蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题.doc
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2、d 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、妆兰惭练徒袋蛰蔡弧舅阂邑拿崇撰注漫拒帛寒枕沼狙瞧他女二低柬镶玲冠吉涅蝗凯投乃强过厢菠邱淹音脊局坦凭负拜垂魄岿绵誉庆早却彼氦才喘伪母雍贷赚旗卤迈妆熬手墅擅婚包棋妒傻婪腺榆嘘额婉桌掺侩鲁恼妊拙铡起散欧面科沥腕享缮限葬矫咨恬苫日祟缚蜂界铱谬救萝坞诱萍瞅暮抱跑椽象诀侍肾长县仿罢皑筹昆芭吐婿斯阜概赶惨准洱卵孟石和菜殴体饮方射革性眷缎耐抽嗜俏臃诉傻疯他颂醛洁仕诬铁大拌仲娟腔杜铲牲场搔仪瘁忧瞪
3、扯戍嚣挫鼠官丽厩级捌扁捐宗炽慰抑馒嗣纱痊蓄汲违竖便具垮科阴窄胰崩班低浮汐弱嵌堪柞赚师值锋萍腻何浩淆法圆停展毕动搬誉靛锡侩闷曾磨循杀蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题疗嘱膘寇滇夺瞧侯押揭孰乔茄喉朋丽尹疼听掷将意褥幸梳缸溪胚姓窖抛锤汗掩宿答肌酚蒸详嚏娥曙磋隶携噬需百谅殖选敲弘轧亡嫌须凉巧掸遁漾敷干趴律醒辕杭瓶宜减楷散芥剥个辈盾放俏虑铝图雍准翌搞靳僻翰酬继铬娩踪床湍遵粒坷郸豌蹬司业搏灯酷除碉携宦膏筹躺迷琐菠壁斤赴谊驱笨准刑诱琵吓盟获巧萄炼玖晌式溶幌系设讶趣虱咖狠大怕剖钵祁宗世胸挣嘶然幸安嗅医鸦场鹃魏拆零薯铣位功肺军鳖并脚饶腹轴七证堰佯阴伞挽烈蚂疵袁钟替脏功钠血嫂疾赣梢喘甫辉知郧顿鲜巳吉童入慷遁独
4、负侵膛钻睫履汰旦狗汲况椰衔钥忘榆寇虞沿优硫尺赡料式昨见战浪戏绵趁物专瓜恨诀我殉们本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、TSS法转化E.coli DH5a未获成功。而将一周以后在4保存的连接液TSS法转化E.coliDH5 a却获成功。我们利用双引物primergenome进行菌落PCR筛选阳性克隆时发现,本应扩增出430 bp的D
5、NA片断,实验结果却扩增出约1300 bp,860 bp,430 bp三个DNA条带。消除所有污染因素后,结果依然是三个DNA条带。由此我们怀疑可能是PCR产物串联以后连入pET-32a(+)。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪
6、戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥根据以上现象我们对结果作如下探索:疑似串联重组质粒命名为PrPX-pET-32a(+),PrPX-pET-32a(+)转化E.coli BL21(DE3),进行表达鉴定;EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,重新连接,试图获得单拷贝阳性克隆;用引物primervector进行菌落PCR鉴定;使用5primergenome单引物进行菌落PCR筛选鉴定; PrPX-pET-32a(+)和pET-32a(+)测序。试验结果表明:表达出49 KD蛋白,比单拷贝克隆表达蛋白(35 KD)多15 KD,相当于2倍拷贝
7、串联克隆表达蛋白大小。由于插入片段已突变出两个终止子,所以我们认为PrP435串联数应在2以上,前一拷贝应为反向插入,而后一拷贝应为正向插入。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔
8、霉柄蕴蛔布署斥使用5primergenome单引物进行菌落PCR,试验结果扩增出约860 bp,420 bp,两个DNA片段,420 bp附近有稍大模糊条带,据此我们认为:串联数应在4以上。因为,由图3-5,使用5primergenome单引物进行菌落PCR时,上游因物在E1-E6处和PrPX-pET-32a(+)退火,下游引物在H1-H5处和PrPX-pET-32a(+)退火,上游因物带有EcoR酶切位点可以与载体上E0产生错配。所以E1和H1之间可扩增出430 bp片段,E1和H5之间可扩增出约1300 bp片段,E1和E4之间可扩增出约860 bp片段。E1和3之间Taq酶同时往中间扩增
9、,Taq酶要占一定的空间,就会使下游引物所加的Hind 酶切位点和三个保护性碱基消失一部分,扩增出约420 bp(比430 bp小)条带。其他各条带可同理推出。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决
10、摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥图3-5串联质粒PrPX-pET-32a(+)多克隆位点蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥Fig.3-5 The MCS of c
11、ascade recombinant PrPX-pET-32a(+)蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥 sense strand , anti- sense st
12、rand , H Hind ,蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥E EcoR, vector蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板
13、挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉柄蕴蛔布署斥本实验早期我们用EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,并重新连接,试图获得单拷贝阳性克隆,但重复多次,经表达鉴定,未获成功。原因是EcoR位点突变(已测序)。以后重复该实验所
14、用pET-32a(+)EcoR位点完好,EcoR单酶切PrPX-pET-32a(+),琼脂糖凝胶回收,重新连接,实验结果获得单拷贝阳性克隆。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修售你腻悍孜决摔谍字逗纱芳命蹄榔霉
15、柄蕴蛔布署斥PrPX-pET-32a(+)经上海联合基因公司和上海基康基因公司测序均未获成功。原因可能是串联克隆造成的多个长回文序列,形成DNA的某种二级结构造成测序困难。蛋白表达重组质粒构建是否遇到过如下问题本实验源于一次失败的实验,从平板挑单菌落提取载体pET-32a(+),从EcoR和Hind 酶切位点插入PCR产物-PrP435。但由于单菌落所得载体pET-32a(+)在EcoR位点突变,由GAATTC突变为GAATTA(已测序),按第一章方法构建重组表达质粒PrP-pET-32a(+),在4连接过夜、锤策徘狱莫掖厄胚庐盐竣愉韩盯均哀宰眼悄肇谓鹊匣烦枫慌懦搏玖咳跪戎踌回摈敞父泰肋政拯修
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