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1、检疫性植物病毒的检验方法番茄环斑病毒马铃薯帚顶病毒*其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环 斑病毒,了解检疫性植物病毒的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病毒的检验方法，掌握番茄环斑病毒、马铃薯帚顶病毒引起病害的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及检验措施。,检疫性植物病毒的检验方法,生物学检测技术血清学检测技术电子显微镜技术 分子生物学检测技术,1.生物学检测技术,原理：植物病毒对鉴别寄主或指示植物的特异反应。鉴别寄主谱：对一种病毒有特殊反应的一组寄主，一般包括35种不同反应类型的寄主植物。一般包括：系统侵染的寄主局部侵染的寄主不受侵染的寄主,例1，TMV和

2、CMV在田间烟草植株上都呈花叶症，为了确定是否有TMV，或是将两者区分开，便可通过下列三种植物的接种来确定。,2.血清学检测技术,原理：抗原与抗体的特异结合 方法：免疫电泳和免疫电镜、琼脂双扩散、ELISA等。,两种抗原相同，都与已知的抗血清反应,琼脂双扩散反应沉淀线判断图,抗原1,抗血清,抗原2,抗血清不专化含有两种以上的抗体,抗原2,抗原1,抗原2,抗原1,抗血清,抗血清,两种抗原有一定的亲缘关系但不完全相同,3.电子显微镜技术,原理：以电磁波为光源，利用短波电子流，分辨率达到0.99，比光学镜要高1000倍以上,主要方法：超薄切片、负染技术、免疫电镜技术,4.分子生物学检测方法,分子杂交

3、检测PCR技术检测,分子杂交在DNA和RNA之间进行，依据是RNA与互补的DNA之间存在着碱基的互补关系。在一定的条件下，RNA-DNA形成异质双链的过程称为杂交。其中预先分离纯化或合成的已知核酸序列片段叫做杂交探针(probe)，由于大多数植物病毒的核酸是RNA，其探针为互补cDNA也称为cDNA探针。,植物病毒分子探针具专一性强、灵敏度高、准确快速等优点 分子探针的长度一般在5001500核苷酸碱基对（bp）常用广谱分子探针，即包括多个不同专化性基因的核苷酸片断。,PCR技术检测,PCR（Polymerase chain reaction）聚合酶联反应：将极微量的靶DNA片断，在4h左右特

4、异性扩增上百万倍。植物病毒主要是RNA病毒，进行PCR检测时，需要将RNA逆转录成互补DNA（cDNA)，再进行PCR，即RTPCR技术。,检疫性植物病毒的检验方法番茄环斑病毒马铃薯帚顶病毒*其他检疫性植物病毒 南方菜豆花叶病毒、可可枝肿病毒、香石竹环斑病毒,了解检疫性植物病毒病害的种类、分布及重要性，掌握植物检疫性病原病毒的检验方法，掌握番茄环斑病、马铃薯帚顶病的症状、病原特性、寄主范围、病害的发生发展规律以及这两种病害的检验措施。,番茄环斑病毒Tomato ring spot virus,分布：1936年，美国东部新泽西发生ToRSV至今已有30多个国家和地区发现有该病毒，主要集中在北美温

5、带地区，即美国和加拿大。,寄主：ToRSV寄主范围广，包括双子叶和单子叶植物的35个科，自然界，ToRSV主要侵染木本植物，草本及观赏植物。,危害情况：1975年，ToRSV侵染加拿大安大略的地区葡萄，产量损失7695，甚至造成绝产。同年，ToRSV 侵染后，纽约葡萄严重减产，奥尔良悬钩子果实减产2150。,症状：番茄症状（番茄环斑病）枝条卷曲和坏死，嫩叶、叶柄生褐色坏死环和波纹，果实受侵染，外表产生环斑，灰色到褐色栓皮,葡萄上的症状（葡萄黄脉病）叶黄脉、斑驳、环斑，节间缩短呈莲蓙状丛生，植株严重矮化，果实败育变小，至绝产，几年内植株渐渐坏死。植株剥皮后，可见增厚的海绵状韧皮组织及坏死凹陷,苹

6、果上的症状（apple union necrosis and decline）砧木和接穗接合部肿胀，裂开，剥开树皮，树皮内侧变厚，多孔，愈合斑连接处有不明显的线，在这条线相对方向的形成层表面也有一类似的线，沿着这条线有一小的深沟或一条光滑的细缝，坏死的树皮覆盖在沟或缝上。叶变少，变小，黄化，嫩枝呈束状丛生，果实较小，果皮颜色加深。树皮颜色淡红,桃树和李属其它树种上的症状（桃树黄芽花叶）：沿中脉产生扁椭圆形羽缘状病斑，由灰绿色变为浅绿色，芽发育成为小而变形的丛生叶，成浅黄色而死亡。（桃树茎痘病）：树皮变厚，发软，海绵状，剥开树皮，树干上出现凹陷的痘斑和沟槽。叶片褪绿，叶芽发育推迟，落叶提前，果实

7、畸形，果味变异，提前成熟和脱落。,复盆子上的症状：侵染当季不表现症状，第二年叶片表现黄色斑驳，条纹或脉褪绿，叶片生长推迟，病株表现不结果或形成易碎果悬钩子上的症状：植株矮化，小果并减产，幼龄植株叶片出现褪绿环斑。第二年，叶片症状不明显，但新叶出现偏上性，早落。第三年有1080的果枝死亡。,病原：番茄环斑病毒 学名 Tomato ring sopt virus（ToRSV）异名 烟草环斑病毒2号 Tomato ring spot virus No.2 烟病毒13号 Nicotiana virus 13 桃黄芽花叶病毒 Peach yellow bud mosaic virus 葡萄黄脉病毒 Gr

8、ape yellow vein virus 分类地位 线虫传多面体病毒组 R/1:2.8/44+2.4/41:S/S:S/C,Ve/Ne Nepovirus,病毒特性：等轴对称球形，直径28nm，在烟草汁液中，58 下10min、20 下2d、4 下21d、20 下几个月以后失去侵染力。接种的烟叶和黄瓜子叶汁液，稀释限点为103，而系统侵染的烟草汁液，稀释限点低于101。,生物学特性：稳定性差，难纯化，纯化的病毒制剂中有两类粒体：无RNA的蛋白外壳的T粒体和侵染性核蛋白的B粒体，B粒体具侵染性，二者血清学性质有差异。T粒体分子量3.2106，沉降系数53S，B粒体分子量5.5106，沉降系数1

9、26128S。B粒体RNA分子量2.3106，占粒体重量的40,生理分化：烟草株系：以烟草环斑病毒2号为代表，是典型株系。自然发生在温室的烟草幼苗，主要分布在美国东部。桃黄芽花叶株系：自然发生在杏、扁桃、桃上，分布在美国西部。此株系与Price 的烟草株系较难区分。因为两株系在草本寄主上的症状相似，血清学上无区别，而且大多数分离物在桃树上都产生黄芽花叶症状 葡萄黄脉株系：自然发生在葡萄上，在草本寄主上引起的症状与上述两个株系类似，但可在豇豆上引起顶枯，血清学上也与上述两个株系不同，主要分布在美国西部 其他株系：李属植物上不同分离物（李褐线分离物 Prune brown line，李茎环孔分离物

10、Prunus stem pitting和樱桃叶斑驳分离物Cherry leaf mottle）存在血清学差异，但差异不明显。樱桃叶斑驳分离物不能由Xiphinema californicum传播,传播：田间传播介体是剑线虫属，其中Xiphinema americanum优势种群。成虫和三龄幼虫都能传毒，在病根部饲毒1h可获得病毒，而后在1h内又能将病毒传给接种植物。由繁缕、千日红、悬钩子、大豆、弗吉尼亚草莓、烟草、番茄和红三叶草等植物的种子传播。杂草是重要的田间毒源。远距离传播依靠植物的种子和苗木调运进行,检验方法：生物学检测：黄瓜：局部褪绿斑，而后产生系统褪绿和斑驳苋色藜和昆诺阿藜：小局部褪

11、绿斑，后系统侵染顶端枯死菜豆：局部褪绿斑或坏死斑，系统症状为皱缩和顶叶坏死烟草：局部坏死或环斑，幼叶系统褪绿环纹和斑纹，后隐症矮天牛：局部坏死斑，幼叶坏死和枯萎番茄：局部坏死斑，幼叶产生系统斑驳和坏死豇豆：局部褪绿斑或坏死斑，引起系统侵染，植株顶端坏死,形态学检测：浸渍法制样，电镜观察病毒粒体形态，测量粒体大小。血清学和PCR检测：琼脂双扩散、免疫电镜、酶联免疫吸附技术等。,检疫和防治：禁止从病区引进大豆种子、烟草种子、唐菖蒲球茎及桃、杏、樱桃、葡萄和草莓等植物的无性材料。病区应采用无毒种子和苗木，施用药剂消灭介体线虫，清除杂草减少毒源。,马铃薯帚顶病毒Potato moptop virus,

12、分布：1965年首先在英国发现，现已传入欧美多个国家。日本（1981）、美国（2002）报道。中国未见报道。寄主：马铃薯是唯一的自然寄主。人工接种可侵染多种寄主植物。,危害性：在英格兰，北爱尔兰和苏格兰受侵薯块的产量损失可达26。此外该病为害后，病斑常影响到薯块的外表，是商品价值降低。马铃薯在储藏期间，若储藏不当，病斑在薯块上扩展，进一步影响马铃薯的经济价值。1966年和1967年PMTV在秘鲁曾引起产量损失3040和75。,症状：植株：-帚顶、奥古巴花叶和褪绿V型纹 帚顶症状：节间缩短，叶片簇生，植株矮化，束生奥古巴花叶：不规则黄色斑，环纹和线状纹褪绿V型纹：褪绿V型纹症状,薯块上的症状 初

13、生症状（Primary Symptom）当年受侵薯块所表现出的症状。薯表轻微隆起，产生坏死或部分坏死，直径为15厘米的同心环纹，这种环纹并不局限于某一部分，常互聚在一起或分开。将薯块切开，内部表现为坏死弧纹或条纹，它们向薯块内部延伸，但这种延伸并不一定来自薯表的环纹，其延伸程度似乎与薯表的症状严重程度有关。,次生症状：由病的母薯长成的植株所结的薯块的症状。畸形、大的龟裂，网络状小龟裂，横切面上，表面的坏死环纹环绕薯块，内部的坏死和这些效相连接，髓部的坏死斑常延伸至薯块端部的生殖根上。,病原：马铃薯帚顶病毒 学名 Potato mop-top virus异名 Chlorogenus solani

14、,Potato virus 11,Solanum virus 15 potato witches broom agent分类地位 小麦土传花叶病毒组(Furovirus)成员,病毒特性：直杆状，100300nm1620nm，沉降系数为126S、171S和236S。外壳蛋白亚基呈螺旋状排列，螺距2.42.5nm，单链RNA，病毒的致死温度为7580，稀释限点为103104，体外存活期10周以上（20）。核酸：可能为单链RNA,发病规律：可汁液传染，50的病块茎可将病毒传给下一代。田间主要通过马铃薯粉痂病菌（Spongospora subterrance）传播，病毒在休眠孢子囊中，至少存活1年，孢

15、子囊萌发产生的游动孢子侵入寄主时，将病毒粒体带入马铃薯根部。病害在多雨年份发生较重。远距离通过带病或带菌的种薯调运而传播。,检验方法：隔离试种，观察系统症状。用病叶汁液接种鉴别寄主。苋色藜：产生局部坏死坏斑或细环纹，可扩大到全叶。普通烟：在20以下时，接种叶上产生局部坏死或褪绿环斑。检疫和防治：（1）实施检疫，禁止疫区马铃薯种薯进境。（2）病区需实行轮作，倒茬，播种无病种薯，防治粉痂病。,复习思考题,1.解释概念：鉴别寄主、鉴别寄主谱、枯斑寄主、初生症状、次生症状、PMTV、ToRSV2.检疫性植物病毒的检验方法主要有那些？3.以番茄环斑病毒为例，说明危险性病原病毒的主要传播途径及其与检疫的关系。4.PMTV在马铃薯上引起的主要症状有那些？5.ToRSV引起的主要病害有那些？6.试述PMTV、ToRSV的传播途径7.ToRSV已经明确的株系有那些？,