《总胆汁酸检测》PPT课件.ppt

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1、总胆汁酸测定,Biobase,血清总胆汁酸的检测,酶比色法测定总胆汁酸循环法测定胆汁酸,酶比色法测定总胆汁酸,【原理】在3-羟类固醇脱氢酶(3-HSD)作用下，各种胆汁酸C3上位的烃基(3-OH)脱氢形成碳基(3=O)。同时NAD还原成NADH。随后，NADH上的氢由黄递酶催化转移给碘化硝基四氮唑(INT)，产生红色的甲臢。甲臢的产量与总胆汁酸(TBA)成正比，在500nm波长比色。反应式如下：3-羟基胆酸+NAD+3-氧代胆酸+NADH+H+NADH+H+INT NAD+甲臢(红色),Biobase,酶比色法测定总胆汁酸,【试剂】1试剂 黄递酶 1 000U，NAD+1 mmol，碘化硝基四

2、氮唑(INT)0.5 mmol,丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷酸缓冲液1 L中，加表面活性剂适量。2试剂 3-羟类固醇脱氢酶(3-HSD)2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸缓冲液中1 L中。3终止液 1 mol/L HCl。4标准液(50mol/L)24.38 mg甘氨胆酸溶于1 L经透析的混合血清中。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸,【操作步骤】1手工法按表 加入物(ml)测定 测定对照 标准 标准对照血清 0.1 0.1 a标准液 0.1 0.1 b试剂 0.3 0.3 0.3 0.3 c试剂 0.1 0.1 d 去离子水 0.1 0.1 e

3、混匀，37水浴10min，加终止液0.1ml，摇匀，500nm波长，以水校零，读取各管A值。2自动分析法 一般无法做对照管，而是设置两点终点法，读取前后两个吸光度A1和A2。具体按说明书要求。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸,【计算】手工法：TBA(mol/L)=A测定-A测定对照/A标准-A标准对照C标准 自动分析法：TBA(mol/L)=A测定2-A测定1/A标准2-A标准1C标准【参考范围】60名健康成人的空腹TBA为4.92.38mol/L,中餐后2h TBA为8.222.91mol/L。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-临床意义,胆汁酸的生成和代谢与肝脏生理关系密切，血清

4、胆汁酸水平是反映肝实质损伤的一个重要指标。血清总胆汁酸(TBA)测定对肝病的诊断有十分重要的价值。1急性肝炎：急性肝炎时血清TBA显著增高，可达正常人水平的10100倍，甚至更高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初的高值几乎与AST在同一时间降至正常水平，若持续不降或反而上升者则有发展为慢性的可能。2慢性肝炎：慢性肝炎分为轻度、中度和重度三个类型，空腹总胆汁酸(F-TBA)和餐后2h总胆汁酸(P-TBA)测定对慢性肝炎的分型、监测、预后及疗效有着重要意义。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-临床意义,3肝硬化：肝硬化时，肝脏对胆汁酸的代谢能力减低，血清TBA在肝硬化的不同阶段均增高，增高幅度

5、一般高于慢性活动性肝炎。即使在肝硬化晚期亦如此。当肝病活动降至最低时，胆红素、转氨酶及碱性磷酸酶等指标转为正常，血清TBA仍维持在较高水平。4乙醇性肝病：乙醇性肝病血清TBA可增高，当乙醇性肝病(包括肝硬化)发生严重的肝损伤时，血清TBA明显增高，而轻、中度损伤增高不明显。有报道认为，血清TBA测定对乙醇性肝病肝细胞损伤诊断的可信度和灵敏度远优于各种酶学检查和半乳糖耐量试验等指标，甚至建议将血清TBA再加上-氨基己糖苷酶作为乙醇性肝病的诊断指标。有人认为，餐后60min-TBA测定对乙醇性肝病诊断更有意义。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-临床意义,5中毒性肝病：在中毒性肝病时血清TBA

6、也将异常。6胆汁淤积：血清TBA测定对胆汁淤积的诊断有较高灵敏度和特异性。肝外胆管阻塞及肝内胆汁淤积包括急性肝炎、初期胆管性肝硬化、新生儿胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等均可引起TBA增高。在胆管阻塞的初期，胆汁分泌减少，使血清中的TBA显著增高，且在阻塞的不同阶段几乎保持不变；而血清胆红素水平则随不同阶段而变化。胆汁淤积患者肝组织中的胆汁酸含量明显高于正常人。肝外阻塞经引流缓解后，血清TBA水平迅速下降，而其它指标则缓慢恢复。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-临床意义,所有肝病中，餐后血清TBA水平及异常率均比空腹时测定更灵敏，有人甚至认为餐后测定TBA对各种肝病的诊断灵敏度和特异性高达10

7、0%，而同时测定空腹血清胆汁酸有40%的患者在正常范围。急性肝炎是否转为慢性，连续监测餐后血清TBA可以观察慢性过程，慢性活动性肝炎是否发生纤维化改变，连续监测餐后血清TBA可以了解纤维化过程，不做肝活检即可获得肝损伤的程度。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-注意事项,由于血清中TBA含量低，样品中存在干扰物质的影响相对就大，乳酸脱氢酶(LD)是主要的干扰物质，由LD反应中生成的NADH往往比TBA反应中生成的量要大得多，因此测定前去除血清中LD的影响至关重要，方法有：血清67加温30min；加草氨酸作为LD的封闭剂；碱或酸处理；用丙酮酸钠抑制LD活性。上述5种方法中丙酮酸钠法最好，可免

8、去前处理步骤，直接加入反应体系，不影响体系的pH，且对反应无干扰。血清中还存在其它脱氢酶(有相应底物存在时)和还原性物质，如不除去，测定结果会偏高。据无选择的40例肝功能标本的测定结果来看，平均干扰相当于TBA 18mol/L，范围在5.545mol/L之间。因此自动分析设计成双试剂二步法，样品先和不加3-HSD的体系孵育，使样品中的干扰物质先反应，然后再加入3-HSD，启动TBA反应。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸-注意事项,脂肪酶、胆固醇(包括HDL-C、LDL-C)和甘油三酯测定试剂中均加有胆酸盐，自动分析时会引起携带污染，必须引起注意。某些先进的仪器可以设定试剂针、样品针和反应

9、杯的补充清洗程序，亦可将TBA编排在上述有污染的项目前测定。对某些不具备上述功能的仪器，最好将TBA单批测定。试剂中加适量表面活性剂可防止甲臢 沉淀。,Biobase,酶比色法测定总胆汁酸（H),【方法学评价】1手工法测定TBA需做标本、标准的对照管，样品和试剂用量大，试剂价格高，费用昂贵。分析仪测定能避免以上缺点，但去干扰能力不如手工法分析。血清TBA、尤其是正常血清TBA浓度低，因而检测灵敏度至为关键，本法测定TBA50mol/L(标本/试剂比为1：10)的标准液，A500nm(1cm)为0.1左右。所以低浓度时重复性较差，对31mol/L和157mol/L的样品各1份，用手工法每天上下午

10、双份测定，测10天，结果总CV分别为5.46%和2.79%。本法线性上限为300mol/L。,Biobase,循环法测定胆汁酸,【原理】胆汁酸被3-羟基类固醇脱氢酶及Thio-NAD+（二核苷酸氧化型）特异性地氧化，生成3-酮类固醇及Thio-NADH（二核苷酸还原型），此外，生成的3-酮类固醇在3-羟基类固醇脱氢酶及还原性辅酶（NADH）存在下，生成胆汁酸和NAD+。如此循环往复从而放大微量的胆汁酸量，在405nm处测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，求得胆汁酸量。,Biobase,循环法测定胆汁酸,【试剂】1试剂 硫代-NAD 2mmol/L，Goods缓冲液 200mmol/L，p

11、H7.0。2试剂 3-HSD 15kU/L，NADH 3mmol/L,Goods缓冲液200mmol/L,pH8.0。3标准液 同比色法。【操作步骤】自动化分析法。反应类型：速率法；反应温度：37；波长：405nm(主)/660nm(次)样品3l；R200l；35min后加R50l,延迟时间1min读数时间4min。,Biobase,循环法测定胆汁酸,【计算】TBA(mol/L)=A测定2-A测定1/A标准2-A标准1C标准【参考范围】40名健康成人的空腹TBA为3.712.98mol/L。【注意事项】血清TBA测定的酶循环法是一种通过脱氢酶-辅酶体系来循环底物的方法，因此要求这种酶对硫代-N

12、AD和NADH都应有高亲和力；反应体系的pH和缓冲液应允许正反应(底物氧化)和逆反应(底物还原)都能进行；还要求硫代-NAD和NADH浓度比例合适。这些条件使反应的循环速率相当快(约100次/min),在一定的反应时间内通过胆汁酸的重复反应来增加硫代-NADH的量,提高反应灵敏度。,Biobase,循环法测定胆汁酸,【评价】1干扰试验结果表明 胆红素850mol/L，血红蛋白5g/L，抗坏血酸2.84mmol/L，乳酸24mmol/L，乳酸脱氢酶10 000U/L时，偏差均5%，说明几乎不存在内源性干扰,但外源性干扰如仪器的携带污染同样存在,可用比色法中阐述的方法排除。2本法灵敏度 TBA50

13、mol/L(标本/试剂体积比为1：83)的样品，A410nm(1cm)为0.22左右。Beckman DU-640分光光度计手工操作的批内CV2.0%，总CV4.0%，日立7170自动分析仪的批内CV1.5%。本法(y)与比色法(x)比较y=0.921x1.426，r=0.9982，n=64。本法线性上限180mol/L。,Biobase,胆汁酸在肝内合成、分泌、加工、转化。当肝细胞损伤或胆道阻塞时，会引起胆汁酸代谢障碍，出现血清胆汁酸增高。所以测定血清中总胆汁酸可以作为判断肝胆系统正常与否的重要信息。血清中TBA的诊断价值已得到广泛重视，它不仅用于临床诊断，而且还能反映病情和估计疾病预后。,

14、TBA 临床意义回顾,临床意义简述,急性肝炎时，血清TBA浓度和ALT活力同时升高，分别在正常高限的3、4倍和30倍，两者呈高度正相关;慢性肝病时升高幅度虽不大，但均在正常值上限或2倍左右;肝硬化时ALT和肝功能指标未发生明显改变时，血清TBA浓度明显升高。TBA是反映肝细胞损害非常灵敏的指标。肝硬化时，血清TBA比慢肝升高幅度大，而ALT和常规肝功能指标未明显变化，说明TBA浓度和ALT活力无相关关系，在肝硬化后期，TBA浓度改变更为明显，表明TBA比ALT能更敏感地反映肝硬化患者病情。,孕妇测定TBA的重要性,妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是发生在妊娠中晚期以皮肤瘙痒和黄疸为特征的疾病，胆

15、汁淤积可导致胆小管内形成胆栓，血清中TBA的浓度升高，如不能早期诊断及时对症处理，可引起早产、胎儿窘迫、死胎、新生儿死亡及产后出血等母婴不良后果，列入高危妊娠范畴。临床对典型ICP诊断以出现皮肤瘙痒或不伴黄疸，血清TBA、ALT和ALP升高为依据，其中TBA测定作为ICP的敏感指标，对ICP有重要和早期诊断价值。,胆汁酸测定常见问题,结果出负值 试剂正常时，此现象出现几率应该很低；但也不能100%排除（尤其是标本中TBA含量很低时）定期做试剂空白校准是必要的。,交叉污染,多项目同时测定时，TBA结果经常会偏高；单独复查时，结果又正常：是目前较常见的现象。这是因为：有些试剂组分中添加了较高浓度的胆酸盐,胆酸盐具有胆汁酸的反应特性,自动分析仪器的试剂针引起携带污染 较多研究发现：CHO、TG、Cr、UA试剂对TBA测定有不同程度的正干扰。Cr较轻，CHO、TG较重，UA最为严重。而且不同厂家上述项目中胆酸盐含量也有差异。解决自动生化分析仪试剂针携带污染所致的干扰方法有:安排项目顺序时要求两个项目间至少要有一个非干扰项目，或将被干扰项目放在干扰项目之前；设定试剂针、样品针和反应杯的补充清洗程序,也可大大减低试剂之间的交叉污染。减少胆酸盐含量高的试剂盒的使用,THE EDD,Biobase,