儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用文档资料.ppt

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1、一、儿科常见疱疹类病毒感染的病原体种类、危害及诊治现状,1、儿科常见疱疹类病毒感染现状 全世界每年有1300万因感染性疾病而死亡，其中1000万是5岁以下儿童，99%发生在经济欠发达的发展中国家，其死因的70%是因常见的感染性疾病引起。,随着科技水平的不断提高，各种抗生素、抗病毒药物日益增多，若能早期快速明确诊断系何种病原体感染，就能有效地控制儿童的病死率。然而，目前感染诊断在我国还局限于生化、培养、病原体分离等常规方法，缺乏早期、快速、准确诊断的方法,在常见感染性疾病中，细菌与病毒共占了90%以上（其中细菌与病毒各占45%左右）。在95重大攻关项目中，成功地创建了16SrRNA基因PCR基因

2、芯片快速、准确诊断不同细菌的感染，使细菌诊断上了一新的台阶，其研究成果也列入了全国新生儿败血症诊断标准。,但病毒的快速早期诊断方法仍未见报道。儿童是祖国的未来，如何早期明确诊断儿童病毒感染将是能否治愈病毒感染的关键。,2、儿科疱疹类病毒感染的危害儿童病毒感染造成严重危害涉及儿科与围产医学二大范畴。儿科领域中，病毒感染致死的主要原因是中枢神经系统感染，典型的感染为单纯疱疹病毒型（HSV）所致的脑膜脑炎（HSE）。,HSE是散发性病毒性脑炎中最常见的病原。其次表现为发热、肝脾淋巴结肿大等原因不明的病毒感染，最具代表性的疾病是传染性单核细胞增多症。目前已知主要是由于EB病毒感染所致。EB病毒还对神经

3、系统危害严重，如引起脑膜脑炎、格林巴利综合症、Fishers综合症等。,在围产医学中，病毒感染的危害在于宫内感染，最具典型的是巨细胞病毒（CMV），其次是单纯疱疹病毒型（HSV）。同时，CMV脑炎也是AIDS患者中最常见的并发症。,疱疹类病毒导致儿童中枢神经系统的感染，不及时治疗往往造成智力低下、惊厥发作、语言不清、神经性耳聋等中枢神经系统严重后遗症，尤其是HSV引起的脑炎，未经治疗死亡率高达70%，而有效的抗病毒药物治疗后可明显改善HSE的愈合，使死亡率降至20-30%，但要确保早期用药。,3、儿科感染疱疹类病毒的种类造成儿童感染致死的主要病毒是HSV、EBV、HCMV、HSV。这些病毒同属

4、于疱疹类病毒，分别是疱疹病毒（HSV/）、疱疹病毒（HCMV）、疱疹病毒（EBV）。,疱疹类病毒尚包括水痘带状疱疹病毒（VZV），常易致脑膜脑炎、脊髓炎及神经炎；人疱疹病毒6型（HHV 6）、7型（HHV 7），以及最近发现的HHV 8，已有论据显示坏死性脑炎和Griscellis综合症的病儿脑组织中发现了HHV 6病毒。,4、疱疹类病毒感染诊治现状目前，对疱疹病毒感染仍缺乏快速、敏感、特异的诊断方法。传统的诊断“金标准”为病毒分离，培养一般需要5-21天，费时费力，且敏感性和特异性均欠佳。大多数情况下，脑炎的特异性病毒检测率仅30%，约2/3的感染者无法用病毒分离获得明确诊断。,病毒特异性抗

5、体IgM，在体液中要达到有效浓度需10天左右，同时可与其他病毒感染产生交叉反应，从而使其诊断的敏感性和特异性大大降低。,而IgG抗体则有95%的患者将维持终生，故IgG抗体的存在只能说明有既往感染，不能说明是现时感染，如要用IgG抗体作为现时感染的诊断依据，必需动态观察其滴度的变化，因而不能满足临床早期诊断的需要。,聚合酶联反应（PCR）是近十几年来发展起来的分子生物学技术，它可在一定条件下，短时间内（数小时）使病原体基因片段发生上百万倍的扩增，然后用凝胶电泳、核酸杂交、限制性酶切分析、序列检测。,近几年来，PCR诊断技术已广泛地应用于临床诊断疱疹类病毒感染，Pozo应用多对引物的多重PCR来

6、诊断疱疹类病毒感染，虽然能区分不同的病毒，但因其引物间可互相干扰，使其敏感性较低。也有人用各种病毒基因的保守区设计不同引物进行PCR扩增，但只能检测一种病毒，易造成漏诊。,因此，许多学者提出能否构建通用引物来对所有疱疹类病毒进行PCR扩增，从而达到能一次性检测所有疱疹类病毒，以及它们的混合感染。,疱疹类病毒是由一组病毒组成，具有许多相似的生物学特征及分子结构。具有高度同源序列的基因为DNA多聚酶基因，它所编码的蛋白质是DNA多聚酶，为病毒复制所必需，该基因为所有疱疹类病毒所共有，且有高度的保守性，理论上可在此区构建通用引物同时对多种疱疹类病毒进行检测。,Yamamoto曾在此区构建通用引物对3

7、5例临床怀疑疱疹病毒感染脑炎患者的脑脊液（CSF）进行PCR扩增，然后进行Southern杂交，检测了6种疱疹类病毒，但未能区分各自不同的病毒。,由于病毒的生物学特性比较复杂，各种病毒差异很大，即使同属疱疹类病毒，其抗病毒药差异甚大。如抑制CMV的更昔洛韦，对EBV无任何作用。阿昔洛韦、泛昔洛韦对HSV、VZV有效，但对CMV无效。因此，只有明确具体的病毒感染才能指导临床用药。,国外在这方面也有过尝试，如在疱疹类病毒基因组的保守区设计几对兼并引物进行PCR扩增，虽能检测各种病毒，但该方法操作繁杂、费时费力，不能满足临床需要。,二、浙江省医药卫生科研项目儿科常见疱疹类病毒分子诊断及其临床应用,（

8、一）、国内外现状和发展趋势,检索国内外近15年有关疱疹类病毒的文献，发现国内外传统的诊断“金标准”病毒分离因时间需1-3周，敏感性及特异性欠佳，达不到早期准确诊断的目的。免疫、分子生物学诊断技术一直是希望提高诊断准确性的方向。,特异性IgM、IgG的酶联免疫技术因其出现的时间及维持时间的限制，加之滴度的变化需重复检测，限制了该技术的发展。近10年来，国内外研究的重点主要集中在PCR技术的诊断。,病毒特异性引物建立高度敏感的PCR技术已经在临床应用，如我们的研究团队于90年代末成功地建立了套式PCR加限制酶分析检测巨细胞病毒，经实验证明具有高度的特异性与敏感性。,然而，疱疹类病毒感染其临床表现相

9、似，有时几种疱疹类病毒同时感染需用多对引物进行多次PCR来检测不同的疱疹类病毒，使得特异性PCR在临床实际诊断中受到限制。,许多学者因此提出构建通用引物扩增所有疱疹类病毒，从而达到一次即能检测所有疱疹类病毒。Bouquillon用通用引物扩增6种疱疹类病毒，Sakulwira等用通用引物扩增5种疱疹类病毒，并用RFLP区分不同的病毒。,我们的研究团队对儿童常见的疱疹类病毒运用通用引物进行体外DNA扩增，进一步用RFLP、测序等方法区分不同病毒，取得较好结果7，但仍存在需多种酶切、Southern杂交等的烦琐，使得在临床常规使用时受到限制。,（二）、研究内容、研究目标、拟解决的问题和今后研究思路

10、,1、研究内容基础部分,（1）、以临床常见疱疹病毒感染的诊断为目标，经计算机查索核酸序列库，选取保守DNA区域设计引物，建立能扩增所有6-8种疱疹类病毒的PCR方法。对标准毒株HSV（F株）、HSV（G株）、CMV（169株）、EBV（B95-8株）、VZV（EF株），以及HHV6（GS株）进行PCR扩增，并选择其他病毒如HBV、细菌（大肠杆菌、金葡菌等）、真菌（新型隐球菌）作为对照，以摸索出进行通用引物PCR所需的最小检出量，及其各自反应体系的适宜条件。,（2）、在疱疹类病毒的可变区域设计特异性引物，建立扩增对各自特异病毒DNA的PCR方法，包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HH

11、V7、HHV8等的PCR方法。并比较各自特异PCR方法与通用引物PCR检测标准毒株其敏感性、准确性等方面的差异。,（3）、经核酸序列GenBank比较，设计各自特异的DNA探针，并进一步分子克隆、序列分析，明确HSV、HHV6的亚型基因，设计HSV/、HHV6A/6B等的特异性探针。,（4）、对设计的DNA探针末端修饰，微阵列，制作基因芯片。内容包括固相载体的选择、玻片表面修饰、探针末端修饰、微阵列制备技术、核酸探针的固定及杂交。,（5）、基因芯片杂交系统参数的确定及检测，包括DNA固液相杂交、荧光标记与检测方法，灵敏度及特异性测定等。,2、研究内容临床部分,我院临床有中枢神经系统感染，包括急

12、性、散发性、局灶性脑炎，脑膜脑炎等患儿，收取脑脊液及外周静脉血，对全身不明原因发热、皮疹、黄疸、肝脾肿大等患儿抽取静脉血，进行DNA抽提、PCR扩增，阳性结果进一步进行基因芯片分析。,同时对临床标本血清（血浆）进行HSV、EBV、CMV等的特异性IgM、IgG检测。试图调查儿童疱疹病毒感染的实际情况，研究儿童病毒感染的早期诊断价值，发现特定疱疹病毒感染或混合感染情况，以阐明PCR-基因芯片在诊断及区分不同病毒感染时的实际意义。,在研究过程中，同时设立健康体检儿童的对照组及非病毒感染的脑脊液标本，进行PCR-基因芯片检测，以排除假阳性、假阴性等情况，拟在解决目前病毒感染缺乏早期、快速、准确诊断的

13、问题。,3、研究目标,在疱疹类病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因内设计通用引物扩增所有疱疹类病毒DNA，对其PCR扩增产物进行分子克隆、序列测定，通过序列分析找到各自特异的DNA序列及亚型序列，设计特异探针，建立疱疹病毒DNA基因芯片区分不同病毒感染，为临床疱疹类病毒感染的早期、快速诊断提供有效手段。,4、拟解决的问题,（1）、在疱疹病毒的高度同源序列选择通用引物，建立能检测CMV、HSV、VZV、HHV等所有疱疹类病毒的PCR方法。,（2）、在疱疹病毒的可变区选择特异DNA探针，并对HSV型与型、HHV6A与HHV6B等亚型进行分子克隆、序列分析，找到各自特异DNA序列，建立基因芯片，区分不

14、同疱疹病毒及其亚型。,5、今后研究思路,不断成熟完善PCR-基因芯片技术在临床疱疹类病毒诊断中的应用，研发相关诊断试剂盒；同时探索该技术在其他儿童常见病毒感染中的诊断价值。,6、研究方法,（1）、在PubMed、GenBank中选取通用引物建立能扩增所有病毒的通用引物PCR方法。选取特异引物建立能扩增特定疱疹病毒的PCR方法。引物合成由上海生工有限公司391型仪合成。,（2）、经计算机GenBank查阅，在疱疹类病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中，设计6种疱疹类病毒特异DNA探针，对HSV、HHV6体外扩增、序列分析，选择亚型DNA片段，区分不同的亚型。对以上所有DNA片段探针经微阵列，建立基

15、因芯片技术。特异性探针合成及Amino-link修饰及polydT等由日本TaKaLa生物公司完成。,（3）、标准病毒株DNA提取采用分子克隆二版的经典方法，血及CSF DNA抽提采用我院自行建立的快速抽提DNA方法。,（4）、血特异性IgM、IgG检测，采用德国欧蒙公司ELISA试剂盒，按说明书操作。,（5）、收集临床怀疑疱疹病毒感染的血及CSF标本约100例进行临床验证。标本采集前告知患儿监护人该标本将用于科研研究，并与患儿监护人签署临床研究知情同意书。,（6）、统计学分析，比较PCR-基因芯片技术在实际应用中的敏感性、特异性、似然比、正确诊断指数等。,7、技术线路,设计疱疹类病毒通用引物

16、CMV、HSV、EBV等特异引物,设计CMV、HSV、VZV、EBV、HHV特异探针,引物合成,通用引物PCR扩增特异引物PCR扩增,阳性结果,微阵列,基因芯片,明确系何种疱疹病毒,比较结果,HSV/、HHV6A/6B亚型特异性探针,HHV,HSV,序列分析,分子克隆,（一）基础部分：,临床血标本,血浆,CSF标本,白细胞层,DNA抽提,临床血标本,基因芯片,特异性IgM、IgG,比较结果,统计分析,灵敏度、特异性、假阳性率、假阴性率、似然比、正确诊断指数,（二）临床部分：,8、主要创新点,（1）、目前临床疱疹类病毒感染缺乏早期、快速、准确的诊断方法。既有的PCR技术在区分病毒种类时需要多种酶

17、切、Southern杂交、测序等诸多烦琐，限制了其临床应用。本项目将PCR与基因芯片技术相结合，针对疱疹类病毒的共同序列设计通用引物，扩增所有疱疹类病毒；在可变区域设计特异探针制作芯片，区分不同病毒，达到早期、快速、明确诊断疱疹类病毒感染，从而为临床治疗提供依据，具有很大的社会效益和经济效益。,（2）、虽然已明确疱疹类病毒感染率与社会经济状况的相关性，但目前国内有关经济发达与欠发达地区儿童疱疹类病毒感染率比较的研究较少。本项目选择磐安县和杭州市这两个浙江省内社会经济状况有较大差异的地区，比较两地儿童疱疹类病毒的感染率，可为浙江省经济不同地区儿童疱疹类病毒感染的流行病学研究填补空白。,9、项目预期成果,（1）、建立通用引物扩增所有疱疹类病毒的PCR技术，达到快速（4小时内完成）、敏感（扩增产物拷贝数达105以上）、重复性好的要求。,（2）、建立扩增特异疱疹类病毒的PCR技术，在混合病毒感染时其通用引物PCR相互间的扩增抑制率控制在20%以下。,（3）、建立疱疹类病毒的基因芯片诊断技术，经PCR扩增产物与基因芯片杂交，可区分何种疱疹类病毒感染，并进一步明确系何亚型。,（4）、PCR-基因芯片技术与传统ELISA方法进行临床应用比较，明确其敏感性、特异性、假阳性率、假阴性率、似然比、正确诊断指数。,谢谢！,