第四部分食品的一般成分分析教学课件.ppt

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1、第四章 食品的一般成分分析,第六节 蛋白质的测定,一、概述1、食品中的蛋白质含量2、蛋白质的生理功用及在食品中的作用,构成人体的重要成分；构成体内多种具有重要生理功能的物质；参与调节和维持体内的酸碱平衡及胶体渗透压；参与神经冲动的传导、思维活动和遗传信息的传递 提供能量；食品的重要营养指标。,各种不同食品的蛋白质含量各不相同，一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。,3、蛋白质系数,蛋白质是复杂的含氮有机化合物，一般蛋白质含氮量为16，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数，不同种类食品的蛋白质系数有所不同。,第六节 蛋白质的测定,第六节 蛋白质的测定,二、测定方

2、法,蛋白质测定方法,凯氏定氮法,蛋白质快速测定法,第六节 蛋白质的测定,（一）凯氏定氮法1、原理 2NH2(CH2)2COOH+13H2SO4(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O,(NH4)2SO4+2NaOH2NH3+Na2SO4+2H2O,第六节 蛋白质的测定,2、仪器凯氏烧瓶、可调式电炉、蒸汽蒸馏装置,第六节 蛋白质的测定,3、试剂（1）硫酸铜（CuSO45HO2）；（2）硫酸钾；（3）浓硫酸；（4）40氢氧化钠溶液；（5）4硼酸溶液；（6）0.1molL盐酸标准滴定溶液（7）95%乙醇。（8）甲基红一次甲基蓝混合指示液 将次甲基蓝（乙醇溶液1g/L）与甲基红（乙醇溶液1

3、gL）按1十2体积比混合。,第六节 蛋白质的测定,4、操作方法 样品消化蒸馏滴定（1）样品消化,样品+0.2g硫酸铜+6g硫酸钾+20ml浓硫酸+玻珠数粒,先小火炭化，无泡沫后，加大火力，液体变蓝绿透明，继续加热微沸30分钟,45度角,消化终点,瓶口不能对着人,盖上小漏斗,（2）蒸馏,第六节 蛋白质的测定,按下图连接好蒸馏装置图,加水至2/3体积处，加数滴甲基橙指示剂和硫酸几毫升，使水呈酸性,夹紧螺旋夹,加热蒸汽发生瓶中的水，检查整套装置是否有漏气现象，不能漏气,第六节 蛋白质的测定,（2）蒸馏,将消化液全部转移到100ml容量瓶中,加10ml硼酸溶液和混合指示剂23d,加入NaOH溶液后颜色

4、为深蓝色或褐色,通入蒸汽开始蒸馏,冷凝管下口浸入硼酸溶液中,取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH,提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室，立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水使之密封。,吸收液变蓝色后继续蒸馏5分钟，将冷凝管尖端提离液面再蒸馏1min，用蒸馏水冲洗冷凝管尖端，取下接收瓶，关闭电源,第六节 蛋白质的测定,第六节 蛋白质的测定,（3）滴定 取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸标准溶液滴定至终点。,滴定前,滴定终点,同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。,第六节 蛋白质的测定,5、计算,第

5、六节 蛋白质的测定,6、说明及注意事项（1）试剂溶液应用无氨蒸馏水配制（2）消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，消化中不时转动凯氏烧瓶，以便冷凝酸液洗下附在瓶壁上的固体残渣，促进其消化完全。（3）为加速消化，常加入 硫酸钾：可提高消化体系溶液温度 硫酸铜：催化剂、消化终点指示剂、蒸馏时碱性反应指示剂,第六节 蛋白质的测定,（4）样品中若含较多脂肪或糖，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。（5）当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢23ml后再继续加热消化。,（6）若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试

6、样5ml的比例增加硫酸用量。（7）一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，一般消化时间约4小时，时间延长可能引起氨的损失。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。（8）蒸馏装置不能漏气,第六节 蛋白质的测定,（9）蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，需再增加氢氧化钠用量（10）硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱，置于冷水浴中使用。（11）蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面,清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源，否则可能造成吸收液倒吸。,第六节 蛋白质的测定,7、自动凯氏定氮仪法 在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏定氮仪法，具有安全、

7、高效、准确的优点。仪器：,消化炉,自动蒸馏装置,第六节 蛋白质的测定,（二）蛋白质快速测定法,双缩脲法 紫外分光光度法 染料结合法 水杨酸比色法,第七节 维生素的测定,一、概述二、水溶性维生素的测定三、脂溶性维生素的测定,维生素是调节人体各种新陈代谢过程必不可少的重要营养素。,维生素,水溶性维生素,脂溶性维生素,维生素B、C等,维生素A、D、E、K,第七节 维生素的测定,二、维生素C的测定总维生素C包括：还原型、脱氢型及二酮古乐糖酸。维生素C常用的测定方法有,测定方法,二氯靛酚法（还原型VC）,荧光法,2，4-二硝基苯肼法（总VC）,碘酸法,碘量法,第七节 维生素的测定,（一）二氯靛酚法（测定

8、还原型抗坏血酸）1、原理,还原型抗坏血酸,还原型2，6-二氯靛酚法（无色）,H+,2，6-二氯靛酚法（粉红色）,+,脱氢型抗坏血酸,+,2、试剂,（1）2%草酸溶液（2）0.000167mol/L KIO3标液（3）1%淀粉溶液；（4）6%KI溶液；,第七节 维生素的测定,（5）抗坏血酸标准溶液(1mg/ml)标定：吸标液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml加1%淀粉3滴用0.001N KIO3标液滴定到淡兰色。,第七节 维生素的测定,（6）0.02%2，6二氯靛酚溶液 标定：吸5ml已知浓度V C标液 加5ml 1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终

9、点。计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）,第七节 维生素的测定,3、测定步骤,样品,还原型Vc的提取,还原型Vc的测定,（1）提取 鲜样的提取：称100g鲜样加等量1%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10-40g匀浆（含1-2 mg抗坏血酸）倒入100ml容量瓶中，用1%草酸溶液稀释定容，混匀。干样的制备：称1-4g（含1-2 mg抗坏血酸）放入研钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，用草酸溶液定容到100ml。上述溶液若颜色深，可加入白陶土，将上述溶液过滤，滤液备用。,第七节 维生素的测定,（2）滴定 吸取5-10ml滤液，置于50ml三角瓶，快速加入2,6二氯靛酚

10、溶液滴定，直到红色不能立即消失，而后再尽快，逐滴加入，以呈现的粉红色在15秒内不消失为终点。,第七节 维生素的测定,4、计算 V-消耗染料体积（ml）V0-滴定空白时所消耗的燃料的体积（ml）T-1ml染料所能氧化维生素C的毫克数 含有样 品的克数M-滴定时所取滤液中含样品重量，g,第七节 维生素的测定,5、说明及注意事项（1）样品采取后，应浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防止维生素C氧化损失，测定过程要迅速。（2）若样品滤液颜色较深，可加入白陶土再过滤。不能使用活性碳进行脱色处理，因为活性碳会氧化维生素C，同时还会吸附维生素C。（3）贮存过久的罐头食品，可能含大量的Fe2+，要用8%的醋酸代

11、替2%草酸。（4）本法适用于果品、蔬菜及其加工制品中还原型抗坏血酸的测定（不含二价铁、二价锡、一价铜、二氧化硫、亚硫酸盐和硫代硫酸盐）。,第七节 维生素的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法 1、原理,还原型抗坏血酸,脱氢型抗坏血酸,氧化,二酮古乐糖酸,氧化,二酮古乐糖酸,2，4-二硝基苯肼,脎,浓硫酸,双-2，4-二硝基苯,520nm比色,第七节 维生素的测定,2、试剂4.5mol/L硫酸（9+1）硫酸2%2，4-二硝基苯肼2%草酸抗坏血酸标准溶液1mg/ml,2%硫尿1%硫尿1mol/ml盐酸1%草酸活性炭,第七节 维生素的测定,3、测定步骤,样品的制备,显色,硫酸处理,比色,氧化,称一定样（

12、100g)鲜样 加等量1%草酸 于高速捣碎机捣碎 取匀浆140g 用1%草酸定容100ml 过滤滤液待用,取滤液25ml 加2g活性炭 摇1分钟 静置过滤 弃去初滤液，取滤液10ml 加入2%硫脲溶液 混匀 得样品氧化液,取上述氧化液各4ml于三支试管中向其中两支管加入2%2，4-二硝基苯肼1.0ml,另一管作空白 将三支管加盖 于37保温箱3小时 取出后样品管放入冰水中 样品空白管取出后冷至室温 在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼 1ml 置于室温下放置10-15min 样品管和空白管都于冰浴中,向上述已放入冰水中的三支试管各加入（9+1）H2SO4 5ml于各管中（边加边摇）将试管从冰浴中

13、取出 室温下放置30分钟后,立即比色，在520nm测吸光度，从标准曲线上查出相应的含量,第七节 维生素的测定,4、标准曲线绘制,加2g活性碳 于50ml抗坏血酸标准溶液中，振摇1min，过滤，过滤。取10ml滤液置于500ml容量瓶中，加5.0g硫尿，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度为20ug/ml。,取7个100ml容量瓶编号 1 2 3 4 5 6 7加VC标液20ug/ml 5 10 20 25 40 50 60ml加硫脲溶液（ml）95 90 80 75 60 50 40ml2，4-二硝基苯肼（ml）1 1 1 1 1 1 1ml 按样品测定步骤进行显色反应，形成脎并比色。以抗坏

14、血酸为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。,第七节 维生素的测定,5、结果计算,式中：X-样品中总抗坏血酸含量，mg/100g c-从标准曲线查得“样品氧化液”中总Vc的浓度，ug/ml V-试样用1%草酸定容的体积，ml m-样品质量，g F-样品氧化处理过程中的稀释倍数,第七节 维生素的测定,三、脂溶性维生素的测定（一）性质,（1）脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂（2）维生素A、维生素D对酸不稳定，维生素E对酸稳定。维生素A、维生素D对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸（3）维生素A、D、E耐热性好，能经受

15、煮沸,第七节 维生素的测定,（二）脂溶性维生素测定 脂溶性维生素测定样品预处理,样品,皂化脱脂,脱脂样品,有机溶剂提取脂溶性维生素,有机溶剂提取液,浓缩测定,1、维生素A的测定-三氯化锑比色法维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。（1）原理,维生素A+三氯化锑,第七节 维生素的测定,氯仿溶液中,兰色可溶性配合物,620nm波长比色,第七节 维生素的测定,（2）适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品（含量高于510g/g）。该法的主要缺点是生成的蓝色配合物的稳定性差，比色测定必须在6S内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。,第七节 维

16、生素的测定,（3）试剂无水硫酸钠、乙酸酐无水乙醚（不含过氧化物）无水乙醇（不含醛类物质）三氯甲烷（不含分解物和水）250g/L三氯化锑三氯甲烷溶液1+1氢氧化钠溶液、0.5mol/L氢氧化钾,第七节 维生素的测定,（4）测定步骤,样品预处理,样品测定,样品预处理含有维生素A的样品大多需首先除去脂肪，把维生素A从脂肪中分离出来。常规的去脂方法是采用皂化法和研磨法。,第七节 维生素的测定,A、皂化法:适用于维生素A含量不高的样品，但全部试验过程费时，且易导致维生素A的损失。皂化:称取0.55g经组织捣碎机捣碎或充分混匀的样品于三角瓶中，加入l0ml 1：1氢氧化钾及2040ml乙醇，在电热板上回流

17、30min。加入10m1水，稍稍振摇,若无浑浊现象，表示皂化完全。,第七节 维生素的测定,提取 将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。再用 50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，所有洗液并入分液漏斗，振摇2min，提取不皂化部分。静止分层后，水层放入第二分液漏斗。皂化瓶再用 30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二分液漏斗，振摇后静止分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑一三氯甲烷溶液呈蓝色为止。,第七节 维生素的测定,洗涤 在第一分液漏斗中加30ml水，轻轻振摇，静止片刻后，放出水层。再加入1520ml 0.5mol/L

18、的氢氧化钾溶液，轻轻振摇后，弃去下层碱液（除去醚溶性酸皂），继续用水洗涤，至水洗液不再使酚酞变红为止。醚液静置10 20rnin后，小心放掉析出的水。,第七节 维生素的测定,浓缩 将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。用水浴蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下。减压抽干，立即准确加入一定量三氯甲烷（约5ml左右），使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内(35g）。,第七节 维生素的测定,B、研磨法 适用于每克样品维生素A的含量大于510g样品的测定，如猪肝的分析。步骤简单、省时，结果准确。研磨 精确称取25g样品，放入盛有35 倍

19、样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。,第七节 维生素的测定,提取 小心地将全部均质化的样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇2min；静置澄清（大约需12 h），或离心澄清（保持低温）。浓缩 取澄清提取乙醚液25m1，放入比色管中，在7080水浴上抽气蒸干；然后立即加入lml三氯甲烷溶解残渣。,第七节 维生素的测定,标准曲线的绘制,6个3cm比色管编号 1 2 3 4 5 6加各种浓度VA标液1ml 10 20 30 40 50 60 ug/ml乙酸酐d 1 1 1 1 1 1于620nm波长处，以 10ml三氯甲烷加 1滴乙酸酐调

20、节吸光度至零点；然后将标准比色系列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑一三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度（每支比色管都在临测前加入显色剂）。以维生素A含量为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制曲线。,第七节 维生素的测定,（5）样品测定 取两个3cm比色管，分别加入1ml三氯甲烷（样品空白液）和lml样品溶液，各加1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查出相应的维生素A含量。,第七节 维生素的测定,（6）计算,式中-维生素A含量；c-由标准曲线上查得样品溶液中维生素A的含量，g/ml；c0-由标准曲线上查得样品空白液中维生素A的含量，g/ml；m-样品质量，g；V-样品提取后加入三氯甲烷定容之体积，ml；100-以每100g样品计。,第七节 维生素的测定,（7）说明及讨论维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。所用氯仿中不应含有水分由于三氯化锑与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始比色，产生蓝色后立即读取吸光度。,谢谢大家!,