氨基酸组成分析.ppt
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1、第三章 氨基酸组成分析,氨基酸是一种小分子的两性化合物,分子质量在75200Da之间,其化学通式为R-CH(NH2)-COOH,在生物体内出现的氨基酸都是L型,仅在少数微生物来源的多肽中出现D型氨基酸。氨基酸分析技术的发展始于1820年,由Braconnot最早将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来,但直到21世纪,用化学方法或微生物方法测定氨基酸,仍是一项持续数周或数月的繁琐的工作。色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。1941年,Martin等运用色层法分析氨基酸,主要采用乙酰化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量;随后,Moore、Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸,在1958年,
2、Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析仪,使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段,至今仍是经典的方法。,第一节 氨基酸组成分析的目的,现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化,但也给定量带来了困难,一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白质酶解或测序前,取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分析,根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。另外,在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况,一种可能是蛋白质的N端封闭,另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质物质,解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品的成分。除了
3、蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外,医学上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。,第二节 蛋白质的水解方法,氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解,常规方法是采用5.7mol/L盐酸在真空状况下于110水解24h,也有在150下快速水解90min。Waters公司有商品化仪器(水解工作台)出售。将100500mol的蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干,在水解反应器中加入5.7mol/L盐酸200l,含2苯酚(m/V),将指管置于反应器中,抽真空并充氮气反复三次(图3.1c,真空控制也是实验重复性的一项重要因素)110保温22h。其中,苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸(Cys)和甲硫
4、氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键,如ValVal,IleLeu等,水解时间可适当延长至72h,但长时间水解会部分破坏含羟基的氨基酸丝氨酸(Ser),苏氨酸(Thr),酪氨酸(Tyr)。,影响氨基酸分析结果的三大因素是:水解、衍生、色谱。水解是第一步,水解的完全与否对结果影响很大。在实验中通常采用一些标准蛋白质,如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色谱分析来计算回收,从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价方法的适用性。但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同,并且每一种氨基酸的量也不一样,有的氨基酸含量可多到十几个,有的氨基
5、酸含量只有12个,这影响到氨基酸的回收。生物应用公司(ABI)曾设计过一种“测试肽”,即人工合成18种不同氨基酸的肽(除Gln、Asn外),这样每种氨基酸出现的频率都是1,用此肽来校正回收,看来机会均等,是一种可以采纳的方法,但在实际样品中,不太可能出现这种理想情况。,第三节 特殊氨基酸的保护和定量,不同条件下,各种氨基酸的回收有所不同,但色氨酸均遭破坏,通常解决方法有以下5种。1.水解酸中加添加剂 这些添加剂包括琉基乙酸和-琉基乙醇,我们通过实验认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好,色氨酸的回收可达80。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品ABI420A的特点,推出试剂十二
6、烷基硫醇,专门保护色氨酸,据称回收率达97。2.有机酸 3mol/L 巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonic acid)或4mol/L甲磺酸(methane-sul-fonie acid)在水解时对色氨酸有一定的保护作用。,3碱 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解,可保护色氨酸不被破坏。4酶 蛋白酶水解法有时也有应用,其优点是条件温和,对天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均无破坏作用,但酶水解法往往不完全,必须用酸水解法校正。5光谱法 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸,前者应用较早,在蛋白质分子中,如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸,根据其在6mol/L盐酸胍的中性溶液中
7、的紫外吸收,测定色氨酸和酪氨酸的含量,此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.21时的情况。酪氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量,计算公式复杂。Hewlett Packard公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件,能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵敏的,但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难,解决这个问题的途径有两种,一种是还原烷化法,另一种是氧化法。,(1)还原烷化法 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4乙烯吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点,为了确保试剂接近巯基,还原和氧化通常在变性剂存在下进行,多余试剂和变
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