毕业设计论文二甲苯对小鼠肾组织损伤的研究.doc

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1、二甲苯对小鼠肾组织损伤的研究摘 要本试验以小鼠为试验动物，通过腹腔注射二甲苯染毒建立试验模型，测定小鼠肾组织中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛(MDA)含量，以及制作组织切片进行病理学观察，从而分析评价二甲苯对小鼠的损伤程度。将小鼠随机分为、组，组为对照组（注射生理盐水），其他三组分别用不同浓度的二甲苯（用药剂量分别为0.125 ml/kg、0.25 ml/kg、0.5 ml/kg）经腹腔注射小鼠染毒15天，15天后处死、剖解小鼠，观察肾组织的大体变化并制作肾组织切片。使用SOD、MDA试剂盒测定不同试验组小鼠的肾组织匀浆中SOD的活力和MDA的含量。结果显示，组染毒小鼠的SOD活力较其他

2、三组下降极显著（P0.01），而MDA的含量则增加极显著（P0.01）；组和组的差异不显著，但相较于对照组差异显著（P0.05）。病理学变化：组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，但病变不是很明显；组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，细胞排列紊乱，脱落到管腔中，相对于组病变较明显；组见皮质区部分近端肾小管上皮细胞刷状缘脱落，有部分出现肾小球破裂、出血，部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性。关键词：二甲苯，肾组织，超氧化物歧化酶，丙二醛，组织切片XYLENE ON RENAL INJURY IN MICEABSTRACTIn this experiment, mice as exper

3、imental animals exposed by intraperitoneal injection of xylene to build a test model, kidney tissue of mice, superoxide dismutase (SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content, and the production of tissue in the disease Science observation, analysis and evaluation of xylene to injury in mice. Th

4、e mice were randomly divided into , , , group, group was the control group (normal saline), the other three groups were treated with different concentrations of xylene (drug dose of 0.125 ml/kg、0.25 ml/kg、0.5 ml/kg) via intraperitoneal injection in mice exposed to 15 days, 15 days after the death, d

5、issection mice, the general changes in renal tissue and production of renal biopsy. Use of SOD, MDA reagent kits of different experimental groups of mice, the kidney, SOD activity and MDA content. The results showed that, group of mice exposed to SOD activity than the other three groups decreased si

6、gnificantly（P0.01）, while MDA content increased significantly（P0.01）; and group was not significant, but compared with the control group were significantly different（P5，参照蓄积系数分级标准，可知，经呼吸道吸人的挥发性有机化合物对小鼠的蓄积作用极弱。同时也不排除小剂量反复接触挥发性有机化合物混合物可能对机体产生一定耐受性的可能。该结果可为迸一步开展慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。1.4 SOD和MDA的测定意义

7、超氧自由基（O2-）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。自由基是本身带有不成对价电子的分子、原子、原子团或离子，化学性质非常活泼，是活性氧的一种。如果细胞中缺乏清除自由基的酶时，机体就会受到各种损伤。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase），简称SOD，能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧自由基（O2-），生成H2O2和O2。H2O2由过氧化氢酶（CAT）催化生成H2O和O2，从而减少自由基对有机体的毒害。因此，超氧化物歧化酶（SOD）是机体天然的自由基清除剂，保护组织免受超氧自由基的攻击。SOD是生物体内最有效的氧自由基清除系统，能清除生物体内有氧代谢的中间产物超氧负离

8、子自由基，是抗氧自由基损伤的第一道防线。在防御氧的毒性、抗氧化损伤、预防衰老以及防治肿瘤和炎症等方面有重要意义。另外研究认为外源性SOD的保护作用主要通过以下几方面起保护作用：加强清除自由基，并减少细胞内游离多胺的耗损，降低细胞对辐射的敏感性；提高鸟氨酸脱梭酶(ODC)活性；增强细胞内多胺的生物合成等，降低细胞对辐射的敏感性，从而提高细胞的生存率；减少细胞DNA的损伤抑制细胞凋亡；激活Bcl-2 mRNA的过度表达，延迟细胞内DNA的断裂。SOD是体内特异性超氧阴离子自由基的抗氧化酶，它的作用是将氧自由基歧化，生成氧气和过氧化氢，从而阻断毒性更强的羟自由基的产生。通过对SOD活力的测定，可以间

9、接反映出细胞的氧化损伤程度5。机体内氧化自由基的生成使SOD活性下降，导致膜脂质发生过氧化损伤，生成大量丙二醛（Malondialdehyde，MDA），使细胞进一步遭到损伤。MDA是体内重要的脂质氧自由基，为未饱和脂肪代谢产物，毒性强，可与蛋白质和核酸结构上氨基、巯基等发生交联作用，从而破坏蛋白质和核酸的正常结构，并使之丧失原有功能；还可使细胞间隙增大，通透性增高，加速细胞进一步损伤。测试MDA含量常常可以反映机体内脂质过氧化的程度，MDA含量的变化可间接反映运动中自由基的生成量和体内物质的代谢情况，间接的反映出细胞损伤的度程5。1.5 本试验研究的目的及意义 二甲苯主要通过经呼吸道、消化道

10、及皮肤吸收，并最终进入血液循环。而人接触过量二甲苯则会引起中枢神经系统麻醉，出现头痛、恶心、胸闷、乏力和意识模糊，严重者可致昏迷以致呼吸循环衰竭而死亡；动物长期接触二甲苯则会出现明显的形态学变化6。本试验通过用不同浓度的二甲苯感染小鼠并对其进行跟踪观察，记录其肾脏组织的病理变化和生化指标（SOD、MDA）的改变，并通过制作组织切片，观察中毒后小鼠肾组织结构的变化，对二甲苯的致病机理进行深入的研究。通过试验初步研究二甲苯染毒对小鼠肾脏组织的毒性及其致毒作用机制，为进一步探讨二甲苯的毒性效应提供参考，为综合评价二甲苯的安全性和室内环境污染研究提供理论依据。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1试

11、验动物选取20 d龄体重20 g左右的健康，发育良好，体重相近的断奶小鼠96只（购自河南省实验动物中心），雌雄各半。2.1.2试验试剂二甲苯、乙醇、蒸馏水、甲醛、石蜡、甲醛固定液、苏木精-伊红（HE）、梯度酒精（30，50，75，80，85，90，95，100）、0.5盐酸酒精分化液、中性树胶等。主要试剂的配制方法：甲醛固定液的配制：多聚甲醛 ：40 g溶于500ml蒸馏水NaH2PO412H2O ：71.632 g溶于1000 ml水NaH2PO42H2O ：31.200 g溶于1000 ml水取Na2HPO412H2O 810 ml和NaH2PO42H2O 190 ml与配制好的多聚甲醛溶

12、液混合均匀，即为所需的甲醛固定液。伊红溶液的配制（醇溶性）伊红 ：5 g 75%酒精 ：1000 ml 加几滴冰醋酸至半透明状。苏木精溶液的配制苏木精 ：1.001 g无水乙醇 ：10 ml钾明矾（硫酸铝钾）：2.010 g蒸馏水 ：200 ml高锰酸钾 ：1.002 g2.1.3试验器材 饲养鼠笼，1 mL注射器，冰箱，超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司），丙二醛（MDA）测定试剂盒（购自南京建成生物科技有限公司），各种型号微量移液器、载玻片、镊子、盖玻片、标签、记号笔。2.2 试验方法分光光度计（7230 G）上海精密科学仪器有限公司分析仪器总厂数显恒温水浴（

13、HM-6）金坛晓阳电子仪器厂台式离心机（800型）上海浦东物理光学仪器厂KD-T电脑生物组织摊烤片机KD-BM生物组织包埋机LEICA RM2016切片机OLYMPUS-CX21型显微镜2.2.1试验分组采取随机分组法分为四组，雌雄各半。组为对照组，组为低剂量组，组为中剂量组，组为高剂量组。动物购回后进行一周的试验前饲养，使小鼠适应试验环境。表1试验组注射剂量分 组二甲苯含量（ml/kg）组0组0.125组0.25组0.5对四组小鼠进行二甲苯的腹腔注射。2.2.2临床观察内容分别在预饲期和正饲期间记录各组试验小鼠的采食、饮水、精神、粪便、可视黏膜、被毛、姿势与运动、行为、体格等临床表现。2.3

14、 检测指标与检测方法染毒15 d后处死小鼠，解剖取组，组，组，组试验的肾组织。取出的肾组织一部分制备组织匀浆。然后用超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒进行两项指标的测定。余下肾组织保存于甲醛固定液中进行切片前的固定。2.3.1SOD活力的测定方法 按照试剂说明书进行实际的配制，而试剂的添加则按表2进行，然后按照以下公式进行计算：组织匀浆中SOD活力=(对照管吸光度测定管吸光度)/对照管吸光度50(反应也总体积/取样量)组织中蛋白含量表2 SOD试剂的添加步骤试剂（ml）测试管对照管试剂一样品蒸馏水试剂二试剂三试剂四1.050 l00.10.10.11.0050 l0

15、.10.10.1用漩涡混匀器充分混匀置37恒温水浴40 min显色剂22混匀，室温放置10 min于波长550 nm处测量（蒸馏水调零） 其中组织匀浆的浓度为1%2.3.2MDA含量的测定按照试剂说明书进行实际的配制，而试剂的添加则按表3进行，然后按照以下公式进行计算：组织匀浆中MDA含量=(对照管吸光度测定管吸光度)/（标准管吸光度对照管吸光度) 标准品浓度组织中蛋白含量(标准品浓度为10 nmol/ml)表3 MDA试剂的添加步骤 标准管 标准空白管测定管测定空白管10 nmol/ml标准品（ml）无水乙醇（ml）0.10000000测试样品（ml）试剂一（ml）00.100.10.10.

16、10.10.1混匀（摇动几下试管架）试剂二（ml）试剂三（ml）1.51.51.51.51.51.51.5050%冰醋酸（ml）0001.5其中组织匀浆的浓度为5%漩涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95水浴40 min，取出后流水冷却，然后35004000转分，离心10 min，取上清液，532 nm处，1 cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度。2.3.3 组织中蛋白含量测定按照考马斯亮蓝法测得各剂量组组织中的蛋白含量（mgprotml）。2.4 石蜡切片的制作2.4.1切片的制备取材 材料新鲜，取材组织愈新鲜愈好，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。组织块的大小

17、，所取组织块较理想的体积为2.0 cm1.5 cm0.3 cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同1。用于固定组织的固定液是4%的中性甲醛。固定液的量一般为组织体积的510倍。一般情况下，小标本的固定时间为46h，大标本的固定时间为1824 h或更久1。梯度乙醇脱水 60、70、75、80、85%乙醇各1.52 h，85乙醇最好过夜，90、95、95、100、100乙醇各4050 min，乙醇的容积应为组织块总体积的510倍以上；透明 先用50二甲苯酒精溶液透明5 min，再用纯二甲苯透明，透明时间视效果而定，一般组织材料出现黄色透明现象时

18、即可停止透明，本试验用纯二甲苯透明时一般透明4 min左右，二甲苯的容积应为组织块总体积的510倍以上；浸蜡 将透明好的组织放入65 恒温箱中的装有石蜡的烧杯里浸蜡1 h，温度为60 62 ，然后放入第二个烧杯里再浸蜡1 h，温度为60 62 ，石蜡容积为组织总体积的510倍以上；包埋 将组织块放入包埋用的金属盒中，用包埋机进行包埋。切片 将蜡块安装固定在推拉式切片机上，将切片刀装在刀架上，调整刀刃与蜡块至合适位置，使刀刃与蜡块呈510夹角。先将切片机切片厚度调整为10 m，修切组织块表面，直到全部暴露组织块切面为止。然后将切片机切片厚度调整为5 m，进行连续切片1。展片、捞片和贴片 将切好的

19、蜡片用毛笔托起轻轻放到45的水面上，待其完全展平后，用预先准备好载玻片轻轻捞出。每切完一个蜡块后，必须认真清理水面，不得遗留组织碎片，以防造成污染；捞片时应注意蜡片位置（放在载玻片左或右2/3处中央），蜡片与载玻片之间应无气泡，捞起切片后，立即写上编号。烤片 将已放置了蜡片的载玻片呈45斜置片刻，待载玻片上的水分流下后插入切片架中，放入烤箱内烘烤，一般在60 烤箱内烤2 h。2.4.2切片脱蜡二甲苯8 min二甲苯8 min梯度乙醇（100，100，95，85，75）各3 min切片置蒸馏水浸泡1 min2.4.3染色置苏木精中染色1015 min自来水冲洗30 s 0.5盐酸酒精分化2040

20、s，自来水冲洗30 s（苏木精染色较重时应做分化）伊红染液复染23 min自来水速洗2.4.4 脱水、透明、封片梯度乙醇脱水（85，95，95，100，100乙醇各35 min）透明（二甲苯5 min，二甲苯5 min）晾干，中性树胶封片12.4.5镜检观察在显微镜下进行镜检，找出清楚的病变并进行拍照取证。3 结果3.1 二甲苯染毒小鼠肾脏组织的大体观察染毒过程中小鼠采食、饮水未见明显异常。染毒5天后组小鼠注射二甲苯后半小时出现角弓反张现象，小鼠后肢瘫软无力，行走困难、左右摇摆，约半小时后恢复正常。7天后未出现此现象。攻毒15 d后处死小鼠，解剖观察染毒组小鼠肾组织见有不同程度的出血点和肿胀现

21、象。组小鼠肾组织的出血点多于组和组；组与组的肾组织未见明显区别。组小鼠解剖时腹腔脏器出现黏连现象，不容易分离；组也出现脏器黏连现象，但相对于组情况较轻。3.2 二甲苯对小鼠肾脏组织中SOD活力的影响 由表4可以明显看出染毒组小鼠肾脏组织中SOD活力均低于组，组相对于组差异极显著（P0.01），组、组相对于组差异显著（P0.05）。组小鼠肾脏组织中SOD活力低于组，差异显著（P0.05）。组高于组，但差异不显著。表4 试验组小鼠肾组织中SOD活力二甲苯染毒分组组织中SOD的活力水平（U/mgprot）组119.134.01组77.592.01*组51.272.62*组25.890.46*注: *

22、与对照组比较,*表示相对于对照组差异显著P0.05，*表示相对于对照组差异极显著P0.01。SOD活力用药剂量(ml/kg)组：对照组组：0.125组：0.25组：0.5 3.2 二甲苯对小鼠肾脏组织中MDA含量的影响由表5可以明显看到染毒组小鼠肾脏组织中MDA含量均高于组，但组相对于组的差异极显著（P0.01），组、组相对于组差异不显著。组小鼠肾脏组织中MDA含量均高于组、组，且差异显著（P0.05），组MDA含量高于组，差异不显著。表5试验组小鼠肾组织中MDA含量二甲苯染毒分组组织中MDA的含量（nmol/mgprot）组3.020.079组12.730.551*组17.930.498*组

23、25.790.535*注: * 与对照组比较,*表示相对于对照组差异显著P0.05，*表示相对于对照组差异极显著P0.01。MDA 含量用药剂量（ml/kg）组：对照组组：0.125组：0.25组：0.53.3 二甲苯染毒小鼠的肾脏组织的切片观察肾脏是机体的排泄器官，它可以将机体内的废物读毒物排出体外。而二甲苯属于有毒物质，当二甲苯进入机体后会经循环进入肾脏进行排泄，可能会造成肾脏组织的损伤4。 组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，但病变不是很明显（见图3、图4）。组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，细胞排列紊乱，脱落到管腔中，相对于组病变较明显(见图5、图6)。组见皮质区部分近端肾小

24、管上皮细胞刷状缘脱落，有部分出现肾小球破裂、出血(见图7），部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性（见图8）。图1 对照组肾组织（HE 400）图2 对照组肾组织 （HE 100） 图3 低剂量组肾组织近曲小管细胞之间边界模糊不清（HE 400）图4 低剂量组肾组织（HE 100）图5 中剂量组肾组织细胞排列紊乱，脱落到管腔中（HE 400）图6中剂量组肾组织细胞排列紊乱（HE 100）图8 高剂量组肾组织出血（HE 100）图7 高剂量组肾组织肾小球破裂、出血（HE 400）4 讨论与分析4.1 二甲苯对小鼠肾脏组织中SOD活力的影响SOD是动物体内广泛存在的重要的抗氧化酶，其活力的大小反

25、应了机体内脂质过氧化的程度，间接地反应出细胞受损的程度。SOD是体内特异性超氧阴离子自由基的抗氧化酶，它的作用是将氧自由基歧化，生成氧气和过氧化氢，从而阻断毒性更强的羟自由基的产生。因此，SOD可以清除体内的自由基，有广泛的抗氧化作用，可以保护组织免受自由基的攻击。本试验用二甲苯对小鼠进行腹腔染毒发现，二甲苯可以使机体产生大量的自由基，最终导致SOD活力降低从而引起组织损伤。试验发现：组的小鼠肾组织SOD活力较组显差异极显著（P0.01），组、组较组SOD活力差异显著（P0.05）；组较组、组差异显著（P0.05），组、组差异不显著。试验结果中SOD活力降低与染毒剂量呈明显的量效关系，即随着二

26、甲苯染毒剂量的增加SOD活力降低。这一结果与杨巧媛等的研究结果相吻合5。这进一步说明，随着染毒剂量的增加，组织中的自由基数量也增加，而消除自由基的SOD活力降低，使组织损伤的程度也增加。组自由基数目显著增多，致使SOD活力降低极显著，引起肾组织损伤的程度也较为明显。4.2 二甲苯对小鼠肾脏组织中MDA含量的影响MDA的测定常和SOD的测定相互配合进行, SOD的活力间接反映了机体清除自由基的能力, 而MDA的含量又间接反应了机体细胞受自由基攻击的严重程度5。MDA是体内重要的脂质氧自由基，为未饱和脂肪代谢产物，毒强性，可与蛋白质和核酸结构上氨基、巯基等发生交联作用，从而破坏蛋白质和核酸的正常结

27、构，并使之丧失原有功能；还可使细胞间隙增大，通透性增高，加速细胞进一步损伤。本试验用二甲苯对小鼠进行腹腔染毒发现，二甲苯可以机体产生大量的自由基，使SOD的活力降低从而产生大量的MDA。试验发现：组的小鼠肾组织MDA含量较组增加极显著（P0.01），组、组MDA含量增加与组差异显著（P0.05）；组与组、组差异显著（P0.05），组与组差异不显著。随着二甲苯染毒剂量的增加，SOD活力降低，进一步引起MDA含量的增加。这说明，随着染毒剂量的增加，组织中的自由基数量也增加，而消除自由基的SOD活力降低，使得MDA含量增加，组织损伤的程度也增加。组自由基的数量明显增加，SOD活力降低显著，导致MDA

28、含量增加显著，引起肾组织损伤的程度也较为明显。4.3 二甲苯对小鼠肾脏的组织学影响本试验通过制作肾脏的组织切片，对染毒小鼠的肾脏进行组织学观察，进一步探讨二甲苯对小鼠的致病作用。肾脏的血流量占心脏每分钟射血量的25，血液在肾脏流经肾小球及肾小管周围毛细血管网二套毛细血管系统；通过“逆流倍增”，经肾小球滤过和肾小管重吸收至尿液中的物质，若不能很好地被吸收，肾小管中的浓度可达血液中浓度的数倍，直接损伤肾小管上皮细胞。此外，二甲苯进机体内后可以经生物代谢酶，尤其是在肾小管上皮细胞转化为有毒性的代谢产物。这些因素使得肾组织中以肾小管首先受损2。 切片观察四组的试验小鼠肾脏组织发现：组肾组织肾近曲小管细

29、胞之间边界模糊不清，但病变不是很明显；组肾组织肾近曲小管细胞之间边界模糊不清，细胞排列紊乱，脱落到管腔中，相对于组病变较明显；组见皮质区部分近端肾小管上皮细胞刷状缘脱落，有部分出现肾小球破裂、出血，部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性2。这一结果与蒋灵芝等报道的相一致4。且与SOD和MDA对组织损伤作用的规律相吻合，说明随着二甲苯剂量的增加，自由基的数量也增加，SOD活力降低，MDA含量增加，所引起的组织损伤程度也增加。5 结论小鼠二甲苯急性中毒后肾组织见有不同程度的出血点和肿胀现象。解剖时腹腔脏器出现黏连现象，不容易分离；且用药剂量越高，出血和黏连现象越明显。病理变化主要表现在近端小管上

30、皮细胞刷状缘脱落，细胞排列紊乱，肾小管上皮细胞的崩解、坏死、脱落至管腔。部分近髓处小管上皮细胞肿胀，伴有空泡变性。中毒小鼠肾组织中SOD活性随着二甲苯染毒剂量的增加而逐渐降低，MDA含量随着二甲染毒剂量的增加呈上升趋势，这表明小鼠体内肾脏的损害程度随着二甲苯含量的增加而加剧，即二甲苯对小鼠肾组织损伤的程度与染毒剂量有明显的量效关系。参考文献1 罗艳蕊.石蜡切片帖片法的改良J.生物学杂志,2002,6：38.2 秦卫松,刘志红,芦怡舟,等.有机溶剂肾损害的动物试验研究J.与透析肾移植杂 志,2008,6(12)：517-522.3 沈霞芬.家畜组织学与胚胎学（第三版）M.中国农业出版社,2002

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