培养细胞的生物学特点余莉.ppt

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1、2009/12/04,内容提要,培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察,2009/12/04,内容提要,培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察,2009/12/04,培养细胞的生长方式,按生长方式:2型 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才 能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而 在悬浮状态下即可生长的细胞。绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞 可在悬浮状态下生长,2009/12/04,一：粘附生长型细胞（较为多见）,粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和

2、生长发育的基本存在方式含义:两方面 其一是细胞与细胞之间相互接触 其二是细胞与细胞外基质结合结果:基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。,2009/12/04,培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞。,一：粘附生长型细胞（较为多见）,2009/12/04,类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显

3、不同,一：粘附生长型细胞（较为多见）,2009/12/04,按照培养细胞的主要形态,可将其分为,成纤维细胞型 上皮细胞型 游走型细胞 多型性细胞,2009/12/04,1.成纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,2009/12/04,生长特点:排列成放射状，漩涡状,并不紧靠连成片，细胞细胞接触易断开而,单独行动 游离的单独的成纤维样细胞 常有几个伸长的细胞突起,1.成

4、纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层,2009/12/04,1.成纤维型细胞：(fibroblast)来自中胚层,2009/12/04,2、上皮细胞型(epithlium cell type),名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核,2009/12/04,生长特点 易相连成片 相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动,2、上皮细胞型(epithlium cell type),2009/12/04,2、上皮细胞型(epi

5、thlium cell type),2009/12/04,肺微血管内皮细胞,2、上皮细胞型(epithlium cell type),2009/12/04,2、上皮细胞型(epithlium cell type),2009/12/04,3、游走型细胞(wandering cell type),特点：在支持物上散在生长,不连接成片,胞质伸出伪足或突起呈活跃的游走或变形运动,速度快不规则,密度大连接成片呈多角形不易与其他类型的细胞区别。,2009/12/04,表现这种形态的细胞主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞系统的细胞,如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、肝枯否细胞(pffer cell

6、)以及某些肿瘤细胞等。在植块培养时,这类细胞最先从植块迁移出来。,3、游走型细胞(wandering cell type),2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,4、多形型细胞(polymorphic cell type),特点：无规律的形态，如神经细胞。,2009/12/04,2009/12/04,新生24小时wistar大鼠皮质神经细胞 1.细胞种类：大鼠皮质神经细胞；2.培养的天数：5 天；3.放大倍速：倒置显微镜 X200倍；4.培养基种类：DEME-F12N2 5.细胞状态与特征简述：神经细胞聚集成球，向外爬行生长，各神经球之间 有丰

7、富的神经丝联系。单个神经细胞胞体呈锥形或圆形，树突交错呈网，贴 壁生长。,2009/12/04,（二）悬浮生长型细胞(suspended cell type),概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源 自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团,2009/12/04,优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化)易于收获 可获得稳定状态缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞),（二）悬浮生长型细胞(suspended cell type),2009/12/04,胚胎干细胞悬浮培养形成的拟

8、胚体 倒置显微镜20,（二）悬浮生长型细胞(suspended cell type),2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,强调：一般形态并不是一项可靠指标要受各方面 影响。如：反复开关温箱、温度、C02的浓度、培养基变碱、支原体、pH值。细胞在接种时呈三角型状态，经培养一定时间后，细胞在传代前已形成上皮型细胞。,细胞形态受环境的影响,2009/12/04,细胞贴壁延展过程,2009/12/04,培养细胞形态不稳定血清 Hela 高血清 低血清 成纤维细胞样 上皮样细胞 pH Hela 太酸或太碱 标准pH 成纤维细胞样 上皮样细胞 细胞密度 3T3 低密度 高密度

9、 成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附 圆形 成纤维或上皮样 转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样,细胞形态受环境的影响,2009/12/04,衰退期细胞,2009/12/04,衰退期细胞,2009/12/04,内容提要,培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察,2009/12/04,总的：与体内仍有相似-体外培养的细胞仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系但有不同 相对孤立、相对单一 失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显 万变不离其宗，入乡随俗1.去分化2.贴壁和铺展3.接触抑制和密度依赖性生长抑制,二、培养

10、细胞的生物学特点,2009/12/04,1.去分化,细胞分化(cell differentiation)细胞分化是指在个体发育中，由一种相同的细胞类型经细胞分裂后逐渐在形态、结构和功能上形成稳定性差异，产生不同的细胞类群的过程。分化的结果是在空间上，细胞之间出现差异；在时间上同一细胞和它以前的状态有所不同。从本质上说，细胞分化是从化学分化到形态、功能分化的过程。只有通过细胞分化,才能形成各种不同的细胞,进而形成不同的各具功能的器官,使生物体成为一个个体,否则假如细胞只是长大变多也就是说只有干重的增加而不分化,所有的细胞都只能保持原始的干细胞的状态也就无法形成生物体了。,2009/12/04,2

11、009/12/04,培养细胞分化状态的变化,体内细胞-三方面的影响与调节:体外环境的影响 体内神经体液因素 的调节 细胞与局部微环境的相互作用 控制-维持着细胞的分化特征。体外培养时，失去了-分化特征逐渐减弱,2009/12/04,去分化(脱分化):是指已分化成熟的细胞和组织倒退分化,返回原始幼稚的状态(逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性)有2点,去分化,2009/12/04,1.去分化并不意味着完全返回胚胎时期的原始细胞状态如:高度分化的神经细胞和心肌细胞 已经丧失的增生活性不可能恢复 但已经具备的生物电活动特性 不会完全失去,去分化,2009/12/04,2.可重新表现出分

12、化特点 如：把表皮细胞放在气液界面上培养，可分化成 含大量角蛋白丝的角质细胞 内皮细胞-但，这种能力会随着培养时间延长 逐渐丧失总之，体外培养,使细胞 结构与功能上的“可塑性”增大,去分化,2010/11/29,2.贴附和铺展,2009/12/04,贴附(粘附)和附着,粘附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附(adherence)，是细胞培养以后能否成功的第一步.细胞悬液后 耽搁得越久，越容易发生退化提供什么样的生长表面 是细胞能否成功粘附的主要因素。,2009/12/04,不同细胞的粘附能力不同 如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强 能在数分钟至

13、数十分钟内粘附到固相表面 如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱 需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面 粘附能力强的细胞-粘附能力弱的细胞-可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞,贴附(粘附)和附着,2009/12/04,细胞形态因是否贴附于底物而不同悬浮的细胞:基本圆形粘附和贴壁的细胞:扁平圆形 相差显微镜“亮圈”很快过渡-,贴附(粘附)和附着,2009/12/04,贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着伸展,贴附(粘附)和附着,2009/12/04,各种细胞不同 如接种30后第二瓶30(附着最强)巨噬细胞一成纤维细胞 上皮细胞血细胞(最弱)生物因素 血清、培

14、养液中的促附着因子 机械，物理等其他因素因素 离心：促进附着 流动：培养液流动可阻止细胞附着 低温：可抑制附着,影响因素,2009/12/04,1.包被对分化程度高、生长能力差的细胞 可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和 生长的生物活性物质 如:-通过其所带电荷先吸附-,培养的细胞再与其结合。血清内含有多种能够 促进细胞粘附的成分 细胞本身也可能产生一些粘附分子,措施（因素）,2009/12/04,2.减少接种时细胞悬液的量待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液3.减少培养液中血清的含量 使培养液黏度降低4.培养液中离子成分及其浓度 如，培养液中的Ca含量过低时不利于 细胞的粘附、贴壁和铺展

15、5.培养液的温度 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,措施（因素）,2009/12/04,铺展,铺展（伸展）(spread)进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为 铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程，细胞先由圆形变为 圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细胞 极性细胞就是各种有机体细胞 在体外的特征性 细胞形态,2009/12/04,铺展状况 是调节细胞形状的主要方面 铺展得越好，细胞越扁 意味着细胞与生长基质表面接触面越大铺展状况 与细胞的生长有密切关系 只有当细胞铺展到合适的程度 DNA合成才开始进行 通过比较贴壁依赖性细胞 不同铺展程度与DNA合成率之间的关系 发现细

16、胞越扁(厚度越小)DNA合成率越高,铺展,2009/12/04,合适的细胞形状-伸展细胞形状(伸展)与细胞的生长 对正常细胞的DNA合成重要 对其生长重要,伸展的意义,2009/12/04,实验一 成纤维细胞1.附着于玻璃或塑料底物:细胞增殖2.悬浮培养:细胞不增殖3.a.培养在悬浮的玻璃纤维上:若够长:细胞可增殖 若短于20um,细胞可附着,但增殖很慢 或不增殖,伸展的意义,2009/12/04,原因分析在1.附着培养物上:细胞很扁平,很伸展在2.悬浮培养中:细胞圆球形,未伸展在3.培养中:细胞维持介于扁平与圆球之间因此,细胞形状,至关重要伸展至原来的形态,才能增殖,伸展的意义-实验,200

17、9/12/04,细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状 当接触坚硬平面 即铺展于底物上，扁平状 与底物形成很多接触点,伸展过程,2009/12/04,(1)开始阶段 开始附着铺开 细胞附着于底物 球形的细胞，下方表面与底物接触成扁 但尚未形成新的伪足,伸展分几个阶段,2009/12/04,(2)放射状铺展阶段在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起伪足形状 主要 柱形丝状:直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状:厚0.1-0.5 宽2-5 尚有:小泡状叶状:直径1-2 开始时:絲状多 以后:片状增加,伸展分几个阶段,2009/12/04,许多伪足 形成薄的胞质小片牢固贴于底物 胞体中央部分 扁

18、整亇细胞扁平(3)极化阶段,伸展分几个阶段,2009/12/04,底物 细胞能在很多固体表面附着 最终铺展的程度，取决于底物的性质影响因素：活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展 细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上 如胶原，聚赖氨酸 机械，物理因素,附着、伸展的条件,2009/12/04,3.接触抑制和密度依赖性生长抑制,正常细胞：细胞相互接触能抑制细胞运动，这种现象称为接触抑制(contact inhibition)。肿瘤细胞：没有这种现象，可作为区别正常与肿瘤细胞的标志之一。当肿瘤细胞达到一定密度后向三维空间发展，使

19、细胞发生堆积(piled up)。由于细胞不断增殖分裂，细胞数量持续增多，培养液的营养成分减少，代谢产物增多，细胞受营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制(Density inhibition),导致细胞分裂停止。,2009/12/04,3.接触抑制和密度依赖性生长抑制,2009/12/04,运动的接触抑制,2009/12/04,密度依赖性生长抑制,增殖的密度抑制实验方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，5d细胞计数 于加入10、20、30牛血清的 培养液中，结果：,2009/12/04,结果：10血清：20hr后铺满(汇合confluent)以后至5d 细胞数不再增加(细胞 数约10

20、66cm皿)密度抑制 30%血清：以后经常换液至5d，细胞密度继续增加(可达6xl066cm皿)说明:密度抑制-铺满后 不再增殖(分裂停止)血清可降低密度抑制,密度依赖性生长抑制,2009/12/04,只加入于3T3停止生 长的培养液中 细胞不生长当再加入血清 细胞又生长说明血清可消除密度抑制,密度依赖性生长抑制,2009/12/04,(2)转化细胞的密度抑制降低 用此培养液 3T3细胞不再分裂增殖 当再加入10血清，3T3细胞可再增殖 表示血清可消除密度抑制 但当用此培养液，于转化的3T3细胞(SV3T3)却生长良好 表示转化细胞密度抑制降低(血清需要降低)说明：转化细胞的密度抑制降低.可生

21、长至较高的密度,密度依赖性生长抑制,2009/12/04,总的说明：细胞生长有密度抑制血清可降低密度抑制转化细胞可降低密度抑制,密度依赖性生长抑制,2009/12/04,内容提要,培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察,2009/12/04,三、培养细胞的生长过程,细胞系的生长过程每代贴附生长细胞的生长过程细胞周期（细胞分裂周期）,2009/12/04,体外培养细胞的整个生命活动可分为 原(初)代培养期 传(继)代培养期 衰退期三个时期,（一）细胞系的生长过程,2009/12/04,2009/12/04,1、原代培养期,取自体内新鲜组织并置于体外条件

22、下生长的细胞在传代之前称为原代培养。组织到第一次传代 时间大约为14周 特点：细胞活跃移动,分裂,但不旺盛,多呈二倍体核型。原代与体内原组织形态结构和功能活动基本相似。异质性各细胞的遗传性状互不相关，细胞相互依存性强，如果把这种稀释分散成单细胞,在软琼脂培养基中进行培养细胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明细胞独立生存性差。,2009/12/04,2、传代培养期,初代培养细胞一经传代便称之为细胞系(cell line)特点：细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型，也叫二倍体细胞系(diploid cell line)为了保存二倍体细胞性质，细胞应在初代或传代早期冻存为好。一

23、般细胞在10代以内冻存。细胞逐渐进入去分化状态。原本成分混杂的培养物中,某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势,比例越来越大,而将其它数量较少比例较小的细胞逐渐淘汰掉。,2009/12/04,3、衰退期,特点：细胞仍生存 增殖减慢 不增殖 轮廓增强 衰退凋亡注意：细胞在三期中的任何一期（一般发生在传代后期或衰退期）在某些因素影响下,如血清质量不佳、病毒污染、温度和pH不稳等,细胞可能发生自发转化(spontaneous transformation);,2009/12/04,细胞可能获得永生性(immortality)或称为恶性(malignancy)。细胞获得持久性的增殖能力,这样的细胞群体

24、称为连续细胞系(continuous cell line)。而细胞获得不死性后,细胞核型大多变成异倍体(heteroploid)接触抑制消失。,2009/12/04,有限细胞系及连续细胞系的特征,2009/12/04,细胞株(Cell Strain)：系用克隆培养、物理分离或其他选择方法分离选择，在培养的细胞群体中获得了已经被确认的某种特殊特征，这样的细胞系被称之为细胞株。,2009/12/04,游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）,(二)每代贴附生长细胞的生长过程,2009/12/04,细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟一4小时,游离期：

25、,2009/12/04,细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）,贴壁期：,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,潜伏期特点：长短与细胞接种密度、种类、使用的培养基性质有关。(1)细胞贴附后进入潜伏期,细胞无增殖。少见分裂相，细胞有运动活 动。(2)初代培养 细胞潜伏期约为2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤

26、细胞潜伏期约624小时。(3)细胞接种密度大潜伏期短。(4)细胞出现分裂相增多时，标志细胞进入指数增生期。,潜伏期(latent phase)：,2009/12/04,对数生长期(logarithmic growth phase),特点：细胞增殖最旺盛阶段,分裂相增多。细胞分裂指数(mitotie index MI)：表示每1000个细胞中的分裂相数。条件：分裂相数与细胞种类、培养成分、pH培养箱温度有关。,2009/12/04,细胞分裂指数：初代细胞：在0.10.5之间,连续分裂细胞和肿瘤细胞：3 5。指数增生期是作为细胞一代活力最好的时期,是进行实验最好和最主要的阶段。指数增生期持续35天

27、，细胞数量增多后生长空间变小，细胞相互接触可连接成片。,对数生长期(logarithmic growth phase),2009/12/04,特点：细胞不增殖,有代谢活动。培养液中的营养已逐渐耗尽,代谢产物积累增多,pH降低，此时需要传代,否则细胞将会中毒,发生形态改变,细胞会从底物脱落死亡。机制：接触抑制、密度依赖性抑制注意：传代过晚将影响下一代细胞的生长,至少要再传 12代,通过换液淘汰死细胞和受损较轻的细胞。待细胞全部恢复后再用。在这一点上要特别注意。,停止期(stagnate phase)平台期（plateau phase）：,2009/12/04,细胞生长曲线,2009/12/04,

28、（三）细胞周期（细胞分裂周期）,概念：指单个细胞的生长过程，亦指母细胞分裂后形成的细胞到下一代再分裂成两个子细胞之间的时期。细胞周期或者定义为：细胞从一次分裂结束时起，到下一次分裂结束为止的一段时期。,2009/12/04,具有进入细胞周期能力的G0期细胞静止细胞（Quiescent cell，Q细胞）休止细胞（Resting cell),最终要死亡的终止分化细胞终端分化细胞,不分裂细胞,间期细胞（G1SG2）,有丝分裂期细胞（M）,分裂期细胞,群体细胞,整个细胞周期的组成即为（G 1 0SG2M）,2009/12/04,2009/12/04,细胞周期可划分为四个阶段,2009/12/04,细

29、胞周期调控,2001年10月8日美国人LelandHartwell、英国人Paul Nurse、TimothyHunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获2001年诺贝尔生理医学奖,LelandHartwell分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)，如芽殖酵母的CDC28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。Paul Nurse同样发现了许多细胞周期调控基因，如裂殖酵母的CDC2、CDC25。进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。TimothyHunt1983年首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程

30、中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮细胞间期开始合成，G2/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。,2009/12/04,内容提要,培养细胞的生长方式及类型培养细胞的生物学特点培养细胞生长过程培养细胞生长状况的观察,2009/12/04,常规观察,培养液的颜色与透明度细胞形态变化细胞污染的观察及防治细胞生长状况,2009/12/04,状态好的细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，分裂期细胞多见。状态差的细胞，失去原来的特点，胞质出现空泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。培养液澄清，培养液颜色在指示剂的反映下显示为中性范围。,（一）培养液的颜色和透

31、明度,2009/12/04,（二）培养细胞的形态观察,1、常规采用倒置显微镜观察，最基本有两种形态：,2009/12/04,倒置显微镜,2009/12/04,2009/12/04,上皮细胞型,来源于内、外胚层的细胞，如皮肤、乳腺、肝、肺泡、消化道上皮、形态为扁平的多角型、胞质近中有圆形细胞核，生长特点为细胞之间紧密相靠，互相衔接，具有连成片的能力。,2009/12/04,成纤维细胞型,来源于中胚层的细胞，如纤维结缔组织，平滑肌、心肌，血管内皮细胞，形态具有长短不等的数个细胞突起，成棱形、不规则三角型。核为卵圆形，位于靠近胞质的中央，。生长特点为细胞排列为漩涡状、放射状、或栅栏状。,2009/1

32、2/04,相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。环形光阑（annular diaphragm）：位于光源与聚光器之间。相位板（annular phaseplate）：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4。,2、活细胞的观察,2010/11/29,(三)细胞生长状况的观察,2009/12/04,1、细胞计数,它是了解细胞生长状态的量化指标制备细胞悬液，密度不低于10000细胞ml，用10物镜观察计数板四角大方格的细胞数。计数：细胞数ml原液（4大格细

33、胞数之和4）10000注意要点：细胞分散均匀制成单个细胞悬液；计数时数上不数下；数左不数右。,2009/12/04,一个血球计数器含有两个chamber。每一chamber中有九个1mm2的大方格，且chamber高度为0.1mm，所以每一个大方格的体积为0.1mm3。,2009/12/04,细胞多于1000个/mm3,2009/12/04,2、培养细胞活力测定,任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从 形态上区别死、活细胞是困难的。在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细 胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离 细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否 有损

34、伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和 复苏的效果。,2009/12/04,2、培养细胞活力测定-台盼蓝法,活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力；死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染 色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,2009/12/04,培养细胞活力测定-伊红Y(Eosin

35、 Y),细胞悬液与7倍量的0.15%伊红Y染液（生理盐水配制）混合2分钟后镜检，死细胞为桃红色。,2009/12/04,2、细胞活力测定-MTT比色法,四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，四唑盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,2009/12/04,（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔

36、培养基总量200微升（96孔培养板每孔容积370微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为570 nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线,操作步骤,2009/12/04,（四）细胞污染观察与防治,CELL CULTURECONTAMINATION,2009/12/04,凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染细胞污染不能完全被消除，

37、但能减少其发生的频率和后果的严重性,2009/12/04,细胞污染的分类物理污染化学污染生物污染（支原体污染）,控制污染掌握良好的无菌操作技术建立细胞库合理应用抗生素保持工作区清洁建立良好的规章制度检测细胞污染,2009/12/04,温度孵箱放在温度较恒定的房间中培养液从冰箱取出后在室温放置放射线试剂周围不能放同位素振动孵箱周围不能放引起振动的设备辐射试剂不要放在带有玻璃门的冰箱中,物 理 污 染,Physicalcontamination,2009/12/04,化学污染血清培养液及试剂水培养用器皿孵箱,chemicalcontamination,2009/12/04,chemicalcont

38、amination,培养液及试剂选用纯度最高的试剂经过权威机构认定正确的储存方法,血清新购买的血清用之前要试应选用同一批次的血清,2009/12/04,实验试剂：缩写为LR，又称四级试剂。化学纯试剂：缩写为CP，又称三级试剂，一般瓶上用深蓝色标签。分析纯试剂：缩写为AR，又称二级试剂，一般瓶上用红色标签。保证试剂：缩写为GR，又称一级试剂，一般瓶上用绿色标签（又称优级纯）,2009/12/04,水用来配液和清洗容器传统用双蒸和三蒸水现在用纯水仪millipore超纯水放置过久纯度下降,chemicalcontamination,2009/12/04,容器生产过程中有毒物质残留消毒剂和清洗剂的残

39、留铝箔和包裹纸残留,chemicalcontamination,孵箱co2混有有毒气体消毒剂和清洗剂的残留,2009/12/04,biologicalcontamination,生物污染外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、细菌、支原体和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染容易发现的生物污染包括细菌、霉菌和酵母菌不容易被发现的生物污染包括病毒、原虫、昆虫、支原体和其它细胞系,2009/12/04,biologicalcontamination,对实验人员是一个潜在的危险因素细胞系交叉污染污染在这是个错误的用词难于发现若出现传代细胞的生长速度异常，考虑交叉污染同一时间只传同一种细胞每种细

40、胞要有单独的液体建立细胞库每三个月更换一次细胞支原体污染,细菌、霉菌和酵母无抗生素污染易被发现抗生素存在易造成隐性污染隐性污染引起严重后果,病毒最难发现和清除严格的宿主性自限性,2010/11/29,细菌与真菌的污染,2009/12/04,细菌污染检测肉眼直接观察法：培养液浑浊或细胞生长缓慢。培养检查法：用肉汤培养基或琼脂培养基37度培养待检样品数日，观察肉汤培养基有无浑浊，或琼脂培养基有无菌落形成。显微镜观察法：镜下可见大量菌体,细菌与真菌的污染,2009/12/04,真菌污染的检测肉眼直接观察法：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面显微镜观察法：镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错。

41、念珠菌或酵母菌形态呈卵圆形。,细菌与霉菌的污染,2009/12/04,细菌与真菌的污染,常见污染的细菌有革兰阴性菌如：大肠埃希菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有葡萄球菌、枯草杆菌等.真菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子 苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制细胞生长，或产生有意物质杀死细胞。镜下可见脑浆内出现大量颗粒，细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。,2009/12/04,霉菌污染容易发现，大多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状菌丝，纵横交错于细胞之间。,2009/12/04,常见真菌形态,2009/12/04,真菌污

42、染的成纤维细胞,2009/12/04,白假丝酵母菌污染,2009/12/04,细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见小的菌体在细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。,2009/12/04,支原体（杂草）,biologicalcontamination,2009/12/04,2009/12/04,支原体（杂草）,biologicalcontamination,污染严重,难发现 难去除显微镜看不到不引起培养液浑浊和PH改变营养要求高不容易用传统的微生物培养法检测到不能通过过滤清除大多数抗生素对其无效,2009/12/04,支原体污染来源,人体的组织及体液成分是细

43、胞培养中支原体污染的主要来源。污染的细胞中通常能分离到人类口腔支原体、发酵支原体、唾液支原体以及其它一些与人有关的支原体，操作过程中，操作者能产生有污染性的随空气传播的飞沫和微粒，造成培养体系的污染。培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞扩散和传播。牛血清中能分离到A.laidlawii、M.arginini和M.hyorhinis支原体，因此血清可能成为支原体污染的来源,2009/12/04,支原体污染危害,1）杂交瘤技术 1融合细胞无分泌单抗的能力2杂交瘤细胞产生的单抗不是针对靶抗原，而是针对支原体3支原体消耗胸腺嘧啶，干扰HAT*筛选4在HAT筛选过程中丧失了杂交瘤细胞

44、 2）细胞遗传学 1造成羊水污染2姊妹染色单体交换增多3染色体随机断裂和畸变增多4产生额外的染色体5干扰羊水培养的结果6精子污染后受精能力下降7染色体数目减少,2009/12/04,3）病毒学 1转录酶活性下降2干扰某些逆转录病毒的分离3降低禽痘病毒的感染力及空斑的形态4诱导人单核细胞产生干扰素5抑制腺病毒的增殖6诱导小鼠脾细胞产生干扰素7污染病毒疫苗8引起巨细胞病毒及带状病毒形成假空斑9降低腺病毒及SV40胸腺嘧啶的掺入10抑制腺病毒和单纯疱疹病毒的增殖11抑制脊髓灰质炎病毒和牛痘病毒的增殖12支原体与病毒在蔗糖梯度离心中共沉淀13抑制新城病病毒（NDV）产生干扰素,支原体污染危害,2009

45、/12/04,4）代谢 1降低鸟氨酸脱羧酶的产生2降低蛋白质和RNA的产生3消耗培养液中的精氨酸4改变尿苷尿氨酸的比例5降低DNA和RNA的合成6增加胸腺嘧啶的降解7诱导3T3细胞产生胶原酶8增加致癌物诱导芳香烃羟化酶的产生9促进淋巴瘤细胞的增殖10降低嘌呤替代途径11降低ATP水平5）生物反应性 引起鼠的淋巴细胞发生转化,支原体污染危害,2009/12/04,支原体污染检测,由于支原体污染并不引起细胞外观的明显变化，故常规的支原体检测非常必要的。人们可利用一系列直接或间接的方法检测支原体。但由于支原体种类的多样性，目前还没有一种方便、广谱、特异性高、准确的检测方法。因此，有必要对不同检测方法

46、的灵敏度及局限性有所了解。,2009/12/04,支原体检测方法,biologicalcontamination,2009/12/04,直接培养法是最敏感的，但也是最耗时的检测方法，大约需28天。从理论上讲，只需一个有活力的支原体就能在培养基上生长。但某些难以培养的支原体限制了直接培养法的应用。直接培养法还需要活性支原体作为阳性对照，而且耗时，操作繁琐，因而不适于大多数实验室。,支原体检测方法,2009/12/04,间接检测法包括：PCR、ELISA、电子显微镜检查、DNA探针、DNA荧光染色及生化分析法等。间接法能检测到107L的滴度。通常情况下，支原体污染后其滴度一般超过109L，故尽管间

47、接法不敏感，但相对较精确。由于支原体的多样性，表达不同特异性的抗原及酶，为生化及免疫检测法带来技术上的困难。在选择PCR、DNA探针等方法前，应考虑好选择合适的靶序列及引物序列。,支原体检测方法,2009/12/04,DNA荧光染色法,原理利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）检测支原体污染。此染剂会结合到DNA的(A-T)rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（5580%），所以可将其染色而得以检测。被支原体污染的细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体之污染。,2009/12/04,细胞DNA,

48、支原体,DNA荧光染色法,2009/12/04,阳性,阴性,DNA荧光染色法,2009/12/04,2009/12/04,2009/12/04,DNA荧光染色法质控与提示,（1）标记的靶细胞除CKI1 和vero 细胞外，3T6 细胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要点之一是用作靶细胞质控的管理应严格，必预先确认该细胞无支原体的污染才能冻存使用。（2）要明确本检体的结果判定，必须使用不含抗生素的培养液。（3）染色液：Hoechst 染液不稳定，故每次检测前须新鲜配制，使用DAPI 也可以，均应新鲜配制。,2009/12/04,（4）试验检体：被试细胞回收时用橡胶刮匙刮下，不能用胰蛋白

49、酶等水解酶类消化，制备好的检体细胞保存在80冰箱中可存放数月。（5）阳性对照：本试验采用支原体M.hyorhinis 和M.orale 为阳性对照，要十分注意避免有新的污染源。,DNA荧光染色法质控与提示,2009/12/04,（6）特异性与敏感性：本法不是支原体的特异性检出法，对DNA 进行染色观察，对其他微生物（细胞内寄生的霉菌、细菌等）的污染，也可看出同样的荧光染色。本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu，而一般污染细胞中的支原体浓度为103108cfu/mL，故本法仍具有很好的实用性。,DNA荧光染色法质控与提示,2009/12/04,DNA荧光染色法和直接培养法相结合是支原体检

50、测的金标准。美国、加拿大和欧共体国家生物制药及诊断的监督机构推荐使用这种方法。其基本原理在于利用不同的技术，多次检测，以弥补各种检测技术的缺陷，增加检测结果的可信度。,DNA荧光染色法质控与提示,2009/12/04,PCR kit-Fisher,Strategene,Sigma,2009/12/04,分子量对照2 阴性对照3-8 原有细胞的悬液9 阳性对照,VenorGeM试剂盒,2009/12/04,细胞系交叉污染,2009/12/04,细胞系交叉污染,2009/12/04,biologicalcontamination,树 立“预 防 为 主”的 思 想,保证细胞来源干净确保基质和器材无