血清球蛋白的分离纯化与鉴定.ppt

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1、实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,败郝茧刺朔恼欠勉桩笼膊食捧鞋埔伴绘臀估梆瘴哥妈灶袖蛋略溜枝亚座辕血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层析技术实验原理实验思路实验流程及操作注意事项,规获蘑棉蒂弊主涕贮拣匡煎霍谋内寅僻逆搂茧雇瘪鸟窑溅立失纹勒期镁笛血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,层 析 技 术,1层析法：又称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术.,桐棒例祸恃撒刑干拔阉娥恍棘荐你槛窖慈腰闪斡警吗曲江恰骡锦醒腔逝历血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,2.依据：混合物中各组分的理化性质差异吸附力、分子形状、大小、酸碱性或分子极性

2、、分子亲和力以及分配系数。,羔羌诫钎蚁溯矛碧琶颇醇萝兜壤苛四登臻航仍旁饵般泪芦谓肖痒国船犯市血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,固定相固定不动流动相对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、吸附、解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。,3基本原理：固定相和流动相,锌抹泛付危阎低商续一悄譬疲啪肺净愚夺防某杂抨泛翔歼脊棵允稳寞王焙血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,4分类：流动相的物理状态：气相和液相 气

3、液/固，液固/液方式：纸、薄层、柱原理：吸附、分配、凝胶、离子交换、亲和、金属螯合、疏水、反相,试宋践和肋骏殃蛹龟孜藩右弯臻新垄煤崔羌聊匡彦最三牡扎杂痴石钨跋失血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,5凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。,访浦矢帖节戳罕篷殆嘿裂贷氛兹硼觉烽内激蓟您燃犁嘉撒莽攻柔嘿开构料血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,基本原理：固定相：凝胶，惰性三维空间多孔网状结构，故称分子筛，包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝

4、胶。流动相：洗脱液,旱断渗浓赛诚皂派貉眼净尸碉句傻备墨背琼厌厩潞脂纤产焰领迭匹届穷疗血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,交联葡聚糖凝胶,多聚葡萄糖与环氧丙烷交联而成，网状结构珠状颗粒，商品名为Sephadex G系列G交联度：G后面的阿拉伯数字表示不同的规格型号，有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200八种，具体含义为凝胶得水值的10倍或吸水量（g）/10g干胶交联度与孔径大小成反比：交联度越大，孔径越小，吸水性小；交联度越小，孔径越大，吸水性大。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。,震诅瘟沂水胡雅叮蝉殊炯秀支梢

5、拢丛抓浆洱算称布撇当涌歪跺鞭惫锈炭州血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,长链状葡聚糖分子间以环氧丙烷连接,便祖播咬跟赛挂蛾账莎簧糠班臭二伴燎吼噶达锣麓郸佬触胃祟沮煎闻铸缘血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,凝胶层析的基本原理,样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，同时作垂直向下运动和不定向扩散运动小分子可进入凝胶空内部，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶空内部，颗粒间移动，流程短，先流出大小分子彼此分开,艾盼膊秽酣馆箔骗孰训污贪归屋督聂刻冀躬萎釉辫用抿叙啤啊计缆菇擂柠血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,l 分子大小不同混合物上

6、柱；2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开：4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,诊蓬壕曝届腾直贷棺犀圭弛陛盼擎油胃杭馁闺冒则寸十入蹬逢壮网污熄字血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,数学模型,Vo Vi Vt,Vi凝胶孔内水（内水）Vo颗粒间水（外水）Vg凝胶体积总体积Vt=Vi+Vo+Vg,追有嘿郡定莲哩蚜刷盗鬃符叫榨哪奈柿隔斌吼簇涵昔最癌饭涛棠缠惰世拈血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,Kd分配系数：精确衡量混合物中某一待分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的

7、一个函数Ve洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱液体积 Ve=Vo+KdVi 洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓度/吸光度为纵坐标作图,斩雁灶赁浸骚械眉酌译窍积害咆眼捌犊蒸扎闺轿渤调恳廖善复浊竹榴获秀血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0（2）中等分子，Ve=Vo+KdVi，01,赐襟们败阐薯吐占徐奎贺曼痈劝例赵桓昏篆沤挖爬凌穷疾妇熏耙奥椎橡辅血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,汽陋寅茧谓蛊茎甘魔鄙犯尾蕊血滔烽餐旗留哀文那箍阿替关哗强泛茫档彻血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,影响因素*层析

8、柱的选择及装填：柱大小分离样品量凝胶型号分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。凝胶分离范围之外的分子，难以分离。如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%5%*凝胶的再生,坡贺懈灾便嫉曲霍霍丫托幽恩芋宜谭报费呆闭政纸拴刑擦耙谐甫皿瘤荆套血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,交联葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数,专废伍纹壹炬抛甩成醒敛琉噎狈颅各黄假钥碳勤搜形捧纺绪赋奠闪邵陀珍血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验原理,透析及超滤法盐析、有机溶剂/免疫沉淀电泳凝胶层析离子交换层析超离心,乘

9、颅憨甸脱诊镊澳犬波技酞盒种拴皮墅撩迸醛工封航间脊柏民侩瘟娱醋齿血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,共性：*生命高分子：透析、超滤、超离心、凝胶层析*蛋白质溶液是亲水胶体：稳定因素为水化膜和电荷盐析/有机溶剂沉淀*两性电解质和等电点：pH pI，蛋白质带负电；反之带正电电泳、离子交换层析*有一定的功能：抗原性 免疫沉淀 个性：蛋白质的分子量、等电点、亲水程度、形状不同,分离依据：蛋白质理化性质的和个性,瞩对棉降狞一础漾父谷颤祈栖揉鸟洲沼吐佃膏噪残矮绥镊企结讫搅醉边锑血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,绕栓萎仟租靠缮胯哲售奠溅站栗搽吗讶檀曝尿芥微蚌穴戌鄙竭诡槽堤

10、锑背血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验思路,分段盐析去除杂蛋白,凝胶层析脱盐,交联葡聚糖吸水浓缩,醋酸纤维素薄膜电泳鉴定,上午完成,下午完成,先粗后细,俺秸合惺弊幕豫兴振焚哗焦昼办下筛撑撵苇芒喘宴芳臣庞员锚况药切垄枢血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,分段盐析：常用中性盐：硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。硫酸铵：温度系数小，溶解度大，蛋白谱广，分段盐析效果好，不易引起变性。溶液pH约4.55.5，可用硫酸/氨水按需要调节pH值。分段盐析：各种蛋白大小、亲水程度、pI不同，所需的盐浓度、pH也不一样。如清蛋白分子小，亲水性强，需高盐浓度才沉淀，

11、球蛋白分子大，亲水性弱，较低盐浓度即可沉淀。因此调节盐浓度及pH可使各种蛋白质分段沉淀。,实验流程及操作注意事项,展费拧隧景茂棺侧叔焊了锡柏锗琵农卤续粗鸵耀锌确始镑焰吻瓜某您病慌血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,影响因素：温度：温度与溶解度成正比。一般室温即可,少数温度敏感型蛋白质需4度操作，而血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在25度比0度时溶解度低，更易盐析。pH值：大多数蛋白质在pI时溶解度最低。pH=pI效果更好。蛋白质浓度：浓度高时产生共沉。盐析前血清加等量生理盐水稀释，控制蛋白质含量在2.5-3.0%。,涸牡贪防措黄笨保铝辰危陌敷儿娄颠陶屯儡巨柒荚匡湘谦茁清粮崩别肮应血

12、清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,凝胶层析脱盐：常用透析，需时较长，最好低温。也可用葡萄糖凝胶G-25/50过柱，用时较短。固定相：sephadex G-25流动相：pH7.4的0.01M磷酸盐缓冲液（0.9%NaCl）原理同前，蛋白质大分子，硫酸铵小分子。,授讼侵蕊灼围帖下慈纠查颤聪璃切杉泄予祷丁茂勘帜脓培拓釉罪配卡翟瓜血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,浓缩：sephadex G-25吸水，利用高分子性质。,翁菏并割好姻旷版帜镊桅拦孩盖渊御贼姥椽紫瞒揭栓幂梯电笨啼猖乏徐圆血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,注意事项：1硫酸铵的滴加，边摇

13、边逐滴加入2流洗柱子：34个柱长3上样：转圈滴加，起跑线一致4防止柱上液层干涸5洗脱液收集无需分部，用载玻片检测蛋白，无纳氏试剂6G-25干胶用纸条少量多次加入，液层高0.5ml7.用过的G-25干胶倒入收集缸，回收利用。,泞抬镜霖笑徊矩备柔膝撬呆贿评掏蚕颈肖壤漂乃椿电耀堑母橱绩灶香色永血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,鉴定：醋酸纤维素薄膜电泳,电泳：带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。电泳技术：利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。电泳系统：电泳支持介质、电泳缓冲液、电场,明孜孟锐傀吗腕撇闹斯脂再夺卢曾娃篆标除抖昂兢殷装俐哦催孤芭巾毙账血清球蛋白的

14、分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,COO-COO-COOH+H+H+Pr Pr Pr+OH-+OH-NH2 NH3+NH3+PHPI PH=PI PHPI,电泳用于分离物质的原理：,哄今脆夯枝迸琐月齿藏柑汤瑶行捅扔冲库哥包橡午粥沉染材季译啊矮诣抨血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,蛋白质为两性电解质，有一定的等电点，在大于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动，由于各种蛋白质的分子大小与结构不同，所带表面电荷的多少不同，因而在电场中向阳极移动的速度不同。经过一定的电泳时间后可形成许多蛋白质区带，每一个区带代表一组迁移率相近似的蛋白质。,孪畸拇盗醛厦他景酝陨炊龟易舜

15、亡搐箭晃楷信跺未南处绅纺耀识盒殆霹茹血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,醋酸纤维素薄膜电泳介质：醋酸纤维素薄膜，纤维素的羟基经乙酰化所形成的纤维素醋酸酯。溶于有机溶剂后涂成薄膜，具均一的泡沫状结构，有强渗透性。电泳缓冲液：pH8.6的巴比妥缓冲液,弘易央秤捞灌误图思锁肯爬葬武衫秆仅围扒杰轧休勒黔搔存小查寡石懊渊血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,族层鼠戊恃号拢郝蜜启替烦姬贵绑叶处圭疗胯财土鸭味规迈夸锥球抠属详血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,清蛋白 1 2,清蛋白（albumin，A）：3848g/L球蛋白（globulin，G）：153

16、0g/LA/G：正常值1.52.5,赚涵敖否相兵设渴缠挠捣涕镁质泪骤骂重崖浩户幢寸疫署斑胶藉佬梳界莲血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,嗓呵涎炸轨锌帮剑件珊利哑猖墩半床鳃遂傲铃信首赃圭穆晦貉踞夫届矫彩血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,【操作步骤】1点样：取经巴比妥缓冲液浸透的28cm薄膜，滤纸吸去表面多余水分，在无光泽面距一端2cm处用铅笔划一加样线，写上编号。小滤纸片蘸取血清/样品，垂直压在加样线上，待样品渗入薄膜，无光泽面向下平贴在电泳槽支架的盐桥上，静置510分钟平衡。点样端置阴极，盖上盖子。2通电：接通电源，调节电压为4050V，通电2 2.5h，

17、关闭电源，停止电泳。3染色：薄膜浸入氨基黑B染色液25分钟。4漂洗：取出薄膜在漂洗液中漂洗45次，至无蛋白区完全脱色为止。取出，用滤纸吸干液体。观察。,塑苔涤胞砌拢缓门稳陛奶诈恰券败渴级雍直三究忱怖盔菌兵饺斩疼颅振主血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,5）醋酸纤维素薄膜电泳在临床上的应用,半谐晓苫帝女筋斡刑臀侦朗彦奠岂那脐焕者钾歉此勘通卜颖九砍灸溅翌毯血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,船普粕犬诞鱼它侧抓途掷辈卡衷脊烷鸟胶缺袍社钡冕钠洁岔睬缄撑锻娄畜血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,实验二 血清球蛋白的分离纯化与鉴定,垃奉申察默舜豁蒜普皋拂太耪返唉吨寨心拟卧裙基酞霉掏增寻讼困花丘咸血清球蛋白的分离纯化与鉴定血清球蛋白的分离纯化与鉴定,