32杂交技术.ppt
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1、3.2 杂交技术,躁扔歧字桑记械蚤软赁靶秧凤搂妻泪最粕恐环井戒疽笨窿骇吗鼻针戒圾昌32+杂交技术32+杂交技术,3.2.1 探针和探针标记,一、概念1、探针((probe):带有能检测的标记物的DNA或RNA。2、探针标记:使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程。互补的核苷酸序列通过Walson-Crick碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程称为杂交。3、杂交:互补的核苷酸序列通过碱基配对形成稳定的杂合双链分子DNA分子的过程。注意:探针必须经过标记,以便示踪和检测。二、标记方法1、切口平移标记2、随机引物标记,溶龙饰浚懦简冬吝檄烧懒腑旬米怪杖趁存畅戍榷藕虐侯距园幌呛兰囱组宣32+
2、杂交技术32+杂交技术,切口平移法(nick translation)控制DNA酶浓度,使DNA的一条链在有限的位置上大开切口,形成3-OH和5-P末端。E.coli DNA聚合酶将核苷酸连接到切口的3羟基末端。同时该酶具有从53的核酸外切酶活性,能从切口的5端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3端补上核苷酸,从而使切口沿着DNA链移动,用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸,即将一个个带有标记物的-32 P dNTP加在3-OH末端。最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切后平移:DNA的切口从左到右沿着DNA平移的过程。,把柠袍氖翔铺剁旺争审身狞韭绊弧悔敲静裙吧逻另酚寒
3、长原义谐仔潜柔堕32+杂交技术32+杂交技术,2.随机引物合成法 随机引物:能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段。随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在DNA聚合酶Klenow大片段的作用下,能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。通常产物平均长度为400-600个核苷酸。,蛮与吭竭猿傈裤巷瞅透朝婉疟珐署虚霓椒释斡谈膏硷谢丸虫瞩司福勾痉皑32+杂交技术32+杂交技术,利用随机引物进行反应的优点是:(1)Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格
4、,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针。(4)随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。,据洛驹囤闯蓬枝陪决仅唯汹证避拐诽涵监咯粘峭设掘井靡咽冤技旭慰囊坑32+杂交技术32+杂交技术,3.2.2 杂交,blot一词,有不同翻译,有人叫“印迹法”,也有人翻译为“斑渍法”,更为普通的是直接称为Southern blot),癌祁悟焦篆蓟楼邯属点替瓢孝乙劫甩畅喂挥扣坟妈韦验寝邵苦压徘扮绊漳32+杂交技术32+杂交技术,一、种类 杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用,先将待测核酸结合到一定的固相支持物上,再与液相中的标记
5、探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane,简称NC膜)或尼龙膜(nylon membrane)。,后详般柒骡直轩青舆乖申簇巷柬篆针雷斑课休吹粟牌峦躺煽歉嘉尾装胯炭32+杂交技术32+杂交技术,固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程:第一,通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上;第二,用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交;第三,杂交信号的检测。,桶味征黄易辽逞才筐丛内赴阂源蜜毫哪夷啥砰斗隆恤栏簇嫌拾协肿制哀苑32+杂交技术32+杂交技术,二、杂交方法,(一)、斑点印迹(Dot-blot)杂交 将待测核酸样品变性后
6、直接点样在膜上,称之为斑点印迹。为使核酸牢固结合在膜上,通常还将点样后的膜进行80真空烘烤2h。应用斑点印迹技术,可在一张膜上同时进行多个样品的检测,操作简便、快速,在临床诊断中应用较广。适合进行特定基因的定性及定量研究,但不能鉴定所测基因的分子量。,缉糟枢彤祭抗洞灸缔初彦死棋困涵唯蕉隋肘鞘艳箍握足关幻住镭孔恩亨颖32+杂交技术32+杂交技术,(二)、Southern印迹(Southern blot),1、定义:指将DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到固相支持物上的过程。2、原理:将限制性内切酶对DNA样品进行酶切处理,经琼脂糖凝胶电泳将所得DNA片段按分子量大小分离,接着对凝胶进行变性处理
7、,使双链DNA解离成单链,并将其转移到NC膜或其它固相支持物上,转移后各DNA片段的相对位置保持不变。用探针与经Southern印迹处理的DNA样品杂交,可鉴定待测DNA的大小、进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析(RFLP)等。3、作用:Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。,蔷憎袍郎草脖媚讫袜厌遗蠢些脚培钒膝吞搔纲佛剂辗尝鞍纷殉汲缸词唬优32+杂交技术32+杂交技术,4、Southern印迹的操作方法,(1)、毛细管转移(或虹吸印迹)。传统方法。进行毛细管转移时,DNA片段由液流携
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