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1、1,纤维化(fibrosis)可发生在多种器官，导致器官结构破坏和功能减退，乃至器官衰竭。器官纤维化(organ fibrosis)一直是世界医学的研究热点之一。,2,慢性肾脏病的主要病理特征为细胞外基质过度沉积，广泛的纤维化。最终导致终末肾功能衰竭的共同通路。肾纤维化的范围和程度与肾功能缺陷具有高度的相关性。,3,4,5,肺纤维化是各种内外致病原引起慢性肺疾病的共同结局,病理过程是肺组织损伤修复失调导致大量细胞外基质重构、过度沉积，最终导致肺组织结构改变和功能丧失。,6,7,肝纤维化：肝脏炎症感染（病毒、细菌、真菌、寄生虫）、毒素损害、肝血流改变、许多先天性代谢异常引起物质在肝脏贮积都可导致

2、肝纤维化，损害肝脏功能。,8,9,10,骨髓纤维化表现为骨髓中胶原、纤维连接蛋白、层粘连蛋白等纤维组织的异常沉积，代替正常的骨髓造血组织，从而严重影响造血功能。,11,12,13,心血管纤维化：心肌的进行纤维化伴随心肌（心室）重构和心脏功能减退。动脉硬化是动脉纤维增性病变，导致血管壁增厚、僵硬而失去弹性和管腔变小。,14,15,16,常见器官纤维增生性疾病和综合症,17,器官纤维化的发生是组织修复过程过度、过强及“失控”时，过量的细胞外间质（extracellular matrix，ECM）成分沉积在组织内，导致器官纤维化。,18,一、概念,是指由于各种慢性刺激因素(炎症、免疫、毒素、缺血及血

3、流动力学改变等)导致器官实质细胞发生坏死，纤维结缔组织，包括细胞成分和细胞外基质(extracellular matrix ECM)异常增多和过度沉积的病理过程。程度较轻者称为纤维化，重者引起组织结构破坏而发生器官硬化(organ scarring)。,19,纤维化器官其组织内沉积的纤维结缔组织包括细胞成分和ECM两大部分。,组织的实质细胞、成纤维细胞和单核吞噬细胞等,胶原、非胶原糖蛋白、蛋白聚糖和弹性纤维等。,20,纤维化时ECM沉积既有原来基质成分的增多，又出现新的成分。,21,器官纤维化发生机制从过去病理组织学研究发展到细胞和分子水平的研究。不同器官纤维化发生机制各有其特点，但基本病理过

4、程相同。纤维化过程涉及多种细胞、细胞因子和ECM等多个方面。,二、纤维化产生的细胞与分子基础,22,组织修复失调或组织修复过度的原因是局部组织微环境改变所致。,23,局部组织微环境的改变:,化学趋化因子及其受体表达增加；促纤维化细胞因子表达增加，抑纤维化细胞因子表达减少；氧化应激反应被激活；脂代谢产物廿烷酸被激活、廿烷酸产生失衡和纤溶系统活性受损等;金属基质蛋白酶/金属基质蛋白酶组织抑制剂（MMPs/TIMPs）表达失衡.,24,25,ECM产生细胞,MFB,ECM沉积,巨噬细胞活化,化学趋化物质,细胞损伤,聚集、释放细胞因子,增生、表型转化,ECM合成增多、降解减少,26,纤维化的形成涉及到

5、:细胞 细胞因子 细胞外基质（ECM）多种因素、多个环节之间相互作用和相互调节的复杂过程，最终的结局是大量ECM沉积。,27,(一)细胞学基础,28,创伤、炎症、免疫、毒物、缺血及血流动力学改变等引起实质细胞损伤，实质细胞的变性、坏死和炎症，释放细胞炎性介质。,1 实质细胞,29,2 巨噬细胞,30,巨噬细胞聚集到损伤的局部：损伤的开始阶段，局部组织细胞可释放一系列趋化物质，导致巨噬细胞局部浸润，及局部增殖。,31,活化的巨噬细胞在纤维化中作用：活化的巨噬细胞本身能产生大量细胞因子，参与纤维化的进程；使ECM产生细胞增加 TGF-、血小板源性生长因子（PDGF）、结缔组织生长因子(CTGF)、

6、成纤维细胞生长因子（EGF)的分泌；巨噬细胞自身能产生和分泌I型胶原、FN、硫酸软骨素等ECM成分，直接参与纤维化的形成。,32,肝细胞慢性损伤刺激活化枯否细胞，活化的枯否细胞通过释放的细胞因子(如TGF-、IL-1、PDGF和TNF等)的作用再使肝脏星形细胞（HSC）活化。,33,3、ECM产生细胞,在纤维化形成过程中，组织内有多种细胞参与ECM的产生，这种细胞被称为ECM产生细胞(ECMproducing cells)。主要是一些间充质细胞(mesenchymal cells)。在病理情况下，各器官一些实质细胞受到细胞因子刺激，可转变为ECM产生细胞。,34,器官 细胞外基质产生细胞 专职

7、 非专职 肝脏 门管区成纤维细胞 星状细胞（HSC）肾脏 间质成纤维细胞 肾小球系膜细胞 肾间质纤维母细胞 肺 间质成纤维细胞 肺泡纤维母细胞 胰腺 间质成纤维细胞 星状细胞 心脏 间质成纤维细胞 原始间充质细胞,35,细胞外基质产生细胞的活化,正常时细胞外基质产生细胞处于静息状态。在病理情况下ECM产生细胞形态发生改变，并进入细胞增殖周期，合成分泌细胞因子、大量细胞外基质等功能，这一系列变化被称为活化。,36,ECM产生细胞活化表现：,形态变化功能改变表型转化,37,活化的星形细胞胞体变大、突起形成显著、细胞内粗面内质网及高尔基复合体发达，反映了蛋白合成功能旺盛。胞内脂肪滴的消失，维生素A的

8、含量减少。同时由于细胞内肌动蛋白细丝合成增加，增强了星形细胞的收缩能力。,38,活化的HSC除了增加基质成分的合成外，还能调节ECM的降解，在肝纤维化的进程中起核心作用。,39,40,胞浆内含有大量排列成束的微丝、肌动蛋白和粗面内浆网，主要表达-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA），合成细胞外基质的功能明显加强，表明已转化为肌成纤维细胞(MFB myofibroblast)。,41,许多因素参与ECM产生细胞活化过程的调节，细胞因子起主要调节作用。,42,4 肌成纤维细胞 MFB,ECM产生细胞在一定条件下可发生表型转化，转化为表达-SMA的MFB。,在机体发育

9、的不同阶段或在不同疾病状态下，细胞的形态、结构与功能可发生改变，称为表型转化(phenotype conversion)。,43,MFB兼有平滑肌细胞和纤维母细胞二者的特性，既含有引起收缩的微丝样结构，又能产生胶原等ECM成分，在创伤愈合过程中促进创面收缩和组织硬化。MFB：主要表达-SMA(-smoothmuscle actin），是MFB活跃的标志性抗原。MFB通过分泌细胞因子、趋化因子、生长因子、ECM和蛋白酶等而发挥生物学作用。,44,ECM产生细胞均是MFB的主要来源细胞。,45,MBF细胞也可来自组织实质细胞转分化。一种分化完全的细胞丧失其原有的表型特点而转变为其他类型细胞的现象称

10、为转分化(transdifferentiation)。,46,在一定条件下肾小管上皮细胞可转分化为肾间质MFB。发生在肾小管的转分化称为上皮细胞间充质细胞转分化或小管上皮细胞MFB转分化。是细胞表型转化的一种方式。,47,研究MFB的病理表型特征及其关键细胞内信号转导途径和调控规律，对深入认识纤维化发生的分子机制至关重要。,48,（二）细胞因子的作用,49,参与器官纤维化形成的常见细胞因子有：转化生长因子-TGF-(transforming growth factor-)结缔组织生长因子CTGF(connective tissue growth factor)血小板源性生长因子PDGF(pla

11、telet-direved growth actor)碱性纤维母细胞生长因子bFGF(basic fibroblast growth factor)表皮生长因子 EGF(epidermal growth factor，)IL-1、IL-6、IL-8、TNF-、IFN-等,50,它们可来自浸润的炎症细胞(中性粒细胞和单核巨噬细胞等)，也可来自血小板和组织的固有细胞。,51,细胞因子参与纤维化过程大致可分为3种情况：参与局部损伤和炎症反应:TNF-、IL-1和IL-8等；参与组织修复和纤维化的进展:TGF-、CTGF、PDGF、IGF-1及bFGF等；抗损伤和抑制纤维化的作用:肝细胞生长因子(he

12、pacyte growth factor，HGF)、IFN-r等。,52,1 转化生长因子-TGF-,属于一组调节细胞生长和分化的TGF-超家族。有广泛的生物学作用:调节细胞生长、分化、凋亡、迁移、黏附、基质形成，以及损伤修复等。在促纤维化作用是细胞因子中最强的。,53,TGF-是由两个分子量为12.5 kD的亚基通过二硫键连接而成的同源二聚体，二聚体形式的TGF-才具有生物活性。哺乳动物主要有TGF-1、TGF-2和TGF-3的3种形式，三者的生物学作用基本相似，其中以TGF-1最重要。,54,刺激ECM产生细胞合成大量ECM；通过抑制ECM降解酶基质金属蛋白酶(MMPs)、纤溶酶原激活物(

13、PA)的活性；增强这些降解酶的抑制物活性，从而减少ECM的降解；,TGF-可通过多个环节和机制导致ECM过度积聚和纤维化形成:,55,促进ECM产生细胞表型转化，转变为MFB，后者能合成和分泌大量胶原等ECM成分；增加ECM受体表达，从而促进ECM与细胞间的相互作用。与其它细胞因子协同发挥生物学效应，促进纤维化。,56,TGF-诱导ECM产生的信号转导途径基本过程是：FGF-配体 膜受体 SMAD蛋白 转录因子 基因表达。,57,2 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF),CTGF蛋白是一种富含半胱氨酸的分泌性多肽。,在创伤愈合、器官纤维化

14、发生中已观察到结缔组织生长因子的过度表达。,58,在CTGF的启动子145至157核苷酸序列中存在TGF-应答元件。CTGF可能在与 TGF-其下游起作用,59,近年研究证明，在CTGF启动子中有SMAD结合位点，TGF-通过SMAD途径诱导CTGF转录。,炎症损伤,TGF-,SMAD,CTGFmRNA,CTGF,细胞增殖间质增多,纤维化,60,CTGF在纤维化形成中的作用：,促进细胞增殖、粘附、迁移、整合素表达 促使、型胶原和 FN 等ECM的合成 在创伤愈合、皮肤、肾脏、肝脏、心脏、肺脏和胰腺纤维化以及粥样硬化的动脉，均观察到呈高表达的CTGF。,61,CTGF作为TGF/SMADs途径的

15、下游介质参与病理性纤维化进程。阻断CTGF的产生及其促纤维化效应可能为今后病理性纤维化的治疗提供了一个新靶点。,62,3 其它致纤维化细胞因子,TNF为多功能性多肽，在炎症、免疫和肿瘤发生过程中具有重要调节作用。有TNF-和TNF-两种。TNF-与其受体相结合可激活许多信号转导途径，由此引起多种转录因子、细胞因子、生长因子、受体、炎症介质等的表达。TNF是体内关键的促炎因子，主要由单核巨噬细胞产生，,TNF-,63,TNF-具有聚集炎症细胞的作用，对单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)等具有上调作用，从而促使巨噬细胞等炎症

16、细胞迁移至受累部位；TNF-能刺激纤维母细胞增殖，促进胶原合成，在肝脏可促进HSC增殖并向MFB转化；,64,血小板源性生长因子(PDGF),PDGF是一类具有促分裂和增殖活性的生长因子，能刺激间叶来源的细胞分裂、生长,是纤维母细胞的有丝分裂原。,65,PDGF是促使ECM产生细胞DNA合成和细胞增殖最有效的有丝分裂原。PDGF能促使纤维母细胞转化为MFB。,66,碱性纤维母细胞生长因子(bFGF),bFGF具有多种生物学功能，是重要的促有丝分裂因子，能促进纤维母细胞的有丝分裂、增殖和分化，是纤维化的启动因子。,67,bFGF可刺激潜活性TGF-释放；bFGF作为纤维母细胞增殖的强诱导剂，能刺

17、激纤维母细胞增殖，并能诱导-SMA的表达；bFGF还能明显增加 I 型和型胶原mRNA的表达。,68,白细胞介素-1(IL-1),IL-1是单核巨噬细胞分泌合成的一种前炎症细胞因子，分为IL-1和IL-1两种亚型，在组织急性损伤中起重要作用。,69,IL-1能诱导炎症细胞因子(如IL-6)、趋化因子、粘附分子、急性期蛋白和组织蛋白酶等的合成，对嗜中性粒细胞、巨噬细胞具有趋化和促进释放炎症介质的作用；IL-1能刺激纤维母细胞增殖和产生ECM成分。,70,激活素,激活素(activin)具有多种生物学功能，属于TGF-超家族的成员。激活素参与机体炎症反应和组织损伤修复过程，其过量表达可能与器官纤维

18、化形成有关。,71,4 抑制纤维化的细胞因子,纤维化形成过程中，细胞在产生致纤维化细胞因子的同时，也释放一些抑制纤维化的细胞因子，如肝细胞生长因子(HGF)和IFN-，它们具有抑制纤维化发生发展的作用。,72,肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF),HGF是由728个氨基酸组成的多肽，为一异二聚体，由轻链和重链组成。属不耐热多糖蛋白。,73,HGF主要由间质细胞（如成纤维细胞、巨噬细胞等）产生。HGF通过与特异性膜受体结合而发挥其多样生物学作用，调控细胞生长、分化，促有丝分裂活性，促进细胞扩散迁移,诱导多种上皮细胞形成分支管状结构。,74,HGF对肝细胞和多

19、种上皮细胞具有很强的促增生作用。HGF可对抗TGF-的许多生物学活性，具有抑制纤维化的作用：,HGF能增加MMP的表达和减少TIMP-1和TIMP-2的表达；HGF能抑制TGF-表达；,75,干扰素,IFN-是重要的免疫调节因子。,76,研究表明，IFN-能明显抑制博莱霉素诱导的小鼠肺病理改变和肺纤维化区TGF-蛋白表达，降低前胶原纤维I和 mRNA表达及羟脯氨酸含量的增加。,77,IFN-能抑制HSC增殖和激活，降低-SMA、I、胶原及FN mRNA表达水平。IFN-能影响I和型胶原的合成，使培养的纤维母细胞胶原产量下降，其作用部位发生在前胶原mRNA。IFN-用于人肝纤维化治疗已取得较好疗

20、效。,78,（三）血管活性物质的作用,1 肾素血管紧张素系统（RAS）,79,是作用于循环系统激素，具有调节血容量和血压中起重要作。近年发现它也是一局部内分泌系统。局部RAS并不依赖于循环中的肾素、血管紧张素和血管紧张素转换酶(ACE)，而是独立地通过自分泌和旁分泌的方式发挥生理和病理作用。,80,Ang除具有调节血流动力学的作用外，最近发现它还作为一种生长因子和促纤维化因子影响细胞的增殖和分裂，即非血流动力学作用。,81,影响全身及肾脏的血流动力学，升高肾小球内压力，导致肾小球硬化；诱导肾小球系膜细胞及肾间质纤维母细胞的增殖和肥大，活化肾固有细胞和肾间质纤维母细胞，增加ECM蛋白的表达和合成

21、，引起ECM积聚；,Ang在肾小球硬化和肾间质纤维化的作用机制：,82,刺激TGF-和PAI-1的表达，从而减少ECM的降解；对单核细胞具有趋化作用，增加趋化因子的表达；,83,AngII,PAI1,TGF-,ECM降解,ECM合成,ECM积聚,纤维化形成,84,RAS在心肌纤维化及心室重塑中的作用：心脏除受循环中RAS的作用外，还受心血管局部RAS的影响。Ang可以自分泌或旁分泌的方式作用于心肌和血管的特异性受体，通过多种信号转导途径影响心血管功能。,85,在体外培养的人HSC已发现有Ang1型受体存在，Ang能刺激HSC增殖和收缩。,86,2 内皮素(endothdin，ET),主要由血管

22、内皮细胞合成，通过自分泌或旁分泌等方式发挥生物学作用。人和哺乳动物体内有3种ET(ET-1、ET-2和ET-3)和3种受体。ET在肾脏、心脏、肝、肺等器官纤维化发生发展中有重要作用。,87,ET通过血流动力学和非血流动力学途径参与肾脏纤维化的发生：引起肾小球血管收缩，升高肾小球内压力；刺激系膜细胞增殖和合成ECM，释放TNF、PDGF及刺激肾髓质产生超氧阴离子和过氧化氢等；升高TIMP的水平，减少ECM降解；,88,具有血管紧张素转换酶（ACE）样活性，可使组织局部Ang合成增加，后者反过来刺激内皮细胞合成更多的ET-1；上调TGF-表达，ET-1可通过直接刺激肾脏纤维母细胞增殖、增加ECM合

23、成及减少胶原酶活性而促进肾问质纤维化。,89,ET对心肌纤维化的作用表现：,ET可促进心肌细胞合成和释放Ang。ET具有ACE样活性，可促进 Ang I 转化为Ang。ET可引起肾上腺释放醛固酮，其作用比Ang强，ET是醛固酮合成与释放的强效调节剂；ET可促进心肌纤维母细胞增生和胶原蓄积，降低胶原酶活性。,90,（四）组织纤维化免疫机制研究,新近研究发现，TLRs介导的Th1/Th2平衡失调，在各种组织纤维增生性疾病发生和发展过程中均发挥了关键作用。,91,Th1和Th2型免疫反应对组织损伤后组织纤维化的发展起至关重要的作用。,损伤导致组织免微环境的改变，发现产生Th1型反应有利于损伤组织的修

24、复和再生，炎症消退没有明显的纤维化发生；朝向Th2型反应方向发展则促进组织纤维化和组织重构的发生，形成进行性纤维化。,92,93,雌激素、应激激素包括糖皮质激素以及肾上腺素等通过调节系统和局部的促/抗炎性因子的平衡，参与调节免疫反应，与纤维增生性疾病的发生发展有密切的关系。,94,儿茶酚胺类激素抑制IL-12、IFN-等Th1型细胞因子的分泌，刺激产生IL-10、IL-4、TGF-等Th2型细胞因子。正是由于应激激素促进Th2型免疫反应，才使得长期处于紧张、焦虑状态的人群更容易患纤维增生性疾病,95,雌激素、糖皮质激素和应激激素通过其调节Th1/Th2免疫反应平衡，参与组织纤维增生性疾病的发生

25、和发展,96,女性体内生理浓度雌激素促进Th1型细胞因子释放和表达，表现为增强免疫反应。孕期妇女体内雌激素量显著增加，促进Th2型细胞因释放。此时有利于受精卵的子宫着床和正常妊娠。更年期妇女替代疗法服用外源性雌激素达到药理浓度，引起的Th2型免疫反应增强会造成这部分人群更易患纤维增生性疾病。,97,总之：纤维化发生发展是趋化因子、细胞因子、血管活性物质、粘附分子、细胞凋亡、氧化应激、激素、一氧化氮以及某些ECM成分等，相互交织作用。,98,三 细胞外基质的组成与代谢,ECM extracellular matrix，是由大分子构成的错综复杂的网络。为细胞的生存及活动提供适宜的场所，并通过信号转

26、导系统影响细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化。ECM是处于不断合成和降解的动态过程中。,99,细胞外基质的组分及组装形式与组织的特殊功能需要相适应：角膜的ECM为透明柔软的片层，肌腱的坚韧如绳索。,100,ECM的主要生物学作用,影响细胞生长,决定细胞的形状,控制细胞的分化,参与细胞的迁移,101,无论在胚胎发育的形态发生、器官形成过程中，或在维持成体结构与功能完善的一切生理活动中均具有不可忽视的重要作用。,102,（一）细胞外基质的构成,ECM：纤维网络凝胶样基质纤维网络胶原蛋白弹性蛋白 纤粘连蛋白层粘连蛋白凝胶样基质糖胺聚糖蛋白聚糖,103,细胞外基质的组成与结构,104,1胶原蛋白

27、(collagen),胶原是动物体内含量最丰富的蛋白质，占人体蛋白质总量30以上。它遍布于体内各种器官和组织，是细胞外基质中的框架结构。主要由成纤维细胞、软骨细胞、成骨细胞及某些上皮细胞合成并分泌到细胞外。,105,106,成纤维细胞周围的胶原纤维,107,已发现的胶原至少有19种，由不同的结构基因编码，具有不同的化学结构及免疫学特性。,108,胶原的类型、结构和分布,109,几种主要胶原及其特征,110,按胶原在体内的分布和功能可分3类：,间质胶原 主要包括 I、和 型胶原 等，分布在细胞或组织之间；基膜胶原 主要是 型胶原，是基膜的支 架结构；细胞外周胶原 主要是 V 和 型胶原，以无定形

28、状态围绕在细胞周围。,111,各型原胶原分子都由3条相同或不同的-肽链组成，每条-肽链约含1000个氨基酸残基。前胶原每条链由Gly-X-Y序列重复构成。Gly-X-Y序列使链卷曲为左手螺旋。三股链再绕成右手超螺旋。含有三种结构区：螺旋区，非螺旋区及球形结构域。其中型胶原的结构最为典型。,112,113,胶原的合成装配,114,Structures of the collagen,原胶原间共价交联，呈阶梯状排列，形成胶原纤维，在电镜下可见间隔67nm的横纹。,115,TEM image of collagen,116,型胶原的原胶原是由两条1（)链和一条2()链组成，即为1()22()链；型胶

29、原的原胶原是由3条相同的1()链组成，即为 1()3 链。,117,I型胶原是器官纤维化时病变部位沉积的主要ECM成分。I型胶原基因表达主要由细胞因子和生长因子调控，如TGF-、TNF-和IFN-等，最重要的是TGF-。在型胶原基因启动子上已鉴定出TGF-、TNF-、IFN-、糖皮质激素及视黄酸等的应答元件.,118,TGF-对型胶原基因表达的调控主要发生在转录水平。TGF-通过核蛋白因子与相应TGF-应答元件(TbRE)结合，激活1()胶原基因的表达。,在病理条件下，TGF-通过提高多种核转录因子与 I 型胶原基因相应DNA调控序列(顺式调控元件)的结合活性，促使 I 型胶原基因激活并呈高水

30、平转录。,119,2糖胺聚糖(GAG)与蛋白聚糖,细胞外基质的物理性状主要受蛋白聚糖的多糖基团影响。蛋白聚糖是由糖胺聚糖与蛋白质共价连接形成的复合物。,120,糖胺聚糖(GAG),重复二糖单位构成的无分枝长链多糖 氨基已糖（氨基葡萄糖或氨基半乳糖）二糖单位 糖醛酸(硫酸角质素中糖醛酸由半乳糖代替),121,糖胺聚糖依组成糖基、连接方式、硫酸化程度及位置的不同可分为六种,122,氨基聚糖的分子特性及组织分布,123,124,除透明质酸（hyaluronic acid,HA）及肝素外，其他糖胺聚糖均不游离存在，而与核心蛋白质共价结合构成蛋白聚糖。,125,透明质酸 是唯一不发生硫酸化的糖胺聚糖，糖

31、链特别长，含10万个糖基。表面有大量带负电荷的亲水性基团,能与水结合，使基质膨胀，起润滑剂作用，使细胞易于迁移。在胚胎发育早期和组织创伤修复时，细胞外基质中的透明质酸特别丰富，对细胞迁移和分化、创伤的愈合有特殊作用。细胞迁移结束，多余的透明质酸酶降解。,126,HA虽不与蛋白质共价结合，但可与许多种蛋白聚糖的核心蛋白质及连接蛋白质借非共价键结合而参加蛋白聚糖多聚体的构成，在软骨基质中尤其如此。,127,硫酸软骨素 是哺乳动物体内最丰富的糖胺聚糖，大量存在于软骨，亦存在于皮肤、角膜、巩膜、骨、动脉、心瓣膜及脐带中。其重复二糖单位由葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基半乳糖组成。,128,硫酸皮肤素 存在于皮

32、肤、血管、心、心瓣膜、肌腱、关节囊、纤维软骨、韧带及脐带等组织中。与核心蛋白质的连接方式与硫酸软骨素接近，因此曾被称为硫酸软骨素B。,129,硫酸角质素 具有两种不同的类型。来自角膜的硫酸角质素是角膜中主要的糖胺聚糖，来自骨、软骨及髓核等支架组织的硫酸角质素常与硫酸软骨素一起构成蛋白聚糖。,130,肝素及硫酸乙酰肝素 肝素由紧靠血管的肥大细胞产生，并贮存于肥大细胞的颗粒中，应一定的刺激而释放，具有抗凝血作用。,131,硫酸乙酰肝素,普遍存在于各种细胞的表面，参与膜结构以及细胞之间和细胞与基质之间的相互作用。硫酸乙酰肝素的核心蛋白质的肽链中存在疏水性区域，可嵌入细胞膜的脂双层中，可作为细胞膜的结

33、构成分。,132,蛋白聚糖,定义 蛋白聚糖是多条糖胺聚糖GAG（除透明质酸）与一条核心蛋白质的共价结合物。,133,蛋白聚糖的结构,134,特点 糖占比例大，约一半以上，具有多糖性质。,分布分布于软骨、结缔组织、角膜基质、关节滑液、粘液、眼玻璃体等组织。,135,一个核心蛋白质分子上可以连接多条GAG链。与一个核心蛋白质分子相连的GAG链可以是同种或不同种的.,许多蛋白聚糖单体常以非共价键与透明质酸形成多聚体。,136,蛋白聚糖多聚体,蛋白聚糖单体,连接蛋白,透明质酸,137,蛋白聚糖；蛋白聚糖多聚体；糖胺聚糖,138,蛋白聚糖的功能,构成细胞外基质在基质中蛋白聚糖和弹性蛋白、胶原蛋白以特殊方

34、式连接，构成基质的特殊结构。参与细胞的粘附、迁移、增殖和分化等功能。,其它功能抗凝血（肝素）参与细胞识别与分化（细胞表面的硫酸素）维持软骨机械性能（硫酸软骨素）等,139,蛋白聚糖有高度亲水性，形成水化性胶质，填充于ECM的纤维网架间隙，起支撑作用。是一种多聚阴离子，带大量负电荷，参与一些特殊结构（肾小球基底膜）的电荷屏障作用。,140,4糖蛋白,糖蛋白(glycoprotein)是由一种或多种短的寡糖链以共价键连接到肽链上的蛋白质。,141,142,糖蛋白寡糖链的功能,1.对糖蛋白新生肽链的影响 参与新生肽链折叠并维持蛋白质正确的空间构象；影响亚基聚合；糖蛋白在细胞内的分拣和投送。2.对糖蛋

35、白的生物活性的影响 保护糖蛋白不受蛋白酶的水解，延长其半衰期3.参与分子的识别作用,143,蛋白多糖与糖蛋白的区别 蛋白多糖 糖蛋白糖链含量：较蛋白质部分多 一般少于蛋白质，少数可较多糖链组成：主要为糖醛酸、不含糖醛酸，含N-乙酰氨基己糖、N-乙酰氨基己糖 甘露糖、半乳糖，末端为 唾液酸及岩藻糖糖基排列：二糖分子连成长链 大多为分支寡糖链与肽链连 一般为O-糖苷键连接 O-糖苷键或N-糖苷键连接接方式：有时可游离存在分布：主要在细胞外，各种 分布广泛，细胞内外皆有 结缔组织基质中生理功能：以维持结缔组织的 作用广泛，许多粘蛋白、血 功能为主 浆蛋白、膜蛋白等结构蛋白 均为糖蛋白。,144,EC

36、M的分布,基膜 是一层厚约40400nm特殊的ECM。主要由IV型胶原、非胶原糖蛋白与基质中的纤维直接连接，保持组织间的相互作用。主要成分：IV型胶原、内皮粘连蛋白、LN及蛋白聚糖。组成超分子网状结构。,145,Basal lamina,146,间隙结缔组织 是由胶原等异源性物质组成的复杂的网状结构。位于ECM和特化组织（骨、软骨）等部位。主要成分是胶原。I型III型胶原存在大多数结缔组织中，软骨中主要是V型和VI型。还含FN弹性蛋白、腱蛋白和各种蛋 白聚糖。,147,（二）细胞外基质对细胞的影响,ECM不仅仅为细胞提供支撑和连接位点，对维持细胞的正常形态结构、粘附、迁移、分化、增殖、生长以及

37、信号转导、基因表达的调控等也具有重要影响。,148,器官纤维化时，不仅ECM沉积的量增加，而且其组成成分和构型等均发生改变，使ECM产生细胞处于持续激活状态，促使纤维化进一步发展。因此，了解ECM对ECM产生细胞的作用及其机制，可能为治疗器官纤维化提供新的对策。,149,ECM与细胞的相互作用是通过粘附分子介导，整合素(integrin)在这一过程具有重要意义。整合素是一分布在细胞表面的跨膜糖蛋白，是ECM蛋白的主要受体，属于粘附分子家族，通过粘附蛋白配体介导细胞-ECM或细胞细胞间的粘附及细胞内外信号转导。,整合素,150,151,整合素,是由和链组成的异源二聚体，和链均由胞外区、跨膜区和胞

38、内区三部分组成。组合至少构成19种整合素分子。根据链不同分为3类：1亚家族在各种细胞表面表达；2亚家族称为白细胞整合素，主要在白细胞表面表达；3亚家族主要在内皮细胞和血小板表面表达.,152,153,154,整合素介导细胞-ECM及细胞间粘附表现3个方面：细胞-ECM粘附：大部分整合素可识别精-甘-天冬(RGD)三肽序列，大多数ECM蛋白都含有RGD序列，因此，整合素可与ECM蛋白结合，介导细胞与ECM的相互作用。一种整合素可与多种ECM蛋白结合，一种ECM蛋白又可被多种整合素识别。,155,基质与细胞骨架的连接：整合素的胞内部分较短，可以借助-辅肌动蛋白、踝蛋白(talin)及纽蛋白(vin

39、culin)与细胞骨架成分相连接，能使机械力在基质与细胞骨架之间进行传递，ECM成分的改变可直接影响细胞的形态、表型、粘附和迁移等功能。,156,细胞间粘附：某些整合素则与细胞膜上的免疫球蛋白超家族蛋白成分如ICAM-1，ICAM-2及VCAM-1等结合，从而介导细胞-细胞间的粘附。,157,整合素除了介导基质细胞的相互作用、参与粘附功能外，还可作为介导信号传递的膜分子，通过细胞外区与ECM结合，细胞内区与细胞骨架连接，将细胞外信号传人细胞内，调节细胞的生理功能；整合素还能将细胞内信息向外传出，调节ECM-细胞粘附的特异性及亲和力。,158,蛋白聚糖,基质中含有大量透明质酸，可与细胞表面的透明

40、质酸受体结合，影响细胞与细胞间的粘附、迁移、增殖和分化等细胞生物学行为。,159,糖蛋白的功能十分广泛。寡糖链不仅能影响蛋白的构象、聚合、溶解和降解，在细胞识别、信号传递中起关键作用。淋巴细胞正常情况应归巢到脾脏，而切去唾液酸后，结果归巢到了肝脏。糖蛋白寡糖链末端的唾液酸残基，决定着某种蛋白质是否在血流中存在或被肝脏除去的信息。,糖蛋白,160,（三）细胞外基质的代谢,ECM降解酶活性受抑制是引起ECM在组织内不断沉积，进而导致纤维化的又一重要机制。,161,降解ECM的蛋白降解酶类至少有6种,丝氨酸蛋白酶：包括胰蛋白酶、凝血酶、纤溶酶、尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)和组织型纤溶酶原激活物

41、(t-PA)等，此类酶能降解蛋白聚糖和糖蛋白。半胱氨酸蛋白酶：如组织蛋白酶B、D和L，也能降解蛋白聚糖和糖蛋白；,162,基质金属蛋白酶类：(matrixmetalloproteinases，MMPs)对ECM有广泛降解作用，是调节ECM动态平衡的重要酶类；天门冬氨酸蛋白酶：脯肽酶：以脯氨酸羟脯氨酸为酶切位点；糖苷酶：透明质酸酶、肝素酶。,163,1 丝氨酸蛋白酶类,包括纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原激活物(PA)和纤溶酶原激活物抑制物(PAIs)。,164,PAIs,纤溶酶原,纤溶酶,PA,纤维蛋白原 纤维蛋白 ECM成分,降解,_,165,1）纤溶酶原激活物 PA,主要生理功能催化纤溶酶原(p

42、lasminogen)活化，水解血栓或组织内生成的纤维蛋白。PA和纤溶酶可使酶原型MMPs活化，发挥降解ECM的作用，故PA活性升高具有减轻组织纤维化的作用。,166,PA和纤溶酶,酶原型MMPs,活化MMPs,降解ECM,167,PA可分为t-PA（组织型）和u-PA（尿激酶型）t-PA由527个氨基酸组成，分子量约68 kD。与纤溶酶原、纤维蛋白形成复合物而使纤溶酶原活化。当体内出现纤维蛋白或血栓时，t-PA能有效地激活纤溶酶原，溶解局部的纤维蛋白或血栓，不引起系统性纤维蛋白溶解。,168,u-PA 有单链和双链两种形式，单链u-PA是双链u-PA的前体。在纤溶酶或激肽释放酶的作用下，单链

43、u-PA被水解后形成双链u-PA。u-PA还能激活MMP-2和1型膜型基质金属蛋白酶(MT l-MMP)。,169,2）纤溶酶原激活物抑制物,纤溶酶原激活物抑制物（PAIs)有3种亚型，即PAI-1，PAI-2和PAI-3，其中以PAI-1的作用最强。PAI-1是PA有效的生理抑制剂，其活性中心与PA形成11复合物，使PA失活，从而抑制其后的级联反应。,170,PAI-1水平的升高和活性增强能有效抑制ECM降解。PA和PAI-1是ECM转换的主要调控者，二者之间的比例和平衡决定着ECM转换的结局。,171,PAI-1抑制PA活性，进而减少纤溶酶的生成和纤维蛋白的降解；作为u-PA的抑制剂，PA

44、I-1可抑制u-PA诱导的由MT1-MMP介导的MMP-2的活化。,PAI-1致纤维化作用通过两个途径实现：,172,纤溶酶原,纤溶酶,uPA tPA,PAI-1,酶原型MMPs,酶原型MT1-MMPs,活性型MT1-MMPs,活性型MMPs,纤维蛋白纤连蛋白层粘蛋白,可溶性多肽,胶原,_,uPA,uPA,_,_,173,2 基质金属蛋白酶类(MMPs),MMPs是一类含有Zn2+、活性依赖Ca2+的结构高度同源的内肽酶的总称，因含有金属离子而得名。MMPs是最重要一类降解ECM的蛋白酶类，因为MMPs直接以酶原形式分泌到ECM中；MMPs的表达及活性受严格调控，在ECM重构的部位易于诱导表达

45、；MMPs中的某些成员是迄今发现的唯一能分解纤维性胶原的蛋白酶。,174,1）根据MMPs的作用底物可分为5类,(1)胶原酶：collagenase，包括MMP-1、MMP-8、MMP-13和MMP-18。MMP-1称间质胶原酶(interstitial collagenase)，MMP-8嗜中性粒细胞胶原酶。,175,胶原酶的主要水解底物是纤维性胶原，即 I、和 型胶原。分别作用于1()链上的G1y775Ile776和2(工)链上的G1y775一Leu776之间的肽键，将I型胶原水解成14 和 34片段。,176,(2)明胶酶gelatinase,包括MMP-2和MMP-9主要水解底物是变性

46、胶原(如明胶)、基膜的主要成分型和V型胶原等，又称型胶原酶(type collagenase)。它们作用于1()链上的G1y446一Ile447位点和2()链上的C1y464Leu465位点，将型胶原降解成14和34片段。,177,(3)间质溶素stromelysin,又称间充质溶解素，基质溶解酶 分为间质溶素-1(MMP-3)、间质溶素-2(MMP-10)和间质溶素-3(MMP-11)3种。作用底物比较广泛，如、V型胶原、明胶、蛋白聚糖以及糖蛋白等。,178,(4)膜型MMPs：(MT-MMPs),包括MT l-MMP(MMP-14)，MT 2-MMP(MMP-15)，MT 3-MMP(MM

47、P-16)和MT4-MMP(MMP-17)，均是MMPs的新成员。已发现MMP-14和MMP-16可以激活MMP-2。,179,(5)其它MMPs,其它MMPs中的MMP-7水解底物也较广泛，如蛋白聚糖、明胶、IV型胶原、FN、LN和内皮粘连蛋白(巢蛋白，entactin)等。,180,2）基质金属蛋白酶的结构,所有MMPs都含有至少3个相似的结构域:氨基端(N端)到羧基端(C端)依次为信号肽结构域、前肽结构域和催化结构域。,181,信号肽结构由1729个氨基酸组成；前肽结构域由7787个氨基酸组成，其中的半胱氨酸对维持酶原形式起重要作用。在酶原的激活过程中，这个结构域会被水解掉。催化结构域中

48、中的3个组氨酸被认为可与酶活性中心部位Zn 2+结合组成配位键，从而对酶的催化活性起重要作用。,182,3）基质金属蛋白酶的功能,主要有两方面功能：几乎能降解所有ECM成分；激活其它MMPs，形成级联效应。,183,MMPs重要的病理意义：,MMPs表达增加和酶活性增强参与许多疾病的发生，肿瘤侵袭生长、转移；其表达下调和酶活性受抑，可参与动脉粥样硬化、器官纤维化和多种结缔组织疾病等的病理过程。MMP-7和MMP-9能使纤溶酶原降解为血管抑素(angiostatin)，从而抑制新血管的形成，参与创伤修复的调节。,184,4）基质金属蛋白酶活性的调节,MMPs在体内的表达、激活以及对底物的降解过程

49、均受到严格的调控。体内MMPs至少有4种调节方式：转录水平调节、酶原的活化、特异性组织抑制因子 其它抑制因子的调节。,185,(1)转录水平调节,大多数MMPs基因的调节序列中，含有TATA盒，多种原癌基因如c-los和c-jun的表达产物能与这些位点结合，刺激MMPs的转录。某种刺激因素引起细胞增殖及ECM产生增多的同时，也诱导了MMPs的表达，这可能是正常组织保持ECM处于动态平衡的重要机制之一。,186,多种生长因子和细胞因子能调节MMPs和TIMPs转录，也可影响MMPs产生及其mRNA的稳定性，如 EGF、PDGF、bFGF、TGF-、TNF-、TNF-、IL-1、-2、-4、-10

50、、IFN-r、神经生长因子(nervegrowth factor，NGF)、NO和AGEs等,187,(2)酶原活化：多数MMPs以前体形式分泌至细胞外，然后被活化,MMPs前体活化依赖于“半胱氨酸开关”。前肽区的半胱氨酸残基与催化区Zn2相互作用，组成“半胱氨酸开关”，阻止催化位点与底物的结合。某些因素能断裂半胱氨酸残基与Zn2之间的共价键，暴露催化区，使MMPs活化。,188,血浆纤溶酶和间质溶素是已知的MMPs生理性激活因子，MMPs之间也能相互激活。纤溶酶、胰蛋白酶和间质溶素可活化间质胶原酶(MMP-1)，MTl-MMP和间质溶素可活化胶原酶-3(MMP-13)，MTl-MMP可活化M