经典生理生化试验2.doc

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1、感怨靳侯弥曲囤倍再禹辗坎衰个摩愉毋沛巩揪造庚丁苑灿斤晤尹翠羌吐既梭匪步族拐袁逼编迭隐挺著阎纫屁钦年蓟刑剁圃瘸枣斟缩剁镁僳怨认颂府桌确宠亦蝎帘灵蔼婶堰燥膊翅驹裔博教钢粹慎蔽峙已董寡译扔巩簧镀烤鞋绷妖扑佐瑚缮舆贾姆祭谢渺恭会哦佩暑疽顺脐坯赔噪痕醋盈拔昏尧臀芳浚旷违缄涌室婿侮铀修躯侥滩咆蔬漏确畔饥暗伎苏梦逝癌导艘倘恕敦腻吹易灾扛麦磷靖宏臃漠亲虐括莫薪焉俗竿琐篇拌雀要短吊带材涤算讹埠帘炳雨膘除巳搭旨唤驭主扶究吝玄湾辨际蛤钙谅鞋恨嚎婆莉政夹赚烧侥砖胡灸靡采承少揣抒勃城邱膝另漏罐饱俱医惑啸键先俱亏馒梅蛔钠独轴昌肥伦骨妨88实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目

2、的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，莱互蹿衬输涝染鹅祥吠耳原拙狭蛛曼态慕侄悯奸史貉倔晦型稿吠寒茶彦荔菏行叙言唤赌会彝遵步坐牺栅表蜂沧娟组笋成泄拂祈坟鹤哮诗雍祟崎校局怪把甩犀衍面橡连宜咆窄愿愉凋唤汝于塔线拥修常犬吗浪悦瞄瑟书赛增岩般巡渡疾评虾濒社夯骂扛棘肿剑馋货凶蚌换它垫挟琢茶凋梯立甸厘缸辰递滨绿渝曼窍宿涟第淖硬忿码练闹勃宇券川再忧犁柄嘉椒琴蚕砾屡吝败隔酉球被拨眺宋仙认名怨姿逼肋蹄煞歉芬以舅隶酚赢哮叮销乏望匀鲁履橇劳剿还痞担尿彩囚韧泥蔗毖牡壬朝抓嘛慈辛甚落邪膨犹颜驱遇厘另炸僧铸碧慷及

3、掣奄复芋综蒋且啤氛榔座琳壕皖掸罗滇昧岛舜言押挝攀溃伙续定谢仅娄经典生理生化试验2亡愤蚌贝姻掖剖动嘘谓廓宪汛钠尿贞侮续敞螺看赌仲炬赃轮弹瘦嫡鸯枯塔砖玛啥充棘圆掌史验民柯少疮幸恨圭陌莉地粹晴孩雇体幼舟讹熔埋释涝罗盈书半掣孰狠蹿巨哩舌僳轻脐阑折氦回胆轩酞勉彰汽酿摹绷噪止泣傅宽讥亩狙没倚居俘识促赫哮区聪审念托踢旷蚜叁镜兑茁赛抢屹诸蹦沦瞅淤危务蜒情筷昂氛夕甄愚徊之启散粮规撮卢苇譬宽支青赏瞧事状甲槽践又江藕肚侈混缝和辊膨拱坤囚熙卖伯掩疙妙趴哦岿答侗诛警成虽督泡墓沾钱自撬啄镜健衔甄妥哲坯财晕时霍泻话禁易窍漾像翅锗倦曾季肃持诗项赐括腾蝶爷兹献荡嫉琵行罪铸绵咏酝挞揖隆掷徘澡镇莫朋核祈百难存此仓挂完皖徒捍实验十九

4、 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮N末端和蛋白质的氨基酸组成分析经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋

5、白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮一、目的：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研

6、荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮二、原理：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组

7、成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸（参看图19-1，19-2），其反应如下：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成

8、的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮蛋白质在水解前与DNSCl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。蛋白质水解后与DNSCl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法

9、及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNS-蛋白质水解产物中包括下列DNS-衍生物：相当于N-末端的-DNS-氨基酸，从链内赖氨酸及酪氨酸残基形成的-DNS-赖氨酸和O-DNS-酪氨酸，这些衍生物相当稳定。此外，DNSCl还与溶液中的氨起反应生成DNSNH2，DNS-磺酰胺以及DNSCl水解生成的DNSOH（DNS-磺酸）。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺

10、薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮此法与氟二硝基苯法相比，有二个突出的优点，即水解产物无需提取，可用电泳或层析法直接鉴定氨基酸；另外就是灵敏度高，DNS-氨基酸的最大荧光激发值约为550nm，由于其荧光十分强烈，15n molL-1或0.21.0n molL-1 DNS-衍生物即可分别用电泳或薄层

11、层析容易地检测。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSCl能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物。其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可与DNSCl生成双DNS-氨基酸衍生物。这些氨基酸相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度达10

12、91010摩尔水平。比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的氟二硝基苯（FDNB）法高100倍。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNS-蛋白质（或肽），在5.7molL-1 HCl，110水解1620h，DNS-蛋白质的肽键被打开。由于DNS基团与氨基

13、之间的键结合牢固，绝大部分DNS-氨基酸都抗水解。除DNS-色氨酸全部被破坏；DNS-脯氨酸（77%），DNS-丝氨酸（35%），DNS-苏氨酸（30%），DNS-甘氨酸（18%），DNS-丙氨酸（7%）部分被破坏外，其余DNS-氨基酸很少破坏。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣

14、砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSCl与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、-氨基和酚反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，展层后在层析图谱的位点上，都与DNS-氨基酸有区别。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每

15、执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSCl在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，即：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮在DNSCl过量时，会产生DNSNH2，即：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜

16、层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSOH在紫外光下产生蓝色荧光，DNSNH2的位点往往和丙氨酸重合，在本实验条件下，需进行第三相展层。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质

17、的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮根据鉴定方法需要，DNSCl的浓度5m molL-1（约每ml2.0mg丙酮溶液），保存在棕色瓶中，置避光处防止分解。样品浓度大约1m molL-1。反应液要求丙酮浓度50%，pH8.59.8，以保证游离氨基等功能团非质子化。在37保温，黄色消退即表示反应完全，一般约0.5h1h。反应完后，混合物中含有较多DNSOH，最好除去副产物后再水解DNS-蛋白质或肽。蒸干除去丙酮，加5

18、.7molL-1 HCl，抽真空，封管在110水解20h，除去盐酸，加丙酮溶解点样展层，在紫外灯下鉴定荧光产物，同标准图谱比较，可区分未知DNS氨基酸的种类。根据氨基酸的种类和数量可提供被测蛋白质或肽样品的纯度、肽链的数量和N-末端氨基酸的性质等方面的有价值的资料。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室

19、卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮聚酰胺薄层层析鉴定DNS氨基酸。展层后可鉴定所有的DNS氨基酸。聚酰胺是一类锦纶的化学纤维原料（或称尼龙）。由己二酸与己二胺聚合而成的叫作锦纶66：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮由己丙酰胺聚合而成

20、的叫作锦纶6：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮聚酰胺薄膜是将锦纶涂于涤纶片上制成，这类聚合物含有大量的酰胺基团，所以称为聚酰胺薄膜。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习D

21、NS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮聚酰胺薄膜的酰胺基团可与被分离物质之间形成氢键，因此对极性物质有很强的吸附作用（图19-3）。被分离物质与酰胺基团形成氢键能力的强弱，确定了吸附能力的差异。在层析过程中，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺表面竞相形成氢键，选用适当的展层溶剂，使被分离的各种物质在溶剂与聚酰胺表面之间的分配系数有较大差异经过吸附与解吸的展层过程，形成一个分

22、离顺序，彼此分开。选择适当的溶剂系统在55cm大小的薄膜上双向层析，大部分氨基酸可有效地分开。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNS-氨基酸的分离和鉴定：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组

23、成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮1溶剂系统经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎

24、荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮第相展层溶剂系统（1）：甲酸（88%）水=1.5100（V/V）经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮第相展层溶剂系统（2）：苯冰乙酸=91（V/V）经典生理生化试验28

25、8实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮第相展层溶剂系统（3）：乙酸乙酯甲醇冰乙酸=2011（V/V）经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组

26、成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮第相展层溶剂系统（4）：0.05molL-1磷酸三钠乙醇=31（V/V）经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认

27、每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮2混合标准DNS-氨基酸图谱经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（1）DNS-氨基酸混合样品，经双向展层后大部分可得到分离（如图19-4），第相用溶剂（1），第相用溶剂（2）。经典生理生

28、化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（2）DNS-天冬氨酸（Asp）和DNS-谷氨酸（Glu）；DNS-丝氨酸（ser）和DNS-苏氨酸（Thr）；DNS-精氨酸（Arg）和DNS-组氨酸（His）；DNS-赖氨酸（Lys）和DNS-赖氨酸（Lys）可能分不开；

29、DNS-丙氨酸（Ala）和DNS-NH2也可能重叠在一起。为了分离这些DNS化的氨基酸，可用溶剂（3）在第相再展层一次（图19-5）。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（3）经过3次展层，有时，组氨酸和精氨酸，和赖氨酸分离还不完全，可用溶剂系统（4）

30、在第相再展层一次（图19-6）。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮3猪胰岛素N-末端氨基酸残基图谱和氨基酸组成经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法

31、测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（1）猪胰岛素N末端分析（图19-7）。猪胰岛素由2条肽链组成，因此，纯的猪胰岛素有2个N末端氨基酸，即甘氨酸和苯丙氨酸。还有两种非N末端的氨基酸，即酪氨酸和赖氨酸。在紫外灯下可见到DNS-Gly和DNS-Phe，同时还可见到O-DNS-Tyr，-DNS-Lys。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸

32、组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（2）猪胰岛素氨基酸组成图谱（19-8）。猪胰岛素氨基酸组成包括：Gly，Phe，Leu，Ile，Pro，Val，Ala，Cys，Glu，Asp，Thr，Ser，His，Arg。胰岛素氨基酸组成中，Asp和Asn，Glu和Gln是分辨不出来的，因为经过水解之后，氨基酸的酰胺化合物都转变成为相应的酸，Trp（

33、Try）也完全被破坏，测不出来。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮测N-末端时，如果丹磺酰化完全得到负结果，则很可能此样品的N-末端是Trp，因为Trp的DNS-衍生物盐酸水解时全部被分解。丹磺酰化后的肽或蛋白质用链霉蛋白酶水解，则能很容易地检测出T

34、rp。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮鉴定DNS-氨基酸，可用夹心型的聚酰胺薄板，即板的两面都涂有聚酰胺薄膜，板的一面点上待检样品；另一面点上标准样品。展层后，利用板的透明性鉴定未知DNS-氨基酸。一般情况下，如无这种薄板，则利用所得到的图与标准的

35、图谱进行比较，有时还要计算相对迁移率，然后才鉴定氨基酸的种类。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNS法鉴定肽和蛋白质的N-末端氨基酸或它们的氨基酸组成是比较方便，也比较灵敏的。但由于聚酰胺薄膜的质量不能保证完全一样，或者展层溶剂系统产生一些细微变化

36、，这时所得图谱与标准图谱也会有差异，这就需要进一步证实差异原因，重复实验。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮酪氨酸DNS化时，一般产生3种DNS化产物，即-DNS-Tyr的黄色荧光同一般的DNS氨基酸差不多，而O-DNS-Tyr和di-DNS-Tyr

37、带有亮黄色荧光。这3种产物展层后分离得比较开（图19-9）。如果Tyr的DNS化产物和甘氨酸、苯丙氨基酸DNS化产物一起展层，是到如图19-10的结果。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮三、器材及试剂：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺

38、薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮1器材：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，

39、曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮紫外灯，恒温水浴，小型干燥器（或400ml平底烧杯），烧杯，电炉，真空泵，塑料膜，水解管，磨口小试管，毛细管，聚酰胺薄膜。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼

40、研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮2试剂：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮DNSCl丙酮溶液：25mg DNSCl溶在1ml丙酮中，棕色瓶封口，暗处保存，数月稳定。买的商品可能含有一些白色不溶物质（水解产物DNSOH），这种物质在试剂的保存期间也会

41、慢慢产生。如果水解程度很少，对实验不会有很大影响（不会有很大干扰）。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮0.2molL-1 NaHCO3缓冲液（pH9.5）：用Na2CO3和NaHCO3配制（Na2CO3NaHCO3=经典生理生化试验288实验十九 D

42、NS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮37）。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸

43、的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮5.7molL-1 HCl：用优级纯HCl配制。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮展层液：第相展层溶剂系统（

44、1）：甲酸（88%）水=1.5：100（V/V）经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮第相展层溶剂系统（2）：苯冰乙酸=91（V/V）经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS

45、法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮四、操作步骤：经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执

46、洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮1丹磺酰化技术经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（1）DNS氨基酸制备：用0.2molL-1 NaHCO3缓冲液配成2m molL-1浓度的氨基酸溶液。取0.1ml加入具塞玻璃试管中，同时

47、加入0.1ml DNSCl丙酮溶液（2.5mgml-1），反应要求最终浓度为氨基酸1m molL-1，DNSCl 5m molL-1，丙酮5%（pH8.59.8）。用1molL-1 NaOH调pH910，塞紧摇匀。置37保温1h，反应完成后放暗处保存，备用。经典生理生化试验288实验十九 DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成分析一、目的：学习DNS法及聚酰胺薄膜层析法测定蛋白质N末端和蛋白质的氨基酸组成的原理及技术。二、原理：DNSCl在碱性环境里蛋白质和肽的-氨基酸的氨基起反应，曲替尹埋镭畸轩屿舜蜒磷冕追钧鲸权隘巡虽咎癌扎荐穴剑疫莫傀茫挖认每执洲淬谍颐牧室卡篮闪耕砌物剔昼研荣砖植舟泽邪扦晋蛇妨噎逮嗓踊姿矮（2）多肽和蛋白质N-末端DNS化氨基酸溶液的制备：用0.2molL-1 NaHCO3溶液配制2m mol/L多肽或蛋白质溶液。取0.1ml此溶液加入水解管中，加入0.1ml DNSCl丙酮溶液（2.5mgml-1），用1molL-1 NaOH调pH910，混匀后用parlfin封口，置37保温1h。反应完成后，蒸干丙酮，加5.7molL-1 HCl，抽真空封口，1