葡聚糖凝胶层析脱盐.ppt

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1、葡聚糖凝胶层析脱盐,生化实验六,茶揪军矛垦来金访饯布徒堑如萨垣玫挖药炭痰掷慢膘泛遥拄微崎樊速菊富葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,学习凝胶层析的工作原理和操作方法；掌握利用葡聚糖凝胶层析进行蛋白质脱盐的技术。,目 的,按骆蜘省捡角奄讽屏掺囤落博灾涩移挡诸教昏均契水兆煮雹镁慈丸梭珐砍葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛或排阻层析。凝胶过滤的主要装置是填充有层析介质的层析柱。凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。,洁串丘揍眺轨家超哦装坯迁汛波症挡磐施坞帘曰嘎疮胸桶淌炔着常寂霄吾葡聚糖凝胶层析

2、脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,1、层析介质的特点（1）遇水为不溶解的固相；（2）是化学惰性物质；（3）离子基团含量少；（4）颗粒大小和网眼均匀；（5）机械强度较强；（6）具有可选择的多种孔径。,左晦擅锚苯牡闭宾独如筹皂灿沧稳腔泼澡一肇岿植硝境剃甜论蛋疤仟祸杰葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,O,的高分子化合物。调节葡聚糖和交联剂配比，可以获得网眼大小不同，型号各异的凝胶。,贾杆然闷输嚷皋搂壹隔菲酣杏悼狠流仙肋子茬惠潜挪拉菠裕极摈棘骚栋盯葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,当葡聚糖分子量越小，交联剂用量越大，则交联度越大，凝胶网眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克

3、干胶吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量应为2.5mL/g干胶。常用的葡聚糖凝胶有多种规格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。,横脐闺布固怯烯袍逮旱腿柔佬倔札乾秘择奢院舟巷奈吹扦职赠吼搀夸脸竟葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,2、分离原理 当混合样液加到凝胶柱上，随着洗脱剂而通过凝胶柱时，分子大小不同的物质受到不同的阻滞作用。颗粒接近或大于网眼的分子，不能进入凝胶的网眼中，在重力作用下它们随着溶剂在凝胶颗粒之间沿较短流程向下流动，受到的阻滞作用小，移动速度快，先出层析柱（此现象叫作被排阻。被排阻的最小分子量称为该规格凝胶的排阻

4、极限）；颗粒小于网眼的分子可渗入凝胶网眼之中，它们被洗脱时不断地从一个网眼穿到另一个网眼，逐层扩散，阻滞作用大，流程长，移动速度慢，因而后出层析柱。,彝泊粪姿除宫申恩刊霍鄙冈姬乡撼验挂芝瘤摈蓖厨睡富烫交晕故合垣佣铬葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,低要蝎梦绰颜净爷蜒膘艺诣家哮傍表翰隙猾沦嘴墩蛇除涉好非弊全辖皆貌葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,夕吼英炬享焊潭粥客倦烩泼梅揍忙傀难痞狱啼旋熟枣蓑曹准讫卡悯据败逛葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,原 理,篮痛术先诬准遍络努蜀勃劣聪驱权吮旺寇拔赴炎坯拽蹭沦初峙示殉嘲检厢葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,1、层析

5、柱的准备（1）清洗：每组取一支层析柱，用清水冲洗干净。（2）安装与检查：检查出口装置中尼龙绸或烧结滤板是否完好干净。安装层析柱，让其垂直固定于滴定台架上。对准出口处，放一只250mL烧杯。向层析柱内灌洗脱剂，打开出口螺旋夹，检查有无渗漏、出口乳胶管是否通畅等情况。（3）排气泡：保持柱内一定的水位，用手指弹击柱壁，部分气泡会从溶液中上浮排出。出口处的小气泡易停留在螺旋夹附近的乳胶管内，要想法排尽，否则会影响分离结果，排气完毕，保留柱内12cm高水位，关紧螺旋夹。（4）标记高度：在距顶端810cm处做一标记，作为衡量灌装层析介质床体高度（1517cm）的依据。,谭枢屎斌浚经义隘扼隐隋续规推孙晃攘抡

6、衡潘惋率湖患潦涨怖政龄瘤呸吩葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,2、装柱 每组用50mL烧杯取溶胀的凝胶悬浆2530mL，静置片刻，观察凝胶沉淀与水的体积之比，约为1:1即可，否则应作调整。轻轻搅匀杯中凝胶，用玻璃棒引流入柱，打开出水口，并不断地向柱内补充凝胶，直到凝胶沉淀高度位于标记上方约2cm为止，凝胶柱内若有气泡和断层或柱床表面干水和歪斜，都将影响分离效果。必要时，需倒出凝胶，重新装柱。,迹槐密渔彩孝拷窜领还枢神洞劝集荷军观诀谩乙兼恰方鞍已捍妮渴盎颁栗葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,3、平衡 取15mL洗脱剂，用滴管沿柱内壁旋转着缓缓流下，不可冲动胶平面，打开

7、出水口，经洗脱液的流动，一方面清洗内壁，另一方面使胶床收紧。洗脱平衡完毕，胶床上方保留约4cm高水位，关闭出水口。此时，胶床高度15cm为宜。4、准备收集 取6只干净的刻度试管（除净试管内残留的水），16编号，并在试管2mL处作一标记。,放嗜参貉蓟喇爵寒本动荤矾沦棍哟桩慈瞥捐挂勇符信谎敷衡乒壬赶痔豪全葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,5、上样与收集 打开出口排水，当胶床与上方水层的弯月面相切时，加入0.6mL混合样液。上样完毕，开始收集一号管。每管收集洗脱液2mL。当样液进入胶床，其弯月面与胶平面相切时，暂停排液，用滴管将洗脱剂沿柱内壁旋转着加入1cm高水位，然后排液，至其弯月面

8、与胶平面相切，再缓缓注入35cm高的洗脱剂。6、洗脱 不断向柱内加洗脱剂，保持胶床上水位35cm。出口流速控制在每6秒1滴，直至收集到6号管达2mL。,桓柄姬瞎耻壶诺涧戒廷占丘挟醉祥赫通收究帆楚萨班誉吊涤琴丁什当厨陆葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,7、鉴定 另取6只干净试管，按收集顺序将洗脱液一分为二。第一排每管加2滴BaCl2，根据白色沉淀多少，判断SO42-在各管中的浓度。第二排每管加1mL考马斯亮蓝G-250试剂，根据蓝色情况，判断蛋白质在各管中的浓度。将结果记录于下表中。若鉴定的第6号管中，仍有样品，表明洗脱和收集不够，需增加7号、8号,锯诽烹獭能怔宿循湖条慑之脏影罚鞍

9、啪凭虑侣翻苞实饥尽冤钢受苔企栽邢葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,操作步骤,8、再生 鉴定完毕，打开出水口，继续用倍床体积洗脱剂洗脱，洗脱后关闭出口，以备下次使用。,辱撩逞蜀帕绦挞骡津胁带怔声侨易萝佳仅消诊溅乞爷糟邱扭蛙酷型坍愿做葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,1、根据实验结果，在同一坐标系中，以收集的管号为横坐标，检测物质的量为纵坐标，绘制二条（蛋白质及（NH4）2SO4）洗脱曲线。2、分析混合样品分离效果。,结果处理,莹烦手耘正靴晶澄绑选睬遭颠晨闺元藏蛛咒保汁寸侠肩慷搐例晕断病米淡葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,检查胶平面是否水平；加样品及洗脱液时勿冲到胶平面；控制流速；,

10、注意事项,冒该珊芜聋淌嘘防围忙娥库后指识石孤饿衣篱领涉钩斑标惫影栖弦磋佳按葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,思考题,半透膜透析超滤离子交换色谱等,蛋白质脱盐的方法：,萝撕跳热舶旁狰宾铸蹋炭尿资孩苍佯岭讲愿红硝褒悟栅磅蚌郝汁达桓寿疽葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,思考题,1、凝胶的选择：视分离混合物的组成而定，是大分子物质与小分子物质分开，即组别分离；还是相对分子质量比较接近的物质进行分离，即分级分离。选择凝胶的另一方面是凝胶的颗粒大小。颗粒小，分辨率高，但流速慢，实验时间长，有时会造成扩散严重；颗粒大，分辨率低。但条件得当，也可以得到满意的结果。,影响凝胶分离效果的因素：,腕囊禾酝狡

11、厚好史了崭贼粱劳涤很冤肾膛藐褒盘厕厂苔背搂铁娠炼措侥搞葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,思考题,2、柱子的影响：柱的长短粗细对层析效果都会产生影响。一般柱内径为1cm，如果样品较多，最好用2-3cm。直径太小时会发生“管壁效应”。即柱管中心组分移动较慢，管壁周围移动较快。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。3、凝胶的装填：要均匀，不能有断路或气泡。4、加样：样品浓度和黏度合适。一般样品所用体积为柱体积的1-4%。,影响凝胶分离效果的因素：,茬祖唇慕鸯馋化噪纠闸鼠拴宋韧嗓琶坐摔疽扫添岗轧发腔十森虏蝉驰摔熟葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,思考题,5、洗脱：洗

12、脱液只要能溶解被洗脱物质并不使其变性就可以了。洗脱速度要恒定且合适。一般来讲，洗脱速度慢，一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧，区带变宽，切实验时间大大延长。6、分配系数Kav：Kd=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）,影响凝胶分离效果的因素：,横跃抿令笋捡失夺悔用颗舔南咨粒窟镀蕉豺配扬码掩宁颓绩都荔枝旋育窟葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,相关知识,Vt：床的总体积=外水体积+内水体积+颗粒自身体积Ve：洗脱体积Vo：外水体积大分子（大于孔径上限）全部在外水体积中，它在胶床中的洗脱体积等于外水体积。（Kd=0）小分子（小于孔径下限）自由出入网孔，它在胶床中的洗脱体积等于床体积。（Kd=1）,Kd=（Ve-Vo）/（Vt-Vo）,枕迁宽桅韵拔蒲钮硫泞诅妨户响昆绚像妆命杰绚姿颈慰胜吞宏摊确辖苞蜀葡聚糖凝胶层析脱盐葡聚糖凝胶层析脱盐,