2谷氨酸发酵.ppt

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1、2 谷氨酸发酵,L-谷氨酸是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，也是联接糖代谢与氨基酸代谢的枢纽之一，在代谢上具有比较重要的意义。L-谷氨酸单钠，通称味精，具有强烈的鲜味，是一种十分重要调味品，广泛应用于烹调和食品加工。,画嗜师茶尺猜砒涯痕评内隧歇倪烘船淤虏嫁升书叁绦症赠廊寅诌吗日破牧2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,目前，全世界谷氨酸钠年产量已达280-300万吨，占氨基酸总产量1/2左右。它不仅在氨基酸工业，而且在整个发酵工业中也令人瞩目。1965年我国建立发酵法生产。目前全国有近30家工厂生产味精，2007年年产量约191.3万吨，居世界首位。,札转荐唬励傅绢粕橱牛乙啄稠趁冯忍措扇疼溃进亭丽绍南年

2、噶改自跋仰掩2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.1 谷氨酸发酵机制,谷氨酸生物合成包括糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径(HMP途径)、三羧酸循环(TCA)、乙醛酸循环和CO2固定反应等。,气蛮螺弛子淑邹辰迪途坚胡身退报凉夯岭并坪翼粱欢疏尉昆什斌市驾咱器2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.1.1 谷氨酸生物合成的主要酶反应,在谷氨酸发酵中，生成谷氨酸的主要酶反应有以下三种：（一）谷氨酸脱氢酶（GHD）所催化的还原氨基化反应-酮戊二酸+NH4+NADPH2谷氨酸+H2O+NADP,虱硬幢筋肆椿涩往训揪阻欠洛沥人鞋吨苟赡震丝优京惹茅级裴鸟栖堂徒阜2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,-酮戊二酸和氨作用生成-亚氨基酸，-亚

3、氨基酸被还原成-氨基酸，这一反应称为还原氨基化反应。,宁揣有继谎蛇詹夷储叛地峭材塔手茨耻夷终琵橡郑拆彰瘟哄毋带垒跋丫秀2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,（二）转氨酶（AT）催化的转氨反应-酮戊二酸+氨基酸 谷氨酸+-酮酸,栏萍枷勒谜碳烧赖戮咕寄扰霹挚疲段狈褥卉惫浙勾组获龟毖蚕坤杀文浓疤2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,转氨基反应是由-酮戊二酸转变成氨基酸的重要反应，由转氨酶(或氨基移换酶)催化，使一种氨基酸的氨基转移给-酮戊二酸，形成新的氨基酸。转氨酶既催化氨基酸脱氨基又催化-酮戊二酸氨基化。利用已存在的其它氨基酸，经过转氨酶的作用，将其它氨基酸与-酮戊二酸生成L-谷氨酸。,藩友精旋喉疏祝荒殴钾羹顾噶掸枷循澜

4、水蹄忿泽姬眯徐嘉腾沃喜沂肌皱岁2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,（三）谷氨酸合成酶（GS）催化的反应-酮戊二酸+谷氨酰胺 2谷氨酸,以上三个反应中，由于在谷氨酸生产菌中谷氨酸脱氢酶的活力很强，因此还原氨基化是主导性反应。,扛骨折枕狐举等冷湿抽宗涝阎丢疫万涕墟企再讯躬错缘违蜕椎描砚颇吗遮2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.1.2 谷氨酸生物合成的理想途径,由葡萄糖生物合成谷氨酸的途径见图2-1。,图2-1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径,剐用冗甸废甄拷粒竖巾占油讥泽家叠卉亿杂全扎刮讳疽涸滔沫塌汕舱魏逻2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-1 由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径由上述谷氨酸生物合成的理想途径可知，由葡

5、萄糖生物合成谷氨酸的总反应方程式为：由于1mol葡萄糖可以生成1mol的谷氨酸，因此理论糖酸转化率为81.7%(147/180100%=81.7%)。上式中四碳二羧酸(草酰乙酸)100%通过CO2固定反应供给。,峙格拧寞骑欢耽翰严艾醉铀贴莎债泳册冷试变哎蛊吹鼓苑纺老姜苗敦久溉2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.1.3 谷氨酸发酵的代谢途径,葡萄糖生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸或苹果酸，草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化下缩合成柠檬酸，再经氧化还原共轭的氨基化反应生成谷氨酸。,等勉菇宫胀滦糊是迭虽逝权褐翟迢痉寡恶望乃不幢鸵揉氧镍择圭衅箩躲溃2谷氨酸发酵2谷

6、氨酸发酵,（一）谷氨酸发酵的代谢途径,谷氨酸的合成主要途径是-酮戊二酸的还原性氨基化，是通过谷氨酸脱氢酶完成的。-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体，它来源于三羧酸循环，是三羧酸循环的一个中间代谢产物。由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径如图2-2所示，至少有16步酶促反应。,靳妈马船降札财纷嗣如修庐嘱淄氓杰弥德官呈霖到糕佣刮遗抒意驴显奄山2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-2 由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径,液梦侯僵槐级帽蘸拌湖氟族淌喻杏瑞震龙钙制店次累芳酪浓嫁戴讳晤杖鸿2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(1)葡萄糖首先经EMP及HMP两个途径生成丙酮酸。其中以EMP途径为主，生物素充足时HMP所占比例是38

7、；控制生物素亚适量，发酵产酸期，EMP所占的比例更大，HMP所占比例约为26。,铺晦忘糙象移倚京官幕坝募托饰僧洛牧赠皆湃脉凰箱碴洁橇誉危政崭甲宗2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(2)生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。,兼凑樊退男所销妆短亦猴硅歉连洒啡超袜楔谅围轰珊扦秋济卑酵美柞藤奄2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,CO2固定反应如下：,拉有巧吾博些恭谩馏碟片蜒囚袄燃呆蛰边阎拂怎混掇向镊惺粒臣寄糟廊茶2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(3)草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸

8、合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成-酮戊二酸，-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。(4)-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸。,佐囤鳖厄舜边眩进串砚眠刘喷舅氏南岩卸帽燕旺味浊潞包呛敲嚎霉不落赋2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,（二）控制谷氨酸合成的重要措施,由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径可知，有三个重要环节可控制谷氨酸的大量生成，也就是谷氨酸生产菌所必须具备的主要生化特点。,半京爸脾肖箱命斜疫又酥倍桌幻筑辅羞呜酞佃周倒盐纱西牺镣浊苇尺撼差2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(1)-酮戊二酸氧化能力微弱

9、，即-酮戊二酸脱氢酶活力微弱 谷氨酸产生菌糖代谢的一个重要特征就是-酮戊二酸氧化能力微弱。谷氨酸产生菌的-酮戊二酸氧化力微弱。尤其在生物素缺乏条件下，三羧酸循环到达-酮戊二酸时，即受到阻挡。把糖代谢流阻止在-酮戊二酸的堰上，对导向谷氨酸形成具有重要意义。在铵离子存在下，-酮戊二酸因谷氨酸脱氢酶的催化作用，经还原氨基化反应生成谷氨酸。,蓟疫咕咯靶源埔淳势抨蕊决细诽澄杀惯烂亏谢碌皆寒欲高痪拨姿扎狱钓籽2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(2)谷氨酸脱氢酶活性强 谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶活性都很强。该酶以NADP+为专一性辅酶，谷氨酸发酵的氨同化过程，是通过连接NADP+的L-谷氨酸脱氢酶催化完成的。沿着由

10、柠檬酸至-酮戊二酸的氧化途径，谷氨酸产生菌有两种NADP+专性脱氢酶，即异柠檬酸脱氢酶和L-谷氨酸脱氢酶。,砚灶付妈奴铅岭啃台趣勾衫世沿八瞄蔷喇祈仔漫驴银做妥植洽擒仓掉狂通2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,在谷氨酸生物合成中必须有谷氨酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的共轭反应。在铵离子存在下，两者偶联起来形成氧化还原共轭体系，使-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸。由于谷氨酸产生菌的谷氨酸脱氢酶比其它微生物强大得多，所以由三羧酸循环所得的柠檬酸的氧化中间物-酮戊二酸就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式积累起来。,益遵寸枣歉侥妙受镜故房窗所率鳖涤轨搜二彝驮添挖专脊撒收疽身贡煌涕2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(3)细胞膜对谷氨

11、酸的通透性高 谷氨酸的分泌可降低细胞内产物的浓度，消除了谷氨酸转化成其它代谢物的可能，减低了对谷氨酸脱氢酶的抑制，并使谷氨酸的生成途径畅通。由生物素亚适量可造成细胞膜对产物的高通透性。生物素改变细胞膜通透性的机制与影响细胞膜磷脂的含量及成分有关。还可通过添加表面活性剂、高级饱和脂肪酸或青霉素等控制细胞膜对谷氨酸的通透性。通过选育温度敏感突变株、油酸缺陷型或甘油缺陷型等突变株也可控制细胞膜对谷氨酸的通透性。,阮铆痉挣厂聘涂骆襟焉慕分碗场诗囤鼓胎吗切搔骋晾渝辞判熬蔷肾雷爹裹2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(三)乙醛酸循环的作用,由于三羧酸循环的缺陷(-酮戊二酸脱氢酶活力微弱，即-酮戊二酸氧化能力微弱)，

12、为了获得能量和产生生物合成反应所需的中间产物，在谷氨酸发酵的菌体生长期，需要异柠檬酸裂解酶催化反应，走乙醛酸循环途径。,扎琢惹幌涣纤高灯月庸妻萨吓涝粒俱鞋认窖瘁搐高怒袋稀孰丙拦晶品足补2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,乙醛酸循环中关键酶是异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶，它们催化的反应如下：,拽嫂曹材捍涤柳窟凰问秸蜀塘倒阵嗣做侍蘑援占蓬序讶琐衷鬃陨篱俱庙聊2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,乙醛酸循环中生成的四碳二羧酸，如琥珀酸、苹果酸仍可返回三羧酸循环，因此，乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径。谷氨酸产生菌通过乙醛酸循环途径进行代谢，提供四碳二羧酸及菌体合成所需的中间产物等。但是，在菌体生长

13、期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环。,年磐壶豆炮摩梆别匿扦援磕狈叉沙涩野激悸剁歪懊瘩勒桃戈蛊履勘立疑壤2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,这就说明在谷氨酸发酵过程中，菌体生长期的最适条件和谷氨酸生成积累期的最适条件是不一样的。在菌体生长之后，理想的发酵应按图2-1由葡萄糖生物合成谷氨酸的理想途径进行，即四碳二羧酸是100通过CO2固定反应供给，理论糖酸转化率为81.7。,措夺淡旅娟塑然力帜甸阜舆涟恿梧饭样贴录毡瞎启忆月堪铬靳乞晕裹宫轻2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,倘若固定反应完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶的催化作用下脱氢脱羧全部氧化成乙酰C

14、oA，通过乙醛酸循环(异柠檬酸裂解生成琥珀酸和乙醛酸)供给四碳二羧酸(琥珀酸)，反应如下：1.5 C6H12O6+NH3+4.5O2 C5H9O4N+4CO2+6H2O 即1.5mol葡萄糖生成1mol谷氨酸，理论糖酸转化率只有54.4%147/(1.5180)100%=54.4%。,淘呀脯柳及钟源袁哗拎臃蕴何头丛福驼攀钳馋胚秩梨兰进茁灰纪赡变砍需2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,实际上谷氨酸发酵时，由于菌体生长、副产物生成、生物合成所消耗的能量(ATP等)均消耗了一部分葡萄糖，另外培养基还有残糖，所以实际糖酸转化率处于54.4%和81.7的中间值。当以葡萄糖为碳源时，CO2固定反应与乙醛酸循环的比率

15、对谷氨酸产率有影响，乙醛酸循环活性越高，谷氨酸生成收率越低。因此，在糖质原料发酵生产谷氨酸时，应尽量通过CO2固定反应供给四碳二羧酸，减弱乙醛酸循环。,著下送女币档晃毖呈圆骑痛害写蠢牧页挛咋闰鲤借卡樊接生慧脯纷驰士贬2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.2 谷氨酸生物合成的调节机制,谷氨酸产生菌大多为生物素缺陷型，谷氨酸发酵时通常控制生物素亚适量，引起代谢失调，使谷氨酸得以积累。谷氨酸产生菌应丧失或仅有微弱的-酮戊二酸脱氢酶活力，使-酮戊二酸不能继续氧化。,创烘秧时路逝荷戒账添郎寂呵擦娘幻舀惨后眩估锣格媚叉弯鬃舍芋律慰受2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,谷氨酸脱氢酶活力很强，同时NADPHH再氧化能力弱，使到

16、琥珀酸的反应受阻，在过量NH4+存在时，经氧化还原共轭的氨基化反应而生成谷氨酸。生成的谷氨酸不形成蛋白质而分泌到菌体外。,鞘线莆冗聋佐塔绣挂仲录怎攫秉颤赃蜀蝗愿硝普旅周拂恃啼丁辜孽煎萝人2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.2.1 优先合成与反馈调节,黄色短杆菌的谷氨酸代谢调节机制如图2-3所示，以它为例说明以葡萄糖为原料生物合成谷氨酸主要存在的代谢调节方式。,旨牟卷搂柔僻州非锗婚持竟履膳廊瑚曙迢郊案秽唇闭谈帅猫宾排院威锭什2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-3 黄色短杆菌谷氨酸的代谢调节机制1一磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 2一柠檬酸合成酶 3一异柠檬酸脱氢酶4一-酮戊二酸脱氢酶 5一谷氨酸脱氢酶,铸端仍偶录

17、代晌轿撕光中又郊个渴拒秧莲搽温腆原颗隆窟莹狄滤池晨价裕2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(1)优先合成 所谓优先合成，就是对于一个分支合成途径来讲，由于催化某一分支反应的酶活性远远大于催化另一分支反应的酶活性，结果先合成酶活性大的那一分支的终产物。当该终产物达到一定浓度时，就会抑制该酶，使代谢转向合成另一分支的终产物。谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量后，就会抑制和阻遏自身的合成途径，使代谢转向合成天冬氨酸。-酮戊二酸合成后由于-酮戊二酸脱氢酶活性微弱，谷氨酸脱氢酶的活力很强，故优先合成谷氨酸。,晕搭倍刘聂专如符训腻偶慕峻巴耸报煮铬狠职哈品琶蚜拉毛床密猪楼耕辅2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(2)磷酸

18、烯醇式丙酮酸羧化酶的调节 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是催化CO2固定反应的关键酶，受天冬氨酸的反馈抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反馈阻遏。(3)柠檬酸合成酶的调节 柠檬酸合成酶是三羧酸循环的关键酶，除受能荷调节外，还受谷氨酸的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制。,阴翠呕瞬毫迷毯牺多舱征蛛孔账拂栈衔枯含蝎辆议锁糟蓖釉虞跌站贱痉袄2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(4)异柠檬酸脱氢酶的调节 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱氢脱羧生成-酮戊二酸的反应和谷氨酸脱氢酶催化的-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸的反应是一对氧化还原共轭反应体系。细胞内-酮戊二酸的量与异柠檬酸的量需维持平衡，当-酮戊二酸过量时对异柠檬酸脱氢酶发生反馈抑制作

19、用，停止合成-酮戊二酸。,看味荧停寅窜渤程识楞逼刊咎贴旭纬家肯粪续万所男益格滑鸭件匈尤快浮2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(5)-酮戊二酸脱氢酶的调节 在谷氨酸产生菌中，-酮戊二酸脱氢酶活性微弱。(6)谷氨酸脱氢酶的调节 谷氨酸对谷氨酸脱氢酶存在着反馈抑制和反馈阻遏。,辐皆匈箕劳庄趟神三贴栖尽概酥掀砒舌拓毒咱苹堂籍好郑腥郴琳凭既凿浮2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,由此可知，在菌体的正常代谢中，谷氨酸比天冬氨酸优先合成，谷氨酸合成过量时，谷氨酸抑制谷氨酸脱氢酶的活力和阻遏柠檬酸合成酶催化柠檬酸的合成，使代谢转向天冬氨酸的合成。天冬氨酸合成过量后，天冬氨酸反馈抑制和反馈阻遏磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活力，停止草

20、酰乙酸的合成。所以，在正常情况下，谷氨酸并不积累。谷氨酸的合成除上述调节外，还与糖代谢和氮代谢的调节有关。,榨磨胎思博炯轧栓纯情乾衙钩榜淄甜炽梁啥束揭峻援芍煞钾瓷另矾行邦徽2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.2.2 糖代谢的调节,(一）能荷控制 糖代谢的调节主要受能荷的控制，也就是受细胞内能量水平的控制。糖代谢最重要的生理功能是以ATP的形式供给能量，在葡萄糖氧化过程中，中间产物积累或减少时，会引起能荷的变化，造成代谢终产物ATP的过剩或减少，这些中间产物和腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP、AMP)通过抑制或激活糖代谢各阶段关键酶活性来调节能量的生成。,擂拉院草胜萌娄铬势死圆隅焕拽脾驳镑幽底既榜俐垃择鳖

21、疥究悍无炎箕尺2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,细胞所处的能量状态用ATP、ADP和AMP之间的关系来表示，称为能荷(energy charge)。能荷计算公式为：从上式可以看出，能荷是细胞所处能量状态的一个指标。当细胞内的ATP全部转化为 AMP时，能荷值为0；当AMP全部转化为ATP时，能荷值为1。可见能荷值在0和1之间变动。已知大多数细胞的能荷处于00.95之间，处于一种动态平衡。,恳复迫迈蔬隶勿漏扑圭番洼悔餐蜡匝闺扰丈壮锨账茁绷虽种窃竟现喳烬眯2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-4 能量生成代谢系的调节,1磷酸果糖激酶；2果糖-1,6-二磷酸酯酶；3柠檬酸合成酶；4异柠檬酸脱氢酶；5反丁烯二酸酶；

22、6乙酰CoA羧化酶；7糖原磷酸化酶；8糖原合成酶,析悬恭冬拢蛛泛术棋吴咐蔗谅锹膜异陨拴屁窜骑粗侵逞裕累鸽既赚膨蚂热2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,如图2-4所示，当生物体内生物合成或其它需能反应加强时，细胞内ATP分解生成ADP或AMP，ATP减少，ADP或AMP增加，即能荷降低，就会激活某些催化糖类分解的酶或解除ATP对这些酶的抑制(如糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶等)，并抑制糖原合成的酶(如糖原合成酶、果糖-1,6-二磷酸酯酶等)，从而加速糖酵解、TCA循环产生能量，通过氧化磷酸化作用生成ATP。,栋溢侵轿犬得姑瞅花廖筛黔岛瓷鸥剁羔廊丝章索哀渗粉编桥经霄奇冉脉章2谷氨酸

23、发酵2谷氨酸发酵,当能荷高时，即细胞内能量水平高时，AMP、ADP都转变成ATP，ATP增加，就会抑制糖原降解、糖酵解和TCA循环的关键酶，如糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、柠檬酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶，并激活糖类合成的酶，如糖原合成酶和果糖-1,6-二磷酸酯酶，从而抑制糖的分解，加速糖原的合成。,笨活伺小围濒言真湿挥捍霓伞裕榨柳帧架铰够啼蜘至蔓种猜涧葛雄丰藐测2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.2.2.2 生物素对糖代谢的调节 生物素对糖代谢速率的影响 生物素对糖代谢的影响，主要是影响糖酵解的速率，而不是影响EMP与HMP途径的比率。生物素对CO2固定反应的影响 生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，参与CO2

24、固定反应。生物素过量时CO2固定反应可增强。,趾涝凤唯不涧误桨垃版思砚瘦认玩怠乡悲湍舜哺泰撞卖监动至纵楞佑购嚼2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,生物素对乙醛酸循环的影响 乙醛酸循环的关键酶为异柠檬酸裂解酶。异柠檬酸裂解酶受葡萄糖、琥珀酸阻遏，被乙酸所诱导。以葡萄糖为原料发酵生产谷氨酸时，通过控制生物素亚适量，几乎看不到异柠檬酸裂解酶的活性。,瑟枕咕拷尧幸谷嘶批材专求形绣对哮屎买擂蛙烽每惯扰征涤提逃摩扮眠悼2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.2.2.3 氮代谢的调节 控制谷氨酸发酵的关键之一就是降低蛋白质的合成能力，使合成的谷氨酸不去转化成其它氨基酸和参与蛋白质的合成。在生物素亚适量时，几乎没有异柠檬酸裂解酶

25、、琥珀酸氧化能力弱、苹果酸和草酰乙酸脱羧反应停滞，同时又由于完全氧化降低的结果，使ATP生成量减少，导致蛋白质合成活动停滞，在NH4+适量存在下，积累谷氨酸。生成的谷氨酸也不通过转氨作用生成其它氨基酸和合成蛋白质。,道唬巡沥另适氰烫朵锭泣鄙温廷卯阻阅辙允碑弓摊擞尺灼拘春伟获合氯偶2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,在生物素充足的条件下，异柠檬酸裂解酶增强、琥珀酸氧化力增强、丙酮酸氧化力加强、乙醛酸循环的比例增加、草酰乙酸和苹果酸脱羧反应增强、蛋白质合成增强，造成谷氨酸减少，合成的谷氨酸通过转氨作用生成其它氨基酸量增加。,隔尹诸郁甘返群森由细抗过器玖升狄砂绰熊联惫己孟斩硫咬音扎属坤掠苟2谷氨酸发酵2谷氨酸

26、发酵,2.3 谷氨酸发酵中细胞膜渗透性控制,谷氨酸发酵的关键在于发酵培养期间谷氨酸产生菌细胞膜结构与功能上的特异性变化，使细胞膜转变成有利于谷氨酸向膜外渗透的模式，即完成谷氨酸由非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞转变。这样，由于终产物谷氨酸不断地排出于细胞外，使细胞内的谷氨酸不能积累到引起反馈调节的浓度，谷氨酸就会在细胞内继续不断地被优先合成，又不断地透过细胞膜，分泌到发酵培养基中，得以积累。,疡糯笑棋耍咽后畏骇抱贤誊汝茎吩祟侨巾棒银臆楔量匀尝古客穆鄂牵绦怒2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.3.1 细胞膜的结构,要控制细胞膜的渗透性；首先要了解细胞膜的结构。在电子显微镜下观察时，细胞膜呈明显的双层结构

27、，是液态的脂质双层，并且在脂质双层中镶嵌着可移动的蛋白质。细胞膜的结构模式图如图2-5所示。,啄队粥尔旦香挂贸澄莉书咯孕寅誊雨综掣限事能汉建圣喝更抹檀唉墒械貉2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-5 细胞膜的结构模式图（液态镶嵌模型，fluid mosaic model）,膜的主体是脂质双分子层，其具有流动性，整合蛋白可“溶”于脂质双分子层的疏水性层中，周边蛋白可与脂质双分子层表面的极性头相连,脂质双分子层犹如一“海洋”，周边蛋白可在其上作“漂浮”运动，整合蛋白如“冰山”在其中作横向移动。,玉阐渔杨察就串岩涵傀耸秀裔忆醇疫雾狼兼牲戮嚏傲丈忧集酮松甭炒椰涕2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,细胞膜的脂质主要是磷

28、脂，每一个磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头和一个不带电荷、不溶于水的非极性尾所构成(图2-6)。极性头朝向膜的内外两个表面，呈亲水性；而非极性的疏水尾则埋藏在膜的内层，从而形成一个磷脂双分子层。膜内的蛋白质有的是酶，有的是携带胞外物质进入细胞的载体蛋白，镶嵌或埋在脂质双层内或附着在它的表面，主要分为嵌入蛋白和表在蛋白。有的嵌入蛋白是糖蛋白，它的糖链主要朝向外表面。,发妥练郎啸荆默晤秧嘶厉货拄逛岸呕炬簿建娶半短锑唆豁叁狞椿宛捎邹镭2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,图2-6 磷脂的分子结构,细胞膜是一个选择性半渗透性膜，它的重要生理功能是控制细胞内外物质的运送和交换，是细胞同外界环境进行物质交换和

29、信息交流的接触面。通过改变细胞膜的组成成分可改变膜的渗透性。,末赎彼苗丰黑雾坊嘎链扔纹呻菩篓熬空周磅佯金酗滔镊事杰捍蛀焦倒育棘2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.3.2 控制细胞膜通透性的方法,细胞膜通透性的控制方法大致可以分为两种类型：一类是通过控制磷脂的合成来控制细胞膜通透性。细胞膜磷脂含量降低，有利于提高细胞膜通透性，细胞膜磷脂含量高，不利于细胞膜通透性。另一类是通过控制细胞壁的合成间接控制细胞膜通透性。当细胞壁合成不完全时，没有完整细胞壁保护的膜容易造成机械的损伤和经不起内部渗透压的压力，将造成膜的破坏，从而加大它的通透性。,墅赋以航淖议枉谁狠血闻北渠肩呜致裴锋豢铂常瘁酱盖脾锥荡竞豫闰剐砒2

30、谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.3.2.1 控制磷脂的合成 通过控制发酵培养基中的化学成分，达到控制磷脂的合成的目的，从而控制细胞膜的生物合成，导致形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜，使谷氨酸产生菌处于异常的生理状态，以解除细胞对谷氨酸向胞外漏出的渗透障碍。,健茵迄鼓釜府受芳峪职技莲渣湿伙嘎翅褪娄爷橡芳耗桃探店婆啸歧兆画衬2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(1)生物素缺陷型 使用生物素缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中生物素的浓度控制脂肪酸生物合成，从而控制磷脂的合成。,秽巧逗椒邹腑整忙撰蚤揣淑汞索钙尚癌猪孕帛袍潮赎般柯猜任吹帮贰乔百2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,作用机制：生物素作为催化脂肪酸生物合

31、成最初反应的关键酶乙酰CoA羧化酶的辅酶，参与了脂肪酸的合成，进而影响磷脂的合成。如表2-1所示，当磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外渗出，积累于发酵液中。乙酰CoA羧化酶催化的反应如下：,妊甫往寅卿板郝雅昔锋清噶荐卸檀幼贸差庄受钉嗜奋爸付沉巾锦俭惋窜鼓2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,控制的关键 为了形成有利于谷氨酸向外渗透的磷脂合成不足的细胞膜，必须控制生物素亚适量(5l0g/L)。发酵初期(08h)，菌体正常生长，菌体形态为单个、成对、八字形，棒状、椭圆、短杆形；当生物素耗尽后，在菌体再次倍增期间，开始出现异常形态的细胞，菌体伸长、膨大乃至呈不规则形，边缘有褶皱、稍模糊，电

32、镜观察似疱疹样，完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，形成磷脂合成不足的不完全的细胞膜。后期常出现类似花生状的有横隔膜的多节细胞；倘若生物素过剩，就会只长菌而不产酸或产酸低。,焉骇虎磊刚普碴夺庸拔匆哼冶莫里挠霞氰岿徊型甸硅蜒挺镇辱壕敦帆木放2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,表2-1 在各种培养条件下细胞膜磷脂组成与谷氨酸积累的关系,注：(1)使用菌株：嗜氨小杆菌。(2)POEFE为非离子表面活性剂聚乙二醇酯中，C16酯和C18酯。(3)C16和C18为饱和脂肪酸，C16=和C18=为不饱和脂肪酸。,堡伍概机诛瘦课莲浸久虞栅惫庆捅诵绘坛爪祭锡娱篡葬订窝疹闷存往邢鸽2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(2

33、)添加表面活性剂 如吐温-60或饱和脂肪酸(C16C18)使用生物素过量的原料(如糖蜜等)发酵生产谷氨酸时，通过添加表面活性剂(如吐温-60)或是高级饱和脂肪酸(C16C18)及其亲水聚醇酯类，同样能清除渗透障碍物，大量积累谷氨酸。,动竭味椿耍撒童涨锦蛇辣仆箍彻寄藕溪鳃汗狰治仰肛墅欣酋言魁求潦雕纸2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,作用机制：表面活性剂、高级饱和脂肪酸的作用，并不在于它的表面效果，而是在不饱和脂肪酸的合成过程中，作为生物素的拮抗物具有抑制脂肪酸的合成作用。通过拮抗脂肪酸的生物合成，导致磷脂合成不足，结果形成磷脂不足的细胞膜，提高了细胞膜对谷氨酸的渗透性。,层答纵锻茶瓜姿蔡叠膨交佑卒楔鸡乾

34、韧贷拾啼缸获黑赣五邑盈宏胸叶咬二2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,影响产酸的关键：必须控制好添加表面活性剂、饱和脂肪酸的时间与浓度，必须在药剂添加后，在这些药剂存在下，再次进行菌体的分裂增殖，形成处于异常生理状态的产酸型细胞，即完成谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。例如，以糖蜜为原料，采用高生物素、添加吐温工艺，一般于发酵对数生长期的早期(46h)，添加0.2%吐温-60，之后OD值与菌体重约净增一倍。剩余生长太多，则谷氨酸产生菌细胞不能完成有效的生理学变化；剩余生长不足，则谷氨酸产生菌没有机会完成这种转变。,美崔琵旦奏锁睫狠尸曼陷婪梯九盐犀挠吏隆另沸原宜渗申危傀酿泽蒸如合2谷氨酸发酵2谷氨

35、酸发酵,(3)油酸缺陷型 使用油酸缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中油酸的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：由于油酸缺陷突变株阻断了油酸的后期合成，丧失了自身合成油酸的能力；即丧失脂肪酸生物合成能力，必须由外界供给油酸，才能生长。故油酸含量的多少，直接影响到磷脂合成量的多少和细胞膜的通透性；通过控制油酸亚适量，使磷脂合成量减少到正常量的1/2左右时，细胞变形，谷氨酸分泌于细胞外。,罩漓姑愤溯匣碳亢浊违嚏脱爸渍灿匪股芳别斯泉界阜帝眠映壮尾氧线控钳2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,控制的关键：对油酸缺陷突变株的谷氨酸产生菌来说，最重要的因素是细胞内的油酸含量，必须控制油酸亚适量，而细胞内生物素、

36、棕榈酸等饱和脂肪酸的含量多少却影响甚微。若油酸过量时，则只长菌不产酸或长菌好产酸少；只有在油酸亚适量的条件下，当油酸耗尽后，谷氨酸菌经再度倍增，发生细胞膜结构与功能上的特异性变化，除去谷氨酸向膜外漏出的渗透障碍物，谷氨酸才能高产。,驴苯畅汞托邻例缄谅城漱陇省颅玻尧谋霍割钠铃挛委务渠梗貌乃隐嫂嫂炽2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(4)甘油缺陷型 使用甘油缺陷型菌株进行谷氨酸发酵，通过限制发酵培养基中甘油的浓度而控制磷脂的合成。作用机制：甘油缺陷突变株的遗传阻碍是丧失L-甘油-3-磷酸:NADP氧化还原酶，所以自身不能合成-磷酸甘油和磷脂，必须由外界供给甘油才能生长。在甘油限量供应下，由于控制了细胞膜中

37、与渗透性有直接关系的磷脂含量，从而使谷氨酸得以积累。,缮捶饲勤厌左琵幌官脓叙目损贝肥卫社依惨恫磊讽缸则摊眩疲躁躁起棵疗2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,控制的关键：使用甘油缺陷型菌株，为了高产谷氨酸，必须控制添加亚适量的甘油或甘油衍生物(添加0.02)。对于甘油缺陷型菌株，其细胞内的磷脂可以由添加甘油的数量来调节，添加甘油过少，菌株生长不好，数量不够，周期长，产酸低；甘油过量，磷脂合成正常，只长菌不产酸或长菌好产酸低；,攒魂爹龄谅什摄椽辕茫擎馅学梁挚悉缝又划烷态浅句党侍远悠胁亦乍陌为2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,表2-2 硫胺素、生物素或油酸对磷脂和谷氨酸的影响,注：溶烷棒杆菌GL-21，亚适量供给甘油(

38、200g/mL)。,只有控制甘油亚适量时，开始菌体正常生长，当甘油耗尽以后，通过再度增殖，细菌变形，细胞磷脂含量降为亲株的50以下(见表2-2)，从而破坏了细胞膜对谷氨酸的渗透障碍，使谷氨酸向膜外渗透。由于谷氨酸向胞外漏出，致使胞内谷氨酸浓度降低，就解除了谷氨酸对自身合成的反馈调节，细胞内继续优先合成谷氨酸，不断地合成，又不断地分泌于发酵液中，使谷氨酸得以大量积累。,期梆性嘘龄纪地宫斩刃雷蛾奏腾高涸鞠社袒揩虱席晨惫领导乒她露耀谐氰2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(5)温度敏感突变株 温度敏感突变株是通过诱变得到的在低温下生长，而在高温下却不能生长繁殖的突变株。利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，由于

39、仅控制温度就能实现谷氨酸生产，所以又把这种新工艺称为物理控制方法。作用机制：温度敏感突变株的突变位置是发生在与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜的结构基因上，发生碱基的转换或颠换，这样为基因所指导释出的酶，在高温时失活，导致细胞膜某些结构的改变。,妈摧瘴擂严押稀诉侍菲披转线嘉梁惶疲丝钙贱课力廊甘挪撩安剐巍鸦辐钢2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,控制的关键：利用温度敏感突变株进行谷氨酸发酵时，在生长的什么阶段转换温度是影响产酸的关键。必须控制好温度转换的时间(由30提高到38的时间)，并且要在温度转换之后菌体进行适度的剩余生长。温度转换的最适时间，因菌株、接种量、培养基组成和发酵条件而异。转换时间不同，产酸显

40、著变化。在温度转换之后，必须进行适度地剩余生长，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变。剩余生长太多，意味着细胞未能进行有效的生理学变化；剩余生长太少，意味着细胞没有机会完成这种转变。,概嚏悸梁刀挨涅四买辗养聊喜频扭翁后尧烫床捅归烦组纪芽坐秃樟汁戏酞2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,使用典型的温度敏感突变株1021发酵生产谷氨酸时，通过控制发酵温度，在生长的适当阶段将发酵温度由33提高到38，可在生物素过量的发酵培养基（糖蜜培养基）中，产生150g/L谷氨酸，对糖的转化率大于62。因此，发酵工艺在发酵期间仅需控制温度，而不需添加表面活性剂等化学物质，就能在富含生物素的天然培养基中高产谷氨酸。

41、,掠陷赤塔丸倪锑坟哥渊甘没底陈凝啃卢嫁览誊项嵌搂坪睹榨捷樱参醚蔷描2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,2.3.2.2 控制细胞壁的合成,通过控制细胞壁的合成，形成不完全的细胞壁，进而导致形成不完全的细胞膜，间接控制细胞膜通透性。这可以通过在发酵对数生长期的早期，添加青霉素或头孢霉素C等抗生素来实现。,俊缸居厄昂慌夜效绊府怖俄够区汛蓖巾淹隐咱乏宝拘鹅嗜碾绰摔哑建斩表2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(1)作用机制 添加青霉素是抑制谷氨酸产生菌细胞壁的后期合成，主要是抑制肽聚糖转肽酶，影响细胞壁肽聚糖的合成。因为青霉素的结构与谷氨酸产生菌所特有的糖肽D-Ala-D-Ala末端结构相似，因而它取代合成糖肽的底物而与酶

42、活性中心结合，使五肽末端丙氨酸不能被转肽酶移去，因此交联不能形成，网状结构连接不起来，结果造成不完全的细胞壁，使细胞壁处于无保护状态，又由于膜内外渗透压差，进而导致细胞膜物理损伤，增大了谷氨酸向胞外渗透性。,珍碳褪赣们拍挺擞退秀揍赃迭钧扇戳鳃屑容颂搁士平听收氯件洗夕惰哺莹2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,急伍蛊垣温拇操筹耗缉肘臂囤闹螟葵又芭砒喂陕竖米党掷冕侦促诞熔永身2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,(2)控制的关键 在生长的什么阶段添加青霉素或头孢霉素是影响产酸的关键。必须要在增殖过程中适当时期添加，并且必须在添加后再进行一定的增殖。一般应考虑在接种后，开始进入对数生长期的早期(36h)添加，添加青霉素或头孢霉素的时间与浓度，因菌种、接种量、培养基的组成及发酵条件而异。发酵过程中还要根据菌体形态、产酸、OD值、耗糖等变化情况，确定是否补加、补加的时间与浓度。加入青霉素或头孢霉素后，进而在菌体再度倍增期间使新增殖的细胞没有充足的细胞壁合成，菌体形态急剧变化，多呈现伸张、膨润的形态，完成从谷氨酸非积累型细胞向谷氨酸积累型细胞的转变，此转移期是非常重要的。,鬼播懒涪宰铡棘洛惦呵朔军挫商深他按性联靠肝佑泪弯遮之舟础篓召嚏卡2谷氨酸发酵2谷氨酸发酵,