al= 10-4M2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6，37C3.1.3. S1核酸酶探测用S1核酸酶处理复合物后，PFP和金纳米颗粒间的距离增大，从而引起荧光信号的恢 复。图3.4

28、所示为DNA复合物S1核酸酶切反应过程中所测得的荧光光谱。在 PFP/GNPs-DNA初始溶液中于波长420nm处发生荧光淬灭，这是由于PFP到金纳米颗粒 表面的高效NSET。加入S1核酸酶后，420nm波长处PFP发射强度显示恢复（红线所示）。 这种现象证实S1核酸酶成功切断DNA双螺旋结构的不配对区域，从而使PFP和金纳米颗 粒间的距离增加。400450500550600Wavelength （nm）18000016000014000012000010000080000- 60000- 40000- 20000- 0图3.4. S1核酸酶处理前（实线所示）和处理后（虚线所示）的荧光光谱测量

29、条件：PFP，GNPs-DNA，S1核酸酶的量分别为3pL，20pL，1pL反应时间：30 分钟 2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C3.2.以CPPs/TO/GNPs-dsDNA复合物进行的核酸酶探测嵌入型染料TO能嵌入双链DNA内部紧密堆积的碱基对间，从而引起其荧光量子产 率的增加。这种检测方法简单且有效但是由于在溶液中嵌入型染料能嵌入任何双链DNA 分子产生信号而缺乏特异性。改善嵌入型染料分析方法的灵敏度和特异性的一种方法是利 用能量传递过程，荧光共振能量转移FRET能够在供体分子和嵌入型染料间发生。捕光性 阳离子共轭聚合物（

30、CCPs）能在特定探针上与嵌入型染料相连，对具有高检测灵敏度的序 列特异性DNA是十分有效的。15因此我们提出了用CPPs /TO/GNPs-dsDNA复合物来进 行检测的方法，使其更灵敏精确。如图1.6所示，用嵌入型染料和PFP处理之后，带正电荷的PFP和带负电荷的寡核苷 酸间的静电作用将使PFP和嵌入型染料彼此邻近，从而引起PFP到嵌入型染料的FRET进 而到GNPs表面的NSET。然而，用S1核酸酶处理复合物之后，将使双链DNA在不配对 部分被切断，进而引起PFP和嵌入型染料TO间的高效FRET。3.2.1.PFP量的优化由于检测系统变为CCPs/TO/GNPs-dsDNA复合物，我们需

31、要重新优化PFP的量以保 证探测的效率。为了研究PFP到TO的FRET，将PFP加入CCPs/GNPs-DNA系统中固定浓度的嵌入DNA结构的TO中。PFP浓度随每次PFP液滴的加入增加。 图3.5所示为TO荧光发射强度在530nm处及PFP荧光发射强度在420nm处随PFP加入的 增强。加入更多的PFP后，将引起PFP和TO间更多的荧光共振能量转移，因此我们观察 到530nm处TO荧光发射的增加。2000000 -1500000 -1000000 - 500000 -0400500600Wavelength (nm)图3.5.不同PFP浓度下PFP敏化TO-dsDNA荧光发射荧光光谱测量条件

32、：TO = 1.5X10-7M, dsDNA = 3.25x10-8M, 2=380 nm2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C图3.6所示为TO嵌入dsDNA后激发波长为380nm时530nm处TO的荧光发射。通过逐滴加入PFP液滴来改变PFP浓度，TO发射几乎随PFP浓度的增加线性增加直至PFP 的量达到3PLO PFP的量超过3PL时，TO发射强度降低。TO发射强度的降低可能由于以 下三点原因，首先，由于PFP静电斥力的作用TO从双链DNA上错位；其次，溶液中PFP 聚合物链的聚合形成了非发光链间的激发态导致了光子的淬灭；32最

33、后一点是高PFP浓 度引起的内滤影响。11400000 -.snetnlecnesseLOUE350000 -300000-250000 -200000-15000010000050000-0-50000-012345Amount of PFP(uL)图3.6.不同PFP浓度下TO发射最大波长530nm处PFP敏化荧光发射测量条件：TO = 1.5X10-7M, dsDNA = 3.25x10-8M, 2=380 nm2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C3.2.2.S1核酸酶探测正如我们所估计的那样，用S1核酸酶处理复合物之后，PF

34、P和金纳米颗粒间的距离 增大，导致荧光信号的恢复。图3.7所示为S1核酸酶切DNA双螺旋结构过程中所测得的 荧光光谱。PFP/GNPs/TO-dsDNA初始溶液中在波长420nm处显示荧光淬灭，这是由于PFP 到嵌入型染料的FRET进而到GNPs表面的NSET。加入S1核酸酶后，波长420nm处PFP 发射强度显示恢复(红线所示)。这种现象证实S1核酸酶成功切断DNA双螺旋结构的不 配对区域，从而使PFP和金纳米颗粒间的距离增加。10000000-图3.7. S1核酸酶处理前（实线所示）和处理后（虚线所示）的荧光光谱测量条件：TO，PFP，GNPs-DNA，S1核酸酶的量分别为6pL，3pL，

35、20pL，1pL反应时间：30 分钟 2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C3.3.用PG作为荧光探针PicoGreen（PG）是一种能够选择性连接在双链DNA上的荧色物，最大激发波长为 480nm，发射峰在520nm处。当连在双链DNA上时，PG的荧光增强极其高，由于未连接 的染料实际上没有荧光因此只有极少的背景。PG不易光致褪色，这是更长的暴露时间和 分析灵活性的保障。我们检测了 PFP和PG间的FRET效率，同时与TO进行比较。为了研究PFP到PG 的FRET效果，将PFP加入固定浓度的连在相同浓度的双链 DNA上的PG中，在

36、CPPs/GNPs-dsDNA体系中完成。随后通过加入PFP液滴来增加PFP浓度。图3.8所示为 波长520nm处PG荧光发射和420nm处PFP荧光发射随TO-dsDNA中PFP浓度的增加而 增强的关系。加入更多的PFP引起PFP到PG更多的FRET，因此我们观察到PG520nm处 荧光发射的增强。图3.9所示为PG嵌入双链DNA结构中激发波长为380nm时520nm处PG的荧光发 射。通过逐滴加入PFP液滴改变PFP浓度，PG发射几乎随PFP浓度的增加线性增强直至 PFP的量达到5pL，超过5叭，则PG发射降低。通过比较其他试剂的量相同时520nm处因此为PG和530nm处TO的发射强度，

37、我们可以估计出PFP和PG间的FRET更高效。 了使检测更加灵敏，我们可以利用更有效的荧光探针PicoGreen（PG）。图3.8.不同PFP浓度中PFP敏化PG-dsDNA荧光发射荧光光谱测量条件：PG = 1.5X10-7M, dsDNA = 3.25x10-8M,妃=380 nm2mM CH3COONa, 15mM NaCl, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C图3.9. PG最大发射波长520nm处不同PFP浓度中PFP敏化荧光发射测量条件：PG = 1.5X10-7M, dsDNA = 3.25x10-8M,、=380 nm2mM CH3COONa, 15mM NaCl

38、, 0.1mM ZnSO4, pH 4.6, 37C结论总之，我们提出了一种无标记的基于CCPs/GNPs-dsDNA/嵌入型染料体系的S1核酸酶 切双链DNA探测方法。这种分析方法依赖于通过PFP到DNA嵌入型染料的荧光共振能 量转移引起的光学放大，同时利用了金纳米颗粒良好的光学淬灭性质。与以前报道的需要 荧色物标记DNA底物的方法相比，我们的分析技术简单快捷。同时还提供了一种混合检 测探针，能够进行均质快速的检测。最重要的是，和直接使用TO作为核酸酶的信号记录， PFP和TO荧光强度的同时改变提供了酶切反应的具有比例的更为准确的荧光测量，同时 还能减少外部非特异性反应。我们希望这种分析方法

39、能够在众多领域，如药物发现，DNA 基因组学以及生物进程的研究中有重要的应用。参考文献(1) Stoff-Khalili, M. A.; Dall, P.; Curiel, D. T.Cancer Gene Therapy 2006,13, 633.(2) Swiderek, P. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 4056.(3) Ptasinska, S.; Denifl, S.; Gohlke, S.; Scheier, P.; Illenberger, E.;Mark, T. D.; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 1893

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