《毒理学评价》PPT课件.ppt

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1、毒理学评价,第一节 新药毒理学评价的重要性 随着科学技术、化学工业和制药工业等的迅速发展，新药不断问世涌向市场，给人类带来文明和疾病治疗上的福音，但亦带来了环境的污染和对人体的伤害，回顾新药评价的历史，许多的药害事件，绝大多数是由于没有进行或未能充分完善临床前毒理学评价造成的，尤其是20世纪60年代初的“反应停“惨案。,我国学者于13世纪就已经指出，“所有的东西都是毒物，没有一种不是毒物，即万物皆毒”。因此，如何使研制出来的新药，在临床上对病人显示良好的治疗作用，而不产生伤害作用，或能及时认识和掌握处理其有害作用的对策，从而保障用药的安全，则临床前毒理学的评价具有十分重要的意义。为确保人类用药

2、安全而得以逐步完善，至20世纪90年美国、欧盟、日本,共同发起组织的“人用药物注册技术要求的国际协调会议（International Conference on Harmonnisation of Technical Reguirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use，ICH，1995），其中内容之一是对新药毒理学研究技术要求的协调，使药物研究技术要求的国际统一化，对于临床前毒理学研究具有重大的指导意义和现实意义。,临床前新药的毒理学研究非常重要，但因其准确性受多种因素的影响，而存在一定的局限性。如药物反应:人与动物存在

3、着种属差异（头晕、头痛、耳鸣等主观性感觉的毒性反应动物不能反映）。如实验动物的数量:总是有限的，往往不太可能满足毒性反应概率（P），达到P=0.05或P0.05、0.01的实验动物数量（分别需58、299、2995只）等。因此，不能以,临床前毒理学研究的结果完全外推到人体，不过，从新药的临床前毒理学评价发展的历史看，随着相关学科的发展，药物毒理学亦将迅速的发展，其评价的预测能力必将不断提高。,第二节 新药毒理学评价的前提要求,新药临床前毒理学研究目的是为了充分揭示其可能产生的毒性，使所得的实验数据适合于对人的危害性及危害程度的实际评价，从而淘汰危害性大的，保留危害性小的，甚或没有危害的理想的新

4、药，使其真正成为人类与疾病斗争的有力武器，下列诸多方面对毒理学试验是应该遵循的。,一、优良实验室规范（Good laboratory practice，GLP）,GLP的全称为药物非临床研究质量管理规范（Good laboratory practice for nonclinical laboratory studies），这是政府或其相关部门颁布的法规，是对新药临床前安全性试验制订的基本标准，每项实验均应按规范的要求，严格实施，并经质量保证部门的督查和确认，以保证试验资料的科学性、完整性、规范性和真实性。GLP通常包含着硬件、软件两方面的严格要求。,（一）硬件方面 必须具有符合要求的实验设施

5、和设备，包括均需达一定标准要求的动物饲育及动物用品供应设施、试验操作区域及其设施、受试处置设施、资料保管设施，并必须配备多种仪器设备用于数据的测定和分析。（二）软件方面（1）必须要有一批高素质的研究人员：包括实验室负责人或研究指导者（Study director，SD）、课题负责人及试验研究人员，SD必须是一个具有较高造诣的药理学和毒理学家，他必须对安全性研究项目的实验技术及结果的分析报告全面负责。,研究人员则在课题负责人的指导下严格遵照设计方案和标准操作规程有序地进行实验研究工作。（2）必须要有一整套完善的标准操作规程（Standard operating procedure，SOP）：它是

6、包括试验方案、受试药物、试验动物、试验仪器、各种标本的采集和取样、试验数据与测定记录、实验报告撰写及资料的归档保存等，与常规试验密切相关的研究工作程序、技术方法及业务管理等方面具有指导性的可操作性的GLP实验室内部法规性统一规范。,（3）必须要有严格的质量保证和监督管理：为保证试验符合GLP要求，必须建立独立于GLP实验室外的研究质量保证部门（QAU）或称质量保证系统（Quality assurance programme，QA），QAU的人员不能参与和负责或指导具体的研究项目，而是独立行使对研究中各环节的监督检查，确保不发生任何的质量问题。（4）新药的非临床毒理学（安全性）研究需在GLP实验

7、室中进行试验。,二、受试药物 要求受试药物要有稳定的工艺路线和质量控制，并与药效学等临床前研究用受试药物相一致，以利于毒理试验的设计与正确的实施。,三、试验动物 根据不同毒理学试验的要求，选择符合规定级别的、健康的和敏感的动物，应明确动物的种属、品系、来源、年龄、性别及体重等。至于动物数量的要求，原则是根据实验周期的长短和尽量满足统计要求。必要时可采用转基因动物或特定年龄、性别的动物。,四、试验方法 试验的设计不但要符合统计学的要求，而且应根据受试物所要求毒理学评价的内容，选择确证的实验方法。给药途径应与拟用于临床的给药途径相一致。并根据具体毒理学试验的要求，采用单一剂量的给药或采用多个剂量的

8、给药，以观察剂量对毒性反应的影响。,五、观察指标 观察指标亦需根据毒理学评价要求，尤其是反映毒性的主要靶器官、靶点的反应，或更为重要是死亡的尸检和病理检验的观察。通常可从下列方面选择确定。1、一般指标 如动物活动状态及行为的外观观察；动物对饲料的消耗与饮水量的情况观察；动物的毛发情况、尿、粪的色、量和质地的观察；动物体重变化的观察等。,2、死亡指标 可被肉眼观察到动物异常反应，甚至死亡及其给药后发生时间的观察。3、血、尿分析指标 常规血象指标、常规血液生化学指标及常规尿液分析指标的观察，甚至观察有否神经、免疫功能方面的毒性反应。4、形态学指标 即可以进行大体解剖进行组织器官的肉眼观察，亦可对组

9、织器官的病理组织形态学的显微观察。,第三节 新药毒理学评价的内容,鉴于药物的种类、临床适应证、用法及疗程千差万别，毒性作用特点亦各不相同，如毒性反应出现的快慢有异，毒性作用靶点或靶器官亦不相同，有些可能影响子代，因此，新药临床前毒理学评价试验可分为一般毒性试验和特殊毒性试验两大类。,一、一般毒性试验 所谓一般毒性试验，包括不同种属动物和不同给药途径进行急性毒性试验、反复多次的长期毒性试验，观测其具广谱性和不确定性特点的毒性指标，如生理学、血液学、血液生化学及病理形态学的综合性指标。,1、急性毒性试验 急性毒性试验是药物毒理研究的早期阶段，这是指动物在一日内单次或多次（化学药品12次，中药、天然

10、药物34次）接受过量药物后，至少连续14天内观察所产生的毒性反应或死亡情况，一方面可了解其中毒表现，毒性反应出现和消失的时间过程，其毒性靶器官是什么，并可分析中毒死亡的原因，另一方面可观察药物毒性反应与药物剂量间的关系，从而可获得致死量（Lethal dose，LD）、近似致死量（Approxinate lethal dose，ALD）和半数致死量（Lethal dose 50，LD50）。,急性毒性常用的试验方法有半数致死量法、最大耐受量法、最大给药量法、固定剂量法、近似致死量法等。对于不同受试物来讲，由于其化学成分及化学结构、活性成分含量的差异，造成其毒性强度的必然差异，因此，需根据受试物

11、特点选择试验方法。,（1）灌服及注射给药急性毒性试验：是指动物经肠或注射（皮下、肌内、静脉）给药的毒性试验。一般常用健康79周龄啮齿类（小鼠、大鼠）和68月龄非啮齿类（犬、猴）动物进行试验，啮齿动物可供LD50、最大耐受剂量、最大给药量和固定剂量法试验用，而非啮齿类动物可供近似致死量法试验用。LD50的测定，通常设置56个剂量组，小动物每组10只以上，大动物每组68只，每组雌雄各半，根据不同动物选择适宜的给药容量，采用适宜的统计方法。,最大耐受剂量与最大给药剂量试验，两试验法均是指采用1020只动物，单次给药后，前者求得是能引起动物明显中毒反应而未发生死亡的剂量；后者是在合理的药物浓度和给药容

12、量的条件下，以允许的最大剂量（化学药品口服为5.0gkg-1，注射为2.0gkg-1）,观察实验动物出现的反应。固定剂量法是指不是以死亡为终点，而是以出现明显毒性体征作为终点进行评价，一般首选大鼠。,近似致死量一般选用68月龄的犬或猴6只，而在估计可能的毒性范围，以50%的递增法设计出剂量序列，在此范围内，每间隔一个剂量以临床拟用途径给于1只动物，测得最小致死量和最大非致死量，选其间的剂量给1只动物，此剂量即谓近似致死量。,（2）急性皮肤毒性试验：是观察动物完整或破损皮肤接受单剂量（中药制剂视情况亦可一日内多剂）受试物后，短期内（一般为714天）出现的毒性反应及死亡情况，常选用大鼠（中药制剂不

13、选用）、白毛豚鼠和兔或小型猪，脱毛面积原则上约为动物体表面积的10%，破损皮肤以渗血为度。,（3）急性吸入性毒性 指动物在24小时以内，经一次性连续吸入受试物（气体、挥发性物质、气雾剂或微粒物等）后，动物所出现的毒性反应。动物全身暴露于不超过20L具有不间断空气流速的特制容器内，置于容器时间至少是受试物在容器中达平衡后4小时，观察期至少14天，逐日观察动物的全身反应，到期处死动物，对呼吸道进行大体解剖观察，有迹象表明毒性涉及到其他器官，应进行病理组织学检查。,2、长期毒性试验 长期毒性试验是观察反复给动物受试物后，所产生的毒性反应及其严重程度，主要毒性靶器官、靶组织及其损害的可逆性，为制定临床

14、试验和人用安全剂量提供参考。因此试验设计应包括神经病学、生理学、生化学及相关的组织形态学指标的监测，并注意受试物在组织中可能的蓄积或可能发生的延迟性毒性作用。,（1）经胃肠或注射给药的长期毒性试验方法：一般应设受试物三个剂量组和一个正常对照组或溶媒、赋形剂组，低剂量组原则上应高于同种动物药效的有效剂量，而动物不出现毒性反应，高剂量组原则上能使动物产生明显或严重的毒性反应，甚至有20%的动物死亡，则在这高、低剂量间再设一个中剂量组。动物：一般选用啮齿类SD或Wistar大鼠与非啮齿类Beagle犬或猴两类动物，虽其年龄应依试验周期的长短而定，但通常大鼠为6-9周龄，Beagle犬为6-12月龄。

15、,给药：原则上应与临床拟用给药途径相同，若试验周期长，大鼠静注有困难时，可用其他适宜途径代替，并在3个月以上的试验期时，每周可6天给药。周期：关于试验周期，应根据临床拟用疗程长短而定，可为临床拟用疗程的34倍的时间。指标：观察指标应是多方面的，包括饲料消耗量、体重变化、外观体征及行为活动、血液学指标、血液生化学指标、体温（非啮齿类动物）、眼科检查（非啮齿类动物）、尿常规分析指标（非啮齿类动物）、心电图（非啮齿类动物）、,重要组织和器官的脏器系数及肉眼和病理组织学观察。犬的长期毒性试验中，增加一些具有针对性的如骨髓、感官等的观察。给药期满后24小时可活杀部分动物检测各指标，余下动物可作为延迟性毒

16、性或已出现的毒性反应的可逆的恢复期观察，恢复期的长短依据受试物代谢动力学、靶器官或靶组织的毒性反应及恢复情况确定。,评价：评价需建立在对观察指标的综合分析基础之上，确定靶器官，提供毒性反应剂量，中毒剂量，毒性可逆程度和是否存在着延迟性毒性反应等资料。,（2）皮肤给药的长期毒性试验 观察动物皮肤长期接触受试物，经皮肤渗透吸收对局部和全身产生毒性反应的可能性及其严重程度，靶器官及其损害的可逆性，确定毒性反应剂量等。常用动物为成年健康兔（2.03.0kg）、豚鼠（350450g）和大鼠（200300g），给受试物背部需每周脱毛一次，面积约占体表面积的10%（兔150cm2、豚鼠和大鼠40cm2）。若

17、需观察破损皮肤的长毒试验，则将脱毛消毒皮肤划破，以渗血为度。,应设三个受试物剂量组和一个对照组或赋形剂组。若受试物与已知结构相似的低毒同类物，或受试物剂量已超过1.0gkg-1或达有效浓度20倍以上，仍未见毒性反应和死亡时，则无必要设三个剂量组而仅设一个高剂量组。给药周期长于3个月时，动物数量应增加。,（3）角膜和黏膜及吸入性长期毒性试验 眼、口腔、阴道、直肠等反复多次给药的长期毒性或长期吸入性毒性试验，其要求基本上与皮肤给药长期毒性试验相仿，受试的制剂应与临床用制剂基本相同，用于稀释的溶剂或赋形剂与临床用相同，给药途径和每次接触时间应模拟临床给药途径和临床用药时间，除观察全身反应的相关指标外

18、，尚应重点观察给药局部和可能累及的周围组织的反应和病理损害程度。给药局部的刺激性可同时观察。,3、一般药理学研究一般药理（General pharmacology）研究是指对主要药效学研究以外的广泛药理学研究，包含次要药效学（Secondary pharmacodynamic）研究与安全药理学（Safety pharmacology）研究两个内容，次要药效学的研究已在前面作叙述，这里主要根据我国新药研究中及临床使用中发生不良事件或用于新人群等的上市销售药品的安全药理学研究要求给于简要介绍。,安全药理学研究主要针对药物治疗剂量或以上剂量范围具有潜在的不期望发生的对机体重要生命功能的中枢神经系统、

19、心血管系统和呼吸系统的不良影响或损害的核心组合试验，还可根据需要可能进行追加和补充的安全药理学研究内容。,核心组合试验中对中枢神经系统的试验需定性、定量地评价动物用药后的运动功能、行为改变及协调功能、运动反射、感觉、体温等的变化；对心血管系统的试验包括给药后，动物的血压、心电图及心率的变化；而呼吸系统的试验则是实验动物给药前后呼吸频率及呼吸深度的变化。当核心组合试验或临床试验、其他体内、外实验，甚至流行病学等资料提,示被研究药物具有潜在的与人体安全性相关的不良反应时，应进行追加和/或补充安全药理学研究。追加安全药理学研究是指在核心组合试验的基础上的深入研究，如对中枢神经系统应增加对行为、学习记

20、忆、神经生化、视觉、听觉和/或电生理指标的观察；心血管系统应增加对心输出量、心肌收缩作用和血管阻力等指标的观察；而呼吸系统应观察气道阻力、肺动脉压力及血气分析等指标。,补充安全药理学研究是指核心组合试验未包括的组织器官系统的试验：如泌尿/肾脏系统，应对尿量、比重、PH值、渗透压、电解质平衡、蛋白质、细胞和血尿素氮、肌酐等反映肾功能指标的观察；自主神经系统方面可观察对自主神经的直接刺激作用及对心血管反应性、压力反射、心率及相关受体结合的激动、拮抗的反应等；胃肠系统的胃液分泌量和PH、胃肠损伤、胆汁分泌及对肠肌功能的影响等指标的观察；,二、特殊毒性试验所谓特殊毒性试验，是指以观察和测定受试物是否会

21、引起某种或某些特定的毒性反应为目的而设计的特殊试验，如遗传毒性、生殖毒性、致癌性、依赖性、过敏性、局部刺激性等等。由此可看出一般毒性研究获得的基本参数，亦正是特殊毒性试验中不可缺少的参数，特殊毒性的研究结果又进一步丰富了整个毒理学评价的内容。,（一）遗传毒性试验（致突变试验）遗传毒性试验是在体外或整体动物体上实验检测受试物，有否通过不同机制直接或间接造成遗传损伤的作用。由包括细菌回复突变试验、哺乳动物细胞染色体畸变试验和啮齿类动物成血细胞微核试验的一组试验来测试受试物的遗传毒性。,（二）生殖毒性试验 研究结果与所有其他药理学和毒理学资料联系起来，以推测受试物对人生殖可能产生的毒性危害性。通常以

22、一般生殖毒性试验（生育力和早期胚胎发育）、致畸敏感期毒性试验（胚胎、胎仔发育）和围产期毒性试验（胎仔出生前后的生长发育、包括母体功能）的三个时期的毒性试验进行评价。,生殖毒性试验必须以哺乳动物为试验对象，大鼠为首选，小鼠也可选用，非啮齿类的兔可在胚胎毒性研究中选用。为进行量效关系的分析，受试物最好设置3个剂量组（至少需2个剂量组）,(1)一般生殖毒性：观察评价受试物对胎仔的发育和成熟、交配行为、生育力、胚胎着床前的发育和着床的影响。(2)致畸敏感期毒性试验：该试验主要观察评价受试物对亲代和胚胎、胎儿发育的影响，包括受试物所致胚胎、胎儿死亡、生长与器官形成的影响。（3）围产期毒性试验：此试验主要

23、评价受试孕动物从着床至断奶期间给受试物后，对妊娠、分娩、哺乳、胚胎、胎仔发育的影响，此期间毒性反应有些可延迟发生，故应连续观察到子代性成熟期的毒性评价。,（三）致癌性试验 该试验是对受试物潜在的致癌性的检测，但为避免不必要的试验，具有下列情况之一时才应考虑进行致癌性试验。临床疗程在6个月以上的药物或需间断性长期反复治疗慢性复发性疾病（如过敏性鼻炎、忧郁症、焦虑病等）的药物及长期接触的缓慢释放的药物。已知与人类相关的具有潜在致癌性的同类化合物或构效关系显示潜在致癌危险性的物质。,经长期毒性试验已显示有癌前期病变的证据或长期滞留在 体内的母体化合物、代谢产物能产生局部组织反应或其它病理生理反应。已

24、明确有遗传毒性的物质，如果临床需长期使用，则有必要进行致癌试验，但属肿瘤治疗药或用于预期生存期短暂的人群，则无必要进行致癌试验。（1）短期致癌试验：哺乳动物培养细胞恶性转化试验 诱发小鼠肺肿瘤试验：（2）长期致癌试验,通常选用幼年大、小鼠，受试物应设3个剂量组，低剂量应是临床拟用剂量的13倍，给药途径与临床拟用途径相同，大鼠连续给受试物2年，小鼠1.5年。若肉眼观察到动物发生肿瘤时，应取各器官系统做病理组织学检查。根据各组肿瘤发生率、潜伏期和多发生性等作出对受试物致癌性的评价。,（四）依赖性试验 阿片类镇痛药的成瘾性包含对药物的耐受性和依赖性。（1）身体依赖性试验：主要评价受试物的身体依赖性的

25、潜力，需进行身体依赖性试验的主要有镇痛药类和镇静催眠药类，属镇痛药类的身体依赖性潜力的检测，可采用自然戒断试验或替代试验及催促试验；而镇静催眠药类，则采用自然戒断试验或替代试验及诱导试验来测定其身体依赖性的潜在性。,自然戒断试验 自然戒断试验是连续给予动物一段时间的受试物后，突然停止，观察动物出现的戒断症状。替代试验 该试验是给予动物各类代表药（吗啡、巴比妥或苯巴比妥），使产生身体依赖性后，停止给代表药，而以受试物替代给予，观察受试物能否使动物发生戒断症状及其发作程度，以此来判断受试物是否具有与代表药类似的依赖性潜力。,催促戒断试验 指在短期内给予动物大剂量受试物，然后注射给予受体阻断药纳洛酮

26、（naloxone）后12小时内，动物出现的戒断症状与其程度，但此法仅适用于对受体激动药（阿片类）的竞争性阻断。诱导试验 由于大部分镇静催眠药不具有竞争性受体阻断药的作用，故不能采用催促试验而改用诱导试验，在自然戒断试验中，需长时间给药后才能在断药后出现自发惊厥，而在此试验中，可应用各种方法（混频噪音铃声、戊四唑）诱发惊厥，,（2）精神依赖性试验：强效镇痛药、镇静催眠药和中枢兴奋药需进行精神依赖性潜力的评价。,条件位置偏爱试验自身给药试验药物辩别试验,（五）过敏性试验 过敏反应又称超敏反应，是指机体受同一抗原再次刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性的异常病理性免疫反应。试验方法

27、的选择则应根据给药途径及需考察过敏性发生的可能机制而确定，如经皮给药的药物选择豚鼠最大化试验、BT试验；注射给药则需选择全身主动过敏试验（ASA）和皮肤被动过敏试验（PCA）；吸入给药需做豚鼠吸入诱导和刺激试验。,1.全身主动过敏试验 药物的过敏性在临床上对人将产生严重的危害性，故地各种注射用的药物制剂需进行全身主动过敏试验，这是由于药物制剂中存在的抗原或半抗原物质与机体内抗体形成复合物，导致机体组织细胞损伤，促使肥大细胞释放组织胺等物质，对动物可产生咳嗽、呼吸困难、抽搐、甚至休克死亡。,2.被动皮肤过敏性试验 由于致敏动物血清内含有丰富的IgE抗体，而给正常动物皮内注射此血清后，IgE与皮肤

28、肥大细胞特异受体结合，而造成正常动物的被动致敏，当用致敏抗原激发时，促使局部肥大细胞释放过敏介质，使局部血管通透性增加，随致敏抗原注入的染料渗出皮丘，形成兰斑，则可根据兰斑的大小判定过敏反应发生和其强度。,3.皮肤光过敏性试验 该试验是预测动物皮肤接触受试物后，药物受阳光照射成激活态，并与皮肤中的胶原蛋白或角蛋白结合成抗原的药物-蛋白质复合物，经表皮的朗格罕氏细胞传递使T细胞致敏，当再次接触药物和光照射作用2448小时之内发生过敏反应，初为皮炎，继而可发生皮肤局部红肿、硬结、水泡，甚至严重的剥脱性皮炎，所以与药物的光毒性作用较难区分，不过，光毒性反应不仅限于皮肤途径给药，其他给药途径亦同样可发

29、生此反应。,4.皮肤光毒性试验 皮肤光毒性是指皮肤局部或全身接触或应用受试物后，暴露在阳光或紫外线下引起的皮肤损伤性毒性反应，光过敏性是此毒性反应中最常见的一种反应，皮肤光毒性反应具有剂量依赖性，表现为红斑、水肿、皮肤瘙痒、色素沉着，甚至局部坏死、渍烂或表皮脱落。,5、皮肤刺激性试验 观察受试物与动物皮肤接触后所产生的可逆性的刺激性反应，若这种刺激反应已造成不可逆的组织损伤，则可称为腐蚀性。6、肌肉刺激性试验 这是适用于注射剂的刺激性试验方法，取一定量受试物注射入动物的股四头肌后，观察注射肌肉局部是否产生充血、红肿、变性及坏死等刺激反应。,7、血管刺激性试验 这是静脉注射剂需要检测的试验。8、

30、注射给药部位刺激性试验 该试验是根据不同的给药途径适用于血管（兔为耳静脉、耳中心动脉，其它动物可为前、后肢静脉或股动脉等）、肌肉（肌及背部肌肉）、侧胸壁皮下组织、静脉旁组织等的刺激性观察。9、眼刺激性试验,是指受试物经眼给予动物后，在眼前部表面出现的可逆性改变，若是不可逆的组织损伤，则谓腐蚀性。10、吸入剂和滴鼻剂的毒性及刺激性试验 观察受试物在短时间内给动物1次或多次滴鼻或吸入后所产生的刺激性或异常反应。11、直肠、阴道用药的毒性及刺激性试验 观察将受试物由动物直肠、阴道给予后所产生的刺激性和毒性反应。12、溶血试验,三、毒代动力学试验 毒物代谢动力学是药物代谢动力学研究的延伸，亦是临床前毒

31、理学研究的一个组成部分，试验的目的为：一是根据研究结果，确切评价对受试物毒理学研究中的发现和临床安全用药的相关性；二是可为临床前毒理学研究的有关实验设计，如动物选择、给药剂量、剂型、途径等提供依据；三是有助于解释动物不同种属、性别间和不同受试物剂量间毒性作用的共同性和不同点。,毒代动力学研究的基本原理与血药浓度的分析方法和药代动力学的研究是相同的，仅对实验程序的安排和对实验数据的要求不完全一样而已，毒代动力学侧重观察动物长期反复用药后血药浓度的变化，且不要求提供全部药代动力学参数。大多数情况下，毒代动力学试验可与其他毒性试验同步进行，但有些也可早于其他毒性试验或于临床研究后再补充进行研究。总之

32、，其最终是要求提供该受试物的应用危险性与安全性的充分研究资料。,毒代动力学根据不同情况，可进行单剂量或多剂量的毒性研究试验。生殖毒性试验、遗传毒性试验和致癌试验以及为改变给药途径提供有价值的参考。其测定的主要参数有，药时曲线下面积（AUC）、峰药浓度（Cmax）或特定剂量特定时间的血药浓度（C（t）及消除半期（t1/2），血浆蛋白结合率宜测定血浆中未结合药物或根据体外血浆蛋白结合率计算其未结合药物的药时曲线下面积，其组织分布当有特殊的毒理学意义时才进行测定。,中药新药长期毒性试验的常见问题讨论,1试验设计方面11试验周期试验周期是长毒中至关重要的问题。试验周期设计不合理，脱离临床实际使用情况，

33、如试验周期过短，达不到长期毒性试验的要求，这是要求重做长毒的最主要原因之一。如某药临床试验疗程定为2个月，而仅提供了3个月的大鼠长毒试验资料，这样，试验周期则过短。,(1)长毒试验的周期应根据临床用药的实际情况并结合主治（适应症）的特点来定。临床用药期为1周内者，可做2周；1周以上，2周以内者，应为1个月；2-4周者，应为3个月；4周以上者，大鼠应为6个月，犬应为9个月，此为最长试验周期。(2)对功能主治有若干项者，应按临床实际用药最长疗程的功能主治来确定试验周期。对一些慢性病的治疗药，如用于高血脂、高血压、抗抑郁等类药物，在临床上可能会长期应用，应根据疾病实际所需疗程按最长试验周期提供长毒资

34、料。,(3)有很多长毒试验的试验设计按临床研究方案制订的疗程来确定长毒试验给药时间，这是不科学的，因为临床方案中疗程的设计依据是要求在确定的疗程时间内观察到药物的有效性。如某一用于糖尿病的药物，临床方案中疗程可能设计为4周，而实际用药却可能远超过4周（可能长期使用），如仅按4周的疗程设计长毒试验则明显不妥。,12剂量的设计：剂量的设计是长毒试验的关键。常见问题是：剂量设计不合理，如低剂量等于或低于药效学的有效剂量，未找出安全剂量；高剂量设计过低而未找到毒性剂量；剂量组仅设2个等等。主要原因可能是：药效学与毒理学试验分离，试验人员互不交流；不考虑有效剂量与毒性剂量之间的关系。,长毒试验一般应设3

35、个剂量组。原则上，低剂量应略高于主要药效学研究的有效剂量，此剂量下应不出现毒性反应，高剂量力求动物出现明显毒性反应或个别动物死亡。在高、低剂量间应再设一中剂量组。在临床前此类药物尚无相关的临床信息，拟临床人用量也是主要参照药效学试验有效剂量和毒理学试验的安全剂量来拟定的，最终推荐的临床用量尚需在临床试验完成后才能确定。故这类药物长毒试验剂量设计时主要是参考药效学试验有效剂量和急毒试验结果来确定。,高剂量组剂量设置偏低是长毒试验中最多见的问题。因一些中药复方制剂的毒性较低，而中药新药药理学研究指南上注明“高剂量组一般为拟用临床剂量的50倍以上”，根据此条很多试验将高剂量组定为临床剂量的正好50倍

36、或稍高，而未出现任何毒性反应。但是该剂量与药效学试验中的有效剂量相比则相差倍数不大，在此种情况下，尚不能对受试物的安全性作出合理评价。,一般建议高剂量尽可能采用最大给药量或出现明显中毒甚至个别动物死亡的剂量。当然，一些具体药物会因某些原因而不一定能完全按要求进行，这时则应灵活掌握，具体问题具体分析。,低剂量组设置过高也偏离长毒试验的原则，长毒是为了考察长期给药对动物造成的影响，预测临床用药的安全性，故要求低剂量应略高于主要药效学研究的有效剂量，该剂量长期给药的毒性反应情况可基本反映其在有效剂量时的安全性，此剂量下一般应不出现毒性反应。,此外，剂量表示方法不明确，未说明剂量单位是制剂量、提取物量

37、还是生药量。为保证资料的规范性，建议中药有效成分或有效部位以有效成分量或有效部位量mg（或g）/kg表示，中药复方类则以g生药/kg表示。,13指标的选择。原则上观察指标力求全面并针对受试物特点选择相应的敏感指标。常规观察指标包括一般观察（外观体征、行为活动、皮毛、粪便、食量和体重的变化等）、血液学、血液生化学、心电图和尿液检查（大动物长毒时必做这两项）、系统尸解及病理组织学检查。现大部分试验仅检测一般要求的指标，建议除一般指标外，还应根据受试物的特点和在其他试验中已,观察到的某些改变，增加相应的观察指标，指标观察全面，以使一次长毒试验的价值充分得到发挥。组织病理学检查尽量系统全面，尸检发现异

38、常器官者要有针对性的详细检查。有些资料中仅检查心、肝、脾、肺、肾、脑等几个脏器，所检脏器过少。长毒试验设计时建议尽可能查找相关文献，找出相关信息供参考。,有很多试验忽视对凝血时间的观察。大多数试验血液学检查常常只注意红细胞计数而忽视网织红细胞的检查。事实上RBC计数反映红系造血抑制上不够灵敏，因为RBC寿命较长，而网织红细胞却是一个较敏感的指标。当对造血系统有影响时，还应进行骨髓涂片的观察。14恢复期观察及动物数等 有些试验者认为在给药结束时未发现明显毒性，而不进行恢复期观察，这种试验设计明显不规范。,恢复期观察的目的是为了观察毒性反应的可逆程度和可能出现的迟发性毒性反应，故应重视恢复期的观察。恢复期观察时间一般应为24周。周期设计时还应注意动物数。原则是动物数应根据试验周期的长短来进行确定，必须保证试验中期、给药结束、恢复期结束应有足够的统计样本数。,2资料的整理和结果的分析做完试验后，资料整理、结果分析是重要的环节，亦是问题较集中之处。资料应尽可能整理规范、详实、客观。有些资料过于简略，如无受试药物及配制方法，动物来源、仪器等，甚至结果描述也过于简单。有些资料将所有的试验结果罗列，而未将结果进行讨论。,