萌发小麦种子中淀粉酶学性质研究.doc

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1、摘要：本研究以萌发的小麦种子为材料，提取得到淀粉酶液。利用分光光度计法测定淀粉酶分解淀粉所得还原糖与3,5-二硝基水杨酸的还原产物的吸光值，从而得出酶活标准曲线。根据-淀粉酶和-淀粉酶对温度的差异，采用加热的方法钝化-淀粉酶，测定出-淀粉酶的活性为26.00 mg.g-1 鲜重5min-1。在非钝化条件下测定淀粉酶的总活力为399.82 mg.g-1 鲜重5min-1，进一步得出-淀粉酶的活性为373.82 mg.g-1 鲜重5min-1。研究影响淀粉酶活性的因素，在不同温度、不同pH值，激活剂和抑制剂的条件下由酶反应混合物遇碘呈现的颜色判断出酶活性的最适温度为40 ，最适pH值为5.6，Na

2、Cl为激活剂，CuSO4为抑制剂。通过研究淀粉酶的性质使我们更充分地了解，并利用于工业生产、食品加工、医疗等产业。关键词：淀粉酶；酶活性；温度；pH值；激活剂和抑制剂。引言酶是一种具有催化活性的蛋白质，由氨基酸通过肽链连接而成,只有在适当的温度、pH和离子强度下才具有生物活性。而且生物体内的各种代谢变化都是由酶驱动的,酶既能催化各种生化反应，还能调节和控制代谢的速度、方向和途径,是新陈代谢的调节元件。淀粉酶广泛分布于植物和动物体内，特别是萌发谷物种子。它具有水解淀粉的能力，对生物有很大的影响作用。而淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。因此研究淀粉酶有重要的意

3、义。现代酶学正向着两个方向发展：酶的分子生物学和酶工程学，它们是现代生物技术的重要组成部分，应用范围包括医药，食品，化学工业，诊断分析和生物传感器，涉及的品种不少，如淀粉酶，其市场需求生产规模和产值均很乐观，并已产生巨大经济效益。1.材料与方法1.1 材料实验材料为小麦（Triticum aestivum L.），由东北农业大学生命学院生化实验室提供。1.2 方法1.2.1淀粉酶粗酶液的提取称取1 g萌发3 d的小麦种子（芽长约1 cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2 mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入刻度试管中，定容至25 mL。提取液在室温下放置提取15-20 min，每隔数分钟搅动一次，

4、使其充分提取。然后在4000 r/min转速下离心10 min，将上清液倒入一个干净的试管中，即为淀粉酶粗酶液。1.2.2 酶活力的测定1.2.2.1酶活测定标准曲线的制作取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表加入试剂管号123456 7麦芽糖标准液/ml00.20.61.01.41.8 2.0蒸馏水/ml 2.01.81.41.00.60.2 0麦芽糖含量/ml00.20.61.01.4 1.8 2.03,5-二硝基水杨酸/ml2.02.02.02.02.02.0 2.0光密度值摇匀，置沸水浴煮沸5分钟。取出后流水冷却，加蒸馏水定容只20ml. 以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测

5、定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度纵坐标，绘制标准曲线。实验数据的记录如表麦芽糖含量/mg0.20.61.01.41.82.0光密度值0.0100.0430.0840.1300.1840.204标准曲线如图1.2.2.2淀粉酶活力测定取6支试管，编号，按下表操作。酶活力的测定操作项目-淀粉酶活力测定总酶活力测定-1-2-3-1-2-3淀粉酶原液/mL1.01.01.0000钝化-淀粉酶置70 水浴15 min，冷却淀粉酶稀释液/mL0001.01.01.03,5-二硝基水杨酸/mL2.0002.000预保温将各试管和淀粉溶液置于40 恒温水域中保温10 min1%淀粉溶液/mL1.01.0

6、1.01.01.01.0保温在40恒温水浴中准确保温5 min3,5-二硝基水杨酸/mL02.02.002.02.0将各试管摇匀，显色后520 nm处进行比色测定光密度，记录测定结果。1.2.3 温度对淀粉酶活性的影响取8支试管，编号，按下表操作，并记录观察到的颜色。温度对淀粉酶活性的影响管 号AaBbCcDd缓冲液（pH5.6）/mL1-1-1-1-淀粉溶液/mL2.5-2.5-2.5-2.5-淀粉酶提取液/mL-1-1-1-1预保温/min4室温40沸水浴混合A倒入a中B倒入b中C倒入c中D倒入d中酶促反应（10min）4室温40沸水浴碘液各3滴（滴管应先冷却至室温）显色1.2.4 pH对

7、淀粉酶活性的影响取3支试管，编号，按下表操作，并记录观察到的颜色。PH对淀粉酶活性的影响管 号缓冲液/mL2（pH3.0）2（pH5.6）2(pH8.0）淀粉溶液/mL各2.5淀粉酶提取液/mL各1酶促反应（10min）摇匀，40 水浴10 min碘液各3滴显色1.2.5 激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响取4支试管，编号，按下表操作，并记录观察到的颜色。激活剂抑制剂对淀粉酶活性的影响管 号1234缓冲液（PH5.6）/mL各2NaCl溶液/mL1-CuSO4溶液/mL-1-Na2SO4溶液/mL-1-H2O-1淀粉溶液/mL各2.5淀粉酶提取液/mL各1酶促反应（10min）摇匀，40 水浴1

8、0 min碘液各3滴显色2结果2.1淀粉酶活性由计算得-淀粉酶活性为26.00 mg.g-1 鲜重5min-1淀粉酶总活力为399.82 mg.g-1 鲜重5min-1-淀粉酶活性为373.82 mg.g-1 鲜重5min-12.2 温度对淀粉酶活性的影响1号管：40 ，淀粉几乎完全被水解，酶的活性达到相对最大；2号管：室温，淀粉被部分水解，酶的活性受到一定的抑制；3号管：100 ，淀粉几乎未被水解，酶几乎完全失活；4号管：4 ，淀粉几乎未被水解，酶几乎完全失活；由图可知40 是小麦淀粉酶的最适温度。由实验结果可以得到，淀粉酶的最适温度是40 。温度偏高或者偏低都会影响酶的活性甚至导致酶的失活

9、。酶在低温时影响较慢，随温度升高而加快，当达到最适温度（约40 ）时，酶反应速度最快，以后又随着温度升高而减慢，达到一定高温时酶失活，反应完全停止。2.3 pH对淀粉酶活性的影响1号管：PH=3.0，淀粉几乎未被水解，酶几乎完全失活；2号管：PH=8.0，淀粉被部分水解，酶的活性受到一定的抑制；3号管：PH=5.6，淀粉几乎完全水解，酶的活性达到相对最大；由图可知pH=5.6是小麦淀粉酶的最适pH。由实验结果可以得到，小麦淀粉酶的最适pH是5.6。 pH值对酶活的影响极为显著，通常各种酶只在一定的PH范围内才表现出它的活性，同一种酶在不同的pH下所表现的活性不同，一种酶表现其活性最高时的pH值

10、称为酶的最适pH值。低于或高于最适pH时，酶的活性逐渐降低。2.4 激活剂和抑制剂对淀粉酶活性的影响1号管：加NaCl的溶液，淀粉相对水解完全，酶的活性增加；2号管：加CuSO4的溶液，淀粉被部分水解，酶的活性受到一定抑制；3号管：Na2SO4的溶液，加入碘液后变化不明显；4号管：H2O，加入碘液后变化不明显；由图可知NaCl是小麦淀粉酶的激活剂；CuSO4小麦淀粉酶的抑制剂。由实验结果可以得到，NaCl中Cl-使淀粉酶活性增强，为淀粉酶激活剂；CuSO4中Cu2+使淀粉酶活性减弱，为淀粉酶抑制剂。3.讨论（1）影响淀粉酶活性的因素是多方面的。本实验着重研究了温度、pH、激活剂和抑制剂对淀粉酶

11、活性的影响。在实验过程中，温度、PH值、激活剂和抑制剂是影响酶活性的几个重要因素，只研究其中一个因素对酶活性的影响时，要尽量控制其他因素在最适标准上，从而研究这一单一因素对酶活性的影响。由实验结果可知，在一定温度范围内，低温时酶对淀粉的反应影响较慢，到达最适温度（40 左右）时反应速率最快，此后随温度升高，酶的活性对反应的影响减慢，高温时酶失活。一种酶的最适温度也不是完全固定的，它与作用时间长短有关，一般作用时间越长则最适温度越低，而作用时间越短则最适温度越高，因此需要严格控制反应时间，准确按照实验步骤进行；在一定pH范围内，酶在高于或低于最适pH（5.6左右）时都会使酶活性降低，酶的最适pH

12、也受底物性质的影响，还受缓冲液性质的影响；Cl-使淀粉酶活性增强，为淀粉酶激活剂，CuSO4中Cu2+使淀粉酶活性减弱，为淀粉酶抑制剂。激活剂和抑制剂影响酶活性的剂量都很小，且具有特异性。（2）通过查阅资料可知，淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，它有许多的用途，对淀粉酶活性的研究可以使我们准确知道淀粉酶活性，最适温度，PH值，激活剂抑制剂种类有利于更好的应用淀粉酶，对我们的生产生活有巨大的利益，例如：面包焙烤工业。淀粉酶用于面包工业，可以使产品体积更大，颜色更好，颗粒更柔软；淀粉的液化作用和糖化作用。淀粉酶的主要市场是水解产物，淀粉被转化为高果糖玉米糖浆（HFCS）。由于他们的高甜度，

13、被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的淀粉酶；纤维脱浆。现代纤维制造工艺在编织过程中产生大量的细菌，为防止这些纱线断裂，往往会在纱线的表面加1层可去除的保护层。这些表面层的材料，淀粉是一个很好的选择。淀粉脱浆可以利用淀粉酶，它能有选择性地去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机地使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉；造纸工业。淀粉酶在造纸工业中的用途主要是纸张图层淀粉等。（3）-淀粉酶不耐酸，在PH3.6以下迅速钝化；-淀粉酶不耐热，在70 15 min钝化。然而本实验主要是对总酶酶学性质的研究，没有将-淀粉酶和-淀粉酶分别进行酶学性质的研究，这样将两种性质有

14、差异酶放在一起研究，会使结论不够明确，我们可以进一步将两种酶分别进行研究。其中-淀粉酶作为一种重要的工业用酶，广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，因此对其做更深层次的研究具有重要的意义。（4）通过此次实验研究，进一步加深了对淀粉酶的认识和学习，同时培养了设计实验的技能，学会如何提出合理的实验方案,为以后研究其他种类的酶提供了研究方法和实验依据。参考文献：1 高继国，郭春绒.普通生物化学教程实验指导M.北京：化学工业出版社，2009.92 王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（上）. 北京：高等教育出版社，2002，5433 王镜岩，朱圣庚，徐长法. 生物化学（下）. 北京：高等教育出版社，2002，5434 罗贯民，曹淑桂等酶工程M北京：中国农业出版社，2000，145 吴华涛,李玥,王亚丽. J.化工时刊.2008(12)