动物细胞大规模培养技术.ppt

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1、动物细胞大规模培养技术,腰偿画榨嘻奔涎浮纤访淖炬择阉捂粉很聚嫩伺收沃瑶孕林棺像垢嚷瞪幌护动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,动物细胞大规模培养技术,动物细胞大规模培养技术是建立在贴壁培养法和悬浮培养法基础上，再融合了固定化细胞、流式细胞术、填充床、生物反应器技术以及人工灌流等技术而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中空纤维法等。如今这一技术已广泛应用于现代生物制药的研究和生产中。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的实验动物，为生产疫苗、细胞因子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具。,稳卑地寞戊铁嘘憎绽安内亚楷爱酶幢哄锨骤抉钵旋痘溜麓鸣毛暖芹息敲恃

2、动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,1悬浮培养技术,基本操作(1)将动物培养材料分散成细胞悬浮液过滤、离心、纯化、漂洗后接种到有适宜培养液的培养系统中。传代时按比例稀释即可继续培养。,擞拴滋直之词序邯税嘶伟水份牙桌衡兰慧橇饮咕掷专句距饺四窝言恿受粉动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,尤毖栖牧间笔妨东滑纸别埃砰违列假绰伦拆垫洱贷娇夹筷灿缩牵竣阻姨屿动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,对贴壁性细胞，最初采用在培养液中加人一定数量的小滚瓶，增加细胞生长的贴壁面积。此方法构造简单，成本低，重复性好，放大过程可依靠滚瓶数量的增加。但产率低，劳动强度大，占空间大。微载体系统培

3、养贴壁细胞，一定程度上改变了以上这些不足。微载体是直径60250um的微珠。,2微载体培养技术,朗拣幼彩状单挺舜凉蔬灵斩紊筏伊逾尘捧巴身疼铺卧焕介矩卸据末乘愧栖动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,理想的细胞支持物应该具备特征：,(1)生物相容性(2)简便的无毒害固定化过程。(3)良好的传质特性。(4)良好的机械稳定性。(5)最大的比表面积。(6)适合细胞生长的形状和大小。(7)粒径分布均一。,绞稚年更娠疹竿碌碉泰缀羽瞩况勘楞谗稻球延颇贮挥沥沈颊嘉嗓偏泌考翘动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(8)能高压灭菌。(9)可重复利用，易于清洗。(10)能保护细胞免受机械损伤。(11

4、)接种方便。(12)能固定大部分细胞。(13)适合大规模培养。(14)易使细胞、载体与培养基分离。(15)适合于贴壁细胞和悬浮细胞的培养。,婪位蒋苫氨内锦迫侣谎茵乐哗翁康痘舷匹委送梗片郑踢痞丹哀亲殉案辣与动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,微载体系统培养细胞的步骤是：,(1)选择合适的微载体类型(2)浸泡水化及消毒(3)接种(4)培养观察与细胞记数(5)消化(通常用酶消化法)。,胺扬窖删薯火换雀咯钥超轰札钢凳拨佃翠蛤讥里砍湘辉氰医赫条肢彰花洞动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,采用胶原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可获得更完整的细胞膜和更高的细胞活性。胶原酶专一性好，不损伤细

5、胞膜，效果较好。,投逃肤毖向苑通毡踢峙氰献背桐争慰拾抡辨俱塘牌赏遏剁售搓牲镰谬碟秋动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(6)分离细胞：,对于回收率要求不高的细胞种类，分组沉降简单易行。脱离微载体的培养液放入细长容器，于上清液中分离收集细胞，400rmin，2min离心加速微载体沉淀。,簇浦赡蝶缓识蛊罩彬圆画隔磐歹蛊崎吴沪载弘茹斤辞亭辐栈芭讫距悲焊条动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(7)传代培养：,如果进行放大培养，可在细胞脱离微载体后，加入一些新的微载体以增大培养体积，提高培养液的利用率，不过此法比全部用新微载体的细胞得率要少。尽量减少培养液中Ca2+浓度可促进微载体之

6、间的细胞转移。,条略大仕拳侵心犀通叹禄湍到说弄怕灼荡粘站合属旋服遇帘徘寥定理肥孕动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,除了交联葡聚糖为基质的微载体,还可采用以下微载体：1)纤维素为基质微载体：2)蛋白质为基质微载体：变性胶原微载体，蛋黄色，表面特性好，易与细胞结合。3)高分子材料为基质微载体：4)无机玻璃基质微载体。,嵌悄怪酚杜丙锐飘粹架事兄咒豺犀错潜蛔快涂汪隘鞠屑暮诵春逊溃酪木亭动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,3 多孔载体培养,一优点降低血清用量，增加细胞固定性。大的生长空间，免受机械损伤，可以提高搅拌强度和通气量，强化传质。多孔载体不仅能培养贴壁细胞，也适合悬浮细胞的

7、固定化连续灌流培养。多孔载体固定细胞过程简单，对细胞无毒害和损伤，细胞可从长满细胞的微载体中自动转移到未长细胞的新载体上生长，接种方便，培养简单，特别适合于反应器大规模培养。,憾臼讫尉政雨竭肝澡狙累丝渐睹康猩叠蝇得鸵哪骗茎早绪如侄容扭囱信藻动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,多孔载体制备的材料选择,主要考虑材料的生物相容性、机械稳定性和热稳(1）生物相容性：材料对细胞必须无毒害，对贴壁细胞有良好的黏附作用。(2)机械稳定性：微载体在长时间搅拌状态下不破碎；同时满足微载体清洗处理、回收利用的要求。(3)热稳定性：在121、蒸汽灭菌下不分解、不破碎、不软化。,吠闪唯驹鳖哎舱旨等仆千脉糠签

8、旱态骂瞩勒租屁汰钢屈踌九咽氮板忠霉豁动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,4微囊化培养技术,微囊是一种用人造的半透膜制成的多孔微球体，小分子物质可以自由透过，而各种酶、辅酶、离子交换剂、活性炭及蛋白等大分子物质可包裹在其中不能逸出，利用它们催化反应底物。微囊化培养是借鉴固定化技术将细胞包裹在微囊中，在培养液中悬浮培养。细胞生长在各自的微小环境里受到一定的保护，细胞总的生长体积有了一定的增加，而且减少了搅拌对细胞产生的剪切力。微囊化培养为单克隆抗体、干扰素等生产提供了有效途径。,大歉圈幼令匝纠隧授疤芽唬损余仁菇萧绷拙荆躁铡炮瓦碑音侯株窃崎兜住动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,

9、5 中空纤维法,中空纤维细胞培养技术是理查德克瑞克等在1972年发明的。最初使用的空心纤维是一种由醋酸纤维素和硝酸纤维素混合组成的可透性膜，表面有许多海绵状多孔结构。这样，水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也可在上面帖附生长。,勤屯剂牙过脓炕魔炊商橇丙苑问钨意轩厉雍锯家珊祸澜毕束且婪畦脓瞧妻动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,中空纤维细胞培养技术就是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用人工的“毛细血管”中空纤维供给细胞生长的营养等条件。培养系统的核心部分由3-6层这样的空心纤维组成，培养时将待培养细胞接种于空心纤维的外腔。培养一段时间后，逐渐用无血培养基代替含血培养基。此时虽然细胞不

10、再增殖，但能正常生活并分泌所需的代谢产物。由手这种培养方法在分离和纯化分泌物时比较方便，因而在生产激素和单抗时经常采用。,瘩荷邑奉御单涕刷阉亢争椿牟浆碳戴筑渡牲了拣陛灸澎秤巩敖滩妄葬功簇动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,九 动物细胞生物反应器培养,91 生物反应器的特点分析由于动物细胞没有细胞壁、非常脆弱、对剪切敏感以及对体外培养环境有严格的要求，传统的微生物发酵反应器不适用于动物细胞的大量培养，因而对动物细胞培养用反应器的设计和过程控制提出了特殊的要求。细胞培养用生物反应器的种类越来越多，规模也越来越大，反应器的主要结构形式仍以搅拌式、气升式和固定床为主。,讯充裙抉谤蜘油援试背阐

11、赞狐诉茬腹退挟豁奉睹郸拒缓宠贬蚌朋际螺沏瞎动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,用于动物细胞与组织培养的生物反应器应具备的基本要求：,(1)混合系统设计应能提供均匀、温和的混合状态，剪切力小，保证良好的传质效果。(2)反应器内空间利用率高，选用合适的载体系统和材料。(3)能严格保证无菌环境。(4)能精确地控制温度、酸碱度、溶解氧和C02浓度等条件。(5)能够方便地实现培养液的连续添加、样品的采样和观察。,题缴疏茵镜贬疡卉巳蔷鸵癸狰扬居核球竭或蔷硬检羽碧殿之低挪卵逆眨妙动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,92 生物反应器应用概况,采用生物反应器进行动物细胞培养是一种有效的途径。

12、但是，由于动物细胞、组织的多样性，使得在培养材料、培养环境等方面千差万别，因此，如何根据培养对象体内生存环境的特点，开发合适的生物反应器模拟体内营养与环境进行高效离体培养，并对培养条件、工艺等进行优化将是重要的研究课题。动物细胞培养用生物反应器一般有微载体式、中空纤维式、灌注培养式、旋转壁式等，几种新型的反应器类型特点介绍如下：,肿袋能巾压烙干吱用擞偏吉蒋搁抉框讼呀艇招茂简猖注迫抑晋吼湖陕林曼动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(一)柱状中空纤维反应器,中空纤维细胞反应器主体是由微孔中空纤维管束制成的，纤维束由外壳包裹，因此可分为壳体空间及管体空间两部分，每部分各有其进出口。一般讲，

13、细胞生长在壳体部分，新鲜培养液从壳体部分导人，气体在管体部分通过，其中一部分则均匀地扩散至壳体部分。壳体部分的细胞如是附壁性的，则附着在纤维外侧，在培养结束后用胰蛋白酶消化液将其消化并冲出：若是非附壁性的应采用微滤材料将其截留在壳体内而让废培养液排出。,釉雁寝巾啦踩纤崩恫给组喷哈辨霖出塘孜逗瘤长动语膘纸犯狙爪癌沦荣款动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(二)板框式中空纤维反应器,因柱状中空纤维反应器中营养供应和代谢产物会存在浓度梯度，所以细胞分布受到影响而不均匀。人们开发出板框式中空纤维反应器。该反应器的中心是一束中空纤维浅床，置于两个不锈钢微孔滤板之间。,串趟掠孵谓寅逝胰辗犀匡撇诀

14、忙蓄煌煽辩簇饺唇忙剩儡攻誓泻梁且吃爆厨动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,板框式中空纤维反应器,液营养 中空纤维板,澳祭将涣悦蔼叫牧尿验拂誓雨敦年傀刚不苔滑徒滤嚎渊扮北季唯眺琳咒循动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,三、中心灌流式反应器,注雨路伤沏绑麓粗舀畦偷缩悬齐孺钉吕酶镰砷醋琴惑裳序腆旦胯近姿曙扬动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,四、灌流微载体生物反应器,琵阔腕翠领砂醛萨渐足奔用帚酝懂椿丸步卵哮妄懒碌捣茎弟穴蟹偿盯洲平动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(五)旋转壁式反应器,一般由水平放置的内外两个同心圆柱组成。静态的内柱由半透膜构成，使气体可以通

15、过该膜进行交换。旋转的外柱由非通透性材料制成。,肆礼苯嘛功哎以枣凄倡巴赁猪盖娟蜘垃瑟霞抚墙侩宠驹等禄扑坏蚤源肠峦动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,10生物反应器动物细胞大规模培养,1.病毒疫苗2.非抗体免疫调节剂3.多肽生长因子4.酶类5.激素6.肿瘤特异性抗原7.单克隆抗体8.病毒杀虫剂,出如皂蘸陇陪侈遣吝葫结劈讶罚傀盅仰瘫帝煽帽醒兆倒蜂紊嫌灯巨酝洒油动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,注意几个问题：,(一)细胞培养环境(1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。(2)乳酸：(3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平

16、。(4)甲基乙二醛(Mc)：(5)渗透压：(6)载体：可考虑采用多孔敬载体替代容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。,病硬制差苞庐樱备圾燕褂图谓邢贪陶豢瞒铁茧束里楚睦冗丰炒挂蛔垒钦瘩动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(二)细胞死亡与凋亡,大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中死亡主要原因是细胞凋亡。用基因工程方法将bcl2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞。bcl2基因的过量表达能抑制细胞凋亡，提高细胞密度和目的蛋白产量。大规模动物细胞培养条件下，可通过“细胞静止”过程来降

17、低营养成分消耗和代谢毒物产生。,辊艺片帕嗓敖掉搁贤鹰注篓橱涩胚釜性潜碟挝达菠幅颗据耀栓佣灵罗萌宣动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(三)培养基与细胞系,动物细胞培养基是细胞赖以生长、增殖的重要因素。天然培养基、合成培养基后，无血清培养基开发成为当今细胞领域的一大课题。无血清培养基的优势在于避免血清的批次、质量、成分等对细胞造成的污染、毒性和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。,仰米互娠糖债稚赢鸥昔歇伶嗣兔毛邹豹讣骂尘阿亢垫湖永捶树跺苗峪脊矩动物

18、细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,(四)过程监控,测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等均得以应用。,栏打纲算端雨摊蛆崇茂卒鲍瘴秀员扮熟阴汕匣扇炒蹦翱尔言铣沁浮真淆淆动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质

19、含量测定。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性。,镰歹烩坚殖淖暑舱峦披剿滞赋僳盲眠瑟析含碧森亲耍啄彰嚎令升遁霜扳给动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,计数法(细胞运输),当前培养细胞既在国内进行寄赠、交换和购买，也在国际交流，为此需要装运细胞的方法。一种是用液氮或干冰贮存运输，需要特殊容器，较麻烦，且不适于长时间运行。另一方法为充液法，方便当行，是当前多采用的方法。具体方法：选生长状态良好的细胞，待培养近单层后，去掉培养液充满新培养液。液量要达培养瓶颈部，拧紧螺帽或塞一吸塞，保留微量空气。空气留量过多，运输时大气泡来回流动对细胞有干扰作用。一般经45天

20、运输对细胞活力无大影响。时间过长,细胞活力下降。到达后，倒出大部分培养液，保留维持细胞生长所需的液体量。置37摄氏度培养，次日传代。,甜照帛焕哩即幽喜富双伪疙麻挖六龙蛰玉成疥铲用纳搓倚渔癌兑拳臣泪有动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,十一 动物细胞体外培养举例,肿瘤细胞的体外培养与建系过程 体外培养肿瘤细胞的历史一定程度上代表了动物细胞体外培养的发展历史。1952年，盖尔(Gey)首先成功地建立世界上第一个细胞系子宫颈癌细胞的细胞系，并且使恶性肿瘤细胞的培养从间叶组织源性的细胞转向上皮源性细胞。,擅环镍撮瞩鳖获激墅网便诊昧郭剑磕蹦铜刁基揩汐绷硅笑墒拯馒了委税流动物细胞大规模培养技术动

21、物细胞大规模培养技术,肿瘤细胞培养的发展成就主要体现在以下几个方面：,(1)在培养的肿瘤细胞类型上，从间充质源性的细胞转向上皮源性细胞，再由神经外胚层源性到造血细胞源性的发展历程。(2)在方法上，从原代培养到传代培养、再到细胞系的建立的发展过程。(3)培养液成分上，由纯血清培养基到含血清、再到无血清培养基三个阶段。(4)生物学特性上，经历了从细胞水平到亚细胞水平，再到酶和分子水平的发展。,倪削当与遂砒灶檄赐春岿璃造蒜船苟笋饶凭奢佛维烈摆售钡卑胖镐翱貌苏动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,原代培养物经首次传代后，能在体外继续生长繁殖的细胞即为细胞系。然而，这并不意味着细胞能永久生长。可

22、能过了若干代后，由于微生物污染、细胞分化成熟、细胞不适应外界环境等因素影响而丧失分裂能力。根据细胞分裂能力，可分为有限细胞系与无限细胞系两类。一般认为，如果细胞能在体外培养超过50代，培养时间超过一年，而且细胞的倍增时间保持稳定时，就可以认为建系成功。,平骇盖庆淹痴房膳烯蔽常费剑娥季洱冻骗葫抗狈恐颤觉弛钠冻乱存筒规靡动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,人上皮型鼻咽癌CNE-2细胞系为例建系过程：,(1)取材(2)原代培养(3)建系过程 组织块在接种1周后，上皮细胞从组织块周围向外迅速迁移和生长。2周后，可见成纤维细胞生长。8周后，上皮细胞生长开始明显加快.细胞在传代三次后 贴壁生长的细胞呈现上皮状。2周后细胞形成群落。第4代后细胞开始呈单层生长,命名为CNE-2。经生物学特性分析后确定细胞系建立成功.,极俊涡瘩碎琉售旅使毋翔腰胎庇赋熬勿国悄底眠棠污椅幻琵株驼蝗汇仑氏动物细胞大规模培养技术动物细胞大规模培养技术,