动物细胞培养文档资料.ppt

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1、细胞培养的甚本概念,传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。,细胞培养：使用细胞悬液组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,培养细胞的特性,培养细胞的生长方式贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞兼性贴壁生长,贴附型细胞,动物细胞体外培养特点,培养要严格在无菌条件下进行，细菌、真菌、病毒、或其它细胞均可导致培养物的污染。,培

2、养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要2 细胞的生存环境 温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,实验室,实验准备,实验用品：超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，CO2培养箱倒置显微镜酶标仪、微孔板震荡器液氮罐自动双重纯水蒸馏器，纯水仪耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境紫外灯：紫外线消

3、毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,超净台,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,滤 器,CO2培养,CO2培养箱设定的条件为37，5CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14 h)。箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养瓶,常用玻璃器皿清洗浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸

4、泡（24小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干,清洁液的配制,2 细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-

5、10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,培养基,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,合成培养基,合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点

6、：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子转移蛋白不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加 10血清对于血清支持细因生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。

7、在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞,无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子 等。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。1975年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。,向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源

8、组织的不同细胞株，所需补加物也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56，30 分钟血清的消毒：过滤除菌,抗菌素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定,完全培养基的组成,基础

9、培养基 80一95血清 5一20碳酸氢钠 2.0 g/L青、链霉素 各100卑位毫升,培养基的配制,RPMI-1640培养粉 1袋碳酸氢钠 2.0 g青、链霉素 各100单位毫升加双蒸水 至 1000ml,过滤除菌。调节pH值至7.2加血清（终浓度 10）,每代贴附生长细胞的生长过程,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长

10、基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为624小时。,对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。,停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度依赖性,培养细胞活力测定,细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。1 细胞克隆形成率实验单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体形成肉眼可见

11、的克隆。克隆形成卒用来表示细胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成数接种细胞数缺点：操作繁琐优点：精确、可靠,台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中的百分比表示细胞恬力 已淘汰,四唑盐（MTT）比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作步骤（1）单细胞

12、悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。,冻存和复苏的原则：慢冻快融,当细胞冷到零度

13、以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细、胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,慢冻程序,标准程序：当温度在-25 以上时，12/min当温度达-25 以下时，510/min当温度达-100时，可迅速放入液氮中细胞冻存器简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。,低温保护剂的应用,在

14、细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO 2 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。4 年后，存洁率可达80一叽。DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。,细胞复苏方法,（l）从液氮

15、中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞培养方法,悬滴培养法旋转管培养法灌注小室培养法培养瓶培养法培养板培养法,原代培养与传代培养技术,原代培养与传代培养技术,组织块培养,组织消化培养,取材分离组织消化（胰蛋白酶、胶原酶）培养过程,传代培养,组织工程,定义：组织工程一词最早是在1987年美国科学基金会在华盛顿举办的生物工程小组会上提出，1988年正式定义为：应用生命科学与工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下的组织结构与功能关系

16、的基础上，研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态的生物替代物的一门新兴学科,组织工程研究主要包括四个方面：种子细胞、生物材料、构建组织和器官的方法和技术以及组织工程的临床应用。目前临床上常用的组织修复途径大致有3种：即自体组织移植、异体组织移植或应用人工代用品。这三种方法都分别存在不足，如免疫排斥反应及供体不足等。组织工程的发展将从根本上解决组织和器官缺损所致的功能障碍或丧失治疗的问题。组织工程的核心是建立由细胞和生物材料构成的三维空间复合体，这与传统的二维结构（如细胞培养）有着本质的区别，其最大优点是可形成具有生命力的活体组织，对病损组织进行形态、结构和功能的重建

17、并达到永久性替代；用最少的组织细胞通过在体外培养扩增后，进行大块组织缺损的修复；可按组织器官缺损情况任意塑形，达到完美的形态修复。,研究路线：组织工程的基本方法是将体外培养的高浓度组织细胞，扩增后吸附于一种生物相容性良好、并可被人体逐步降解吸收的细胞外基质上。该材料可为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获得足够的营养物质，进行气体交换，使细胞按预制形态的三维支架生长。然后将这种细胞生物材料复合体植入机体病损部位，在生物支架降解吸收过程中，种植的细胞继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。,器官培养,定义：以动物原位细胞或胚胎细胞为材料进行

18、培养，在适当的环境下，使其存活生长，长成类似组织或器官的结构。,器官原位修复,干细胞,定义：具有自我更新和分化潜能的细胞形态、特征：圆形或椭圆形、体积小、核质比大，具有较高的端粒酶活性和增殖能力增殖：缓慢性、自稳性（会自我更新维持自身数目的恒定）分类：单能干细胞、多能干细胞、全能干细胞,在细胞的分化过程中，细胞往往由于高度分化而完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体在发展适应过程中为了祢补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，称之为干细胞（stem cell）。一旦生理需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化细胞，也可以这样说，这些干细胞充当了分化细胞预备队的角色。在动物体中，多

19、数组织含有干细胞，甚至在进化的早期，最初级的后生动物-海绵也含有称之为始祖母细胞的干细胞。,干细胞有以下特点：（1）干细胞本身不是处于分化途径的终端。（2）干细胞能无限的增殖分裂。（3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。（4）干细胞通过两种方式生长，一种是对称分裂形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。可以说，干细胞是具多潜能和自我更新特点的增殖速度较缓慢的细胞。,分 类,按分化潜能的

20、大小，干细胞基本上可分为三种类型：一类是全能性干细胞，它具有形成完整个体的分化潜能。如胚胎干细胞（简称ES细胞），它是从早期胚胎的内细胞团分离出来的一种高度未分化的细胞系，具有与早期胚胎细胞相似的形态特征和很强的分化能力，它可以无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织、器官。另一类是多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制，骨髓多能造血干细胞是典型的例子，它可分化出至少十二种血细胞，但不能分化出造血系统以外的其它细胞。还有一类干细胞为单能干细胞（也称专能、偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或密切相

21、关的两种类型的细胞分化，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞或叫卫星细胞。,干细胞来源,成体干细胞成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。过去认为成体干细胞主要包括上皮干细胞和造血干细胞。最近研究表明，以往认为不能再生的神经组织仍然包含神经干细胞,说明成体干细胞普遍存在，问题是如何寻找和分离各种组织特异性干细胞。成体干细胞经常位于特定的微环境中。微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互

22、作用，控制干细胞的更新和分化。,胚胎干细胞胚胎干细胞出现在胚胎发育的胚囊内层，高水平表达端粒酶。因为获取胚胎干细胞、建立胚胎干细胞系必须破坏胚囊，生命的定义目前尚无统一的认识，体外培养产生的胚囊是否具有生命还存在着广泛的争议，所以胚胎干细胞的分离、研究乃至用于临床治疗是否符合伦理道德的问题引起了全世界的广泛争论。一种观点认为受精卵产生就意味着新生命的诞生，破坏胚囊就意味着扼杀了一个新的生命。因此，胚胎干细胞的分离、研究及应用都是违反伦理道德的。也有观点认为尽管胚胎干细胞的分离不符合传统的道德观念，但出于研究目的而分离胚胎干细胞可以被接受。另有一些观点认为，受精卵如果未在母体子宫内生长，就不会发

23、育成为完整的个体，因而不能称其为生命。利用这种体外受精产生的胚胎干细胞进行研究和临床治疗，并不违反伦理道德。,胚胎干细胞生物学特性,细胞形态结构与核型：体积小、核大、多仁、多为染色质，散布着大量核糖体和线粒体，核型正常，具有整倍性生长特性特定的分泌因子、整合素、胞外基质以及细胞间的相互作用构成干细胞分化与增殖的微环境,干细胞应用前景,研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是应用干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病如缺血引起的心肌坏死，退行性病变如帕金森综合征，自体免疫性疾病如胰岛素依赖型糖尿病等。,特 点,应用干细胞治疗疾病较传统方法具有很多优点：低毒性（或无毒性），一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；还可能应用自身于细胞移植，避免产生免疫排斥反应。用于细胞治疗疾病已不再只是设想。,人们可望从自体中分离出成体干细胞，在体外定向诱导分化为靶组织细胞并保持增殖能力，将这些细胞回输入体内，从而达到长期治疗的目的 体外制造人体器官（嵌合体动物）目前科学家已能在体外以干细胞为种子培育成功一些组织器官，来替代病变或衰老的组织器官。,