最新第七章受体细胞PPT文档.ppt

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1、第1节 受体细胞,受体细胞(receptor cell)又称宿主细胞或寄主细胞(host cell)实验技术:能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞实验目的:有应用价值和理论研究价值,可作为受体细胞的原则:便于重组DNA分子导入便于重组DNA分子稳定存在于细胞中便于重组子的筛选遗传稳定性高，易于扩大培养与发酵安全性高，无致病性最好是内源蛋白水解酶缺失或含量低密码子无明显偏爱性具有较好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达理论与实践上具有较高的应用价值,一.原核生物细胞,作为受体细胞的优点:(1)不具纤维素壁(2)无核膜(3)基因组简单，便于遗 传分析(4)单细胞,作为受体细胞的不足:(1)不具真核

2、蛋白折叠系统(2)不具真核蛋白加工系统(3)蛋白酶降解异源蛋白,目前作为受体菌的原核生物有:(1)大肠杆菌 革兰氏阴性菌 a.基因组、遗传背景了解最清楚 b.易培养、繁殖迅速,(2)枯草杆菌 革兰氏阳性菌 a.具胞外酶分泌-调节基因，能将表达产物 分泌到培养基；b.无内毒素；c.易于保存与培养。,(3)蓝细菌 a.光能自养型，易于培养；b.与植物密码子和启动子的通用性，易于表达植物基因,二.真菌细胞 低等真核生物，具有真核生物基因结 构、表达调控体系，具有真核的蛋白 折叠、加工与分泌系统,酵母菌 a.结构最简单的真核生物，遗传背景较为清楚 b.蛋白翻译后修饰加工系统 c.不含毒素 d.易培养

3、e.可分泌,三.植物细胞,具有纤维素参与组成的坚硬细胞壁原生质体转化(纤维素酶处理)基因枪或农杆菌直接转化植物细胞的突出优点:细胞具有全能性,四.动物细胞 多采用生殖细胞、受精细胞或胚细胞，近 年用体细胞培养 常用的动物细胞受体:小鼠L细胞、Hela细胞、猴肾细胞、中国 仓鼠卵巢细胞(CHO)等,动物细胞的优点：可识别并除去内含子，加工成成熟mRNAb.翻译后加工，产物具有较好的免疫原性c.易感染，遗传稳定d.可分泌表达产物缺点：组织培养技术要求较高，周期长，难度大,第2节 重组DNA分子转入受体细胞,转化(transformation)重组DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞内稳 定维持并表

4、达的过程,一.重组DNA分子转入大肠杆菌 细菌转化的本质(革兰氏阳性菌天然转化 局部原生质体化假说):a.细菌感受态形成 b.转化因子的吸收 c.整合复合前体形成 d.单链DNA转化因子的整合 e.转化子的形成,供体菌,受体菌,感受态,单链整合、重组,转化子,非转化子,对于来自于人工重组DNA,而非供体菌的游离DNA，革兰氏阴性菌大肠杆菌中，采用人工方法制备感受态,1.Ca2+诱导大肠杆菌转化法,制备感受态细胞 1970年，Mandel和Higa用Ca2+Cl2处理大肠杆菌，促进 了大肠杆菌对噬菌体DNA的吸收 1972年，Cohen实现了质粒DNA对大肠杆菌的转化,a.培养生命旺盛的菌体(对

5、数生长期)A600约等于0.4,b.沉淀细菌 5000g离心5min,c.化合物处理(CaCl2处理)冰浴菌液(4C)加入等体积CaCl2溶液,15min,冰浴菌液(4C),4000g离心5min，弃去上清液,冰浴菌液(4C)中加入等体积CaCl2溶液,放置15min,沉淀用1/15原体积CaCl2溶液重悬,4C下保存，备用(2天内),DNA分子转化感受态细胞 感受态细胞加入DNA分子 42C水浴上放置45秒(热激)会有DNA分子进入大肠杆菌细胞里,CaCl2引起大肠杆菌细胞处于感受态可能的原因:Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使内 外膜间核酸酶解离，诱导形成感受态 Ca2+能与DNA分子

6、结合，使DNA与Ca2+复合物接近细胞膜，当42C热激处理 时，膜出现间隙，DNA分子进入,Flash2,Flash1,2.电穿孔转化法 1988年，Dower等人转化大肠杆菌,基本原理:高压电脉冲导至电穿孔(electro poration),制备感受态方法:冰浴 重悬,3.三亲本杂交转化大肠杆菌法 三亲杂交(tri-parental mating)结合转移法 基于非结合型质粒的迁移作用建立的方法 适于难以采用Ca2+诱导法和电穿孔法的受体菌,4.转化效率计算及影响因素 转化效率两种表示方式:转化率=转化子/DNA分子个数 或 转化率=转化子/DNA质量 转化率=转化子/受体菌总数,转化效率

7、的影响因素 质粒大小、结构(超螺旋与否)、与宿主亲和 性、质粒浓度(与转化效率正比例关系)不同受体细胞具不同转化效率 转化方法不同具不同转化效率 电穿孔法 Ca2+诱导法三亲杂交法,二.重组噬菌体DNA分子转导大肠杆菌 转染(transfection)与质粒DNA转化方式相似，重组噬菌体DNA 分子 直接导入到受体细胞 重组型转化率103-104 pfu(plaue forming uint)转导(transduction)通过噬菌体(病毒)颗粒感染宿主细胞的途径 将外源DNA分子导入受体细胞 重组型转化率106-107 pfu,噬菌体体外包装技术(1)外包装蛋白缺陷型 1975,Becker

8、 和Gold首先建立 D蛋白缺失突变株 E蛋白缺失突变株,包装过程:制备包装物 BHB2690(D缺失突变)BHB2688(E缺失突变)体外包装,(2)cos位点突变型 1985,Rosenberg,三.受体细胞选择,受体细胞 利于外源DNA的转化或转导 具有较好的安全性,如：野生型大肠杆菌作为受体菌的不足之处 自身限制-修饰作用，对外源DNA具一定降解作用 存在潜在治病性,诱变等方法进行遗传性状改良，获得突变型菌株:限制-修饰系统 限制系统缺陷型菌株(hsdR-)重组系统 重组蛋白缺陷型(recA-recB-recC-)易于转化或转导有明显的选择性差异 遗传表型差异大,易于重组子筛选感染寄生

9、缺陷型,四.重组DNA分子转入真核细胞,1.重组DNA分子导入植物细胞(1)农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 农杆菌(Agrobacterium)土壤习居菌 感染绝大多数双子叶植物与蕨类植物 对绝大多数单子叶植物无侵染能力,外植体 用于植物遗传转化的受体，为植物组织或器官 如：叶片、叶柄、子叶、茎、下胚轴等,共培养感染后的带菌外植体,在诱导愈伤组织或不定芽培养基上培养,几种外植体的转化方法:叶盘转化法整株植物转化法原生质体转化悬浮细胞培养 水稻等,种胚制作悬浮细胞,(2)DNA的直接转移 多聚物介导法 聚乙二醇(PEG)、多聚赖氨酸等 电穿孔转化法 激光微束穿孔法 显微注射 超生波介导转化法 基

10、因枪 脂质体介导法 花粉管导入法,2.重组DNA分子导入哺乳动物细胞 病毒颗粒转导法 磷酸钙转染法 DEAE-葡萄糖转染法 聚阳离子-DMSO转染法 显微注射技术 电穿孔法 脂质体介导法,第3节 重组子的筛选,重组子 导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞为 转化子，含有重组DNA分子的转化子为重组子筛选(screening)选择(selection),一.遗传表型直接筛选法,1.根据载体选择标记初步筛选转化子(1)抗药性筛选 氨苄青霉素(Ap 或Amp)氯霉素(Cm或Cmp)卡那霉素(Kn 或Kan)四环素(Tc或Tet)链霉素(Sm 或Str),(2)插入失活筛选,(3)插入表达筛选 与

11、插入失活相反,(4)显色互补筛选法-互补-半乳糖苷酶基因(LacZ),载体(含LacZ)LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编 码信息，编码-互补肽宿主菌 编码的缺陷型-半乳糖苷酶 肽段,乳糖类似物诱导 IPTG(异丙基-D硫代半乳糖苷)作用底物 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷),LacZ,(5)利用报告基因筛选植物转化细胞 选择标记基因(selective gene)报告基因(reporter gene)利用选择压力，将转基因受体细胞筛选出来；表达报告基因或与某基因做成嵌合基因，表达 融合蛋白，从报告基因的表达情况了解目的基因 的表达情况及推测基因调控序列。,新霉素磷酸

12、转移酶(NPT II)潮霉素磷酸转移酶(HPT)氯霉素乙酰转移酶(CAT)抗除草剂bar基因-葡萄糖酸苷酶(GUS)荧光素酶(LUC)冠瘿碱和成酶,(6)利用遗传标记筛选哺乳动物转基因细胞 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat)新霉素磷酸转移酶基因(NptII)胸苷激酶基因(tk)二氢叶酸还原酶基因(dhfr)黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(xgprt),2.营养缺陷型筛选 转基因克隆本身编码某营养物质合成酶或相 关蛋白，能够在缺少这种营养物质的缺陷型 培养基上生长。这种培养基对于非转基因克隆是致死的。,2.形成噬菌斑 噬菌体有效包装在有效的大小范围内51-36.4kbp 取代型 形成噬菌斑即为重组子

13、，空载不能有效包装 插入型 空载可形成噬菌斑，可用蓝白斑筛选,二.依赖重组子结构特征分析的筛选法 1.快速裂解菌落鉴定分子大小,A,B,2.限制性核酸内切酶分析法,3.利用PCR方法筛选重组子,三.核酸分子杂交检测法 核酸分子杂交技术：具一定同源性的两条(DNA或RNA)单链在适 宜的温度及离子强度等条件下,可按碱基互补配 对原则特异性地复性，形成双链。,探针(已知核酸片断，单链),待测核苷酸序列(单链),Southern印迹杂交 1975年，E.Southern 首先建立 针对于DNA的杂交技术，又称DNA印迹杂交,Southern印迹杂交的基本步骤DNA转膜,双链DNA碱变性,单链DNA,

14、硝酸纤维素膜或尼龙膜,转膜,电转移,虹吸作用,2.Northern印迹杂交 针对于RNA的杂交技术 步骤与Southern印迹杂交基本相似,与Southern印迹杂交不同之处：RNA电泳 避免单链RNA自身形成高级结构和自身降解,变性凝胶电泳(甲醛、尿素、甲酰胺等)RNase抑制环境,3.菌落(或噬菌体)原位杂交 1975年，M.Grunstein和D.Hosness提出菌落原位杂交 1977年，W.D.Benton和R.W.Davis噬菌斑原位杂交 不必分离细菌或噬菌体DNA,经溶菌和变性处理 后，使DNA暴露出来并于滤膜结合,印迹,碱处理；烘烤,加入探针,3.核酸杂交的探针(1)常用探针类

15、型：同源或部分同源 19-24bp 总cDNA探针 特异cDNA探针 人工合成寡核苷酸探针,(2)探针标记物 放射性标记物 32P 高放射性 半衰期14.3 d 35S 放射性较弱 半衰期87.1 d 3H 放射性弱 半衰期12.35 a 非放射性标记物 生物素(biotin)地高辛(digoxigenin),Biotin,Avidin,BCIP/NBT,紫蓝色沉淀,Dig,抗Dig抗体,碱性磷酸酶,(3)探针标记方法 化学法 酶标记法,切口平移法(nick translation labeling),DNA酶I,DNA聚合酶I标记的dNTP,探针平均长度600bp,随机引物法(random

16、primed DNA labeling),随机6-12bp单核苷酸引物,变性,一般探针长度在400-600bp之间,末端标记法(terminal labeling)3末端 5末端,PCR标记法光敏标记法 生物素、地高辛等,光敏基团与生物素结合,化学衍生结合标记法 转氨标记法等,四.DNA序列测定法,(1)化学法(Chemical sequencing)美MaxamGilbert 1977年建立，是唯一能直接应用于双链DNA测序的方法。用此法测定SV40 为5226 bp(2)“加”“减”法(酶法)1977年 Sanger 建立此法，并测174为5386bp(3)双脱氧法(Dudeoxy sequence analyses)双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来终止聚合反应。用此法测得G4含5577bp.,Seq,