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1、一、实验目的,1.学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识；2.掌握细菌革兰氏染色的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。,二、实验原理,1.光学部分:接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。它使检视物放大,造成物象。2.机械部分:镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。,（一）普通光学显微镜,图1-1-2 光学显微镜的成像原理,显微镜的放大倍数和分辨率,D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰,2.显微镜的分辨率：是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示

2、为：D（R）=0.61/nSin/2式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。：可见光的波长（平均0.55m)n:物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。,1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数,镜口率 N.A=nSin/2,油镜(OI,HI,100X)，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。,根据公式D=0.61/nSin/2，增大分母，使得D值减小，分辨率增大。,（二）油镜使用的原理,

3、1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上乙醇再擦镜头；第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的乙醇。6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。,（三）显微镜保养和使用中的注意事项,1、实验原理（p.29）革兰氏染色法：细菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢

4、的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌、螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。,（四）、革兰氏染色原理,根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构差异来达到染色的目的的。先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫色；然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。然后再用乙醇脱色处理。,（四）、革兰氏染色原理,由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙

5、醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）。,（四）、革兰氏染色原理,大肠杆菌,葡萄球菌,1、菌种：大肠杆菌、白色葡萄球菌2、仪器：显微镜3、染色液：草酸铵结晶紫染色液、Lugol(路哥尔氏)碘液、95乙醇、0.5%沙黄染色液4、材料：载玻片、香柏油、乙醇、擦镜纸,三、实验材料,（一）显微镜油镜观察操作方法 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。,四、实验操作步骤,油镜使用毕后：上升镜筒，取下载

6、玻片，用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许乙醇擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的乙醇。,四、实验操作步骤,本实验室按小组使用固定编号的显微镜，显微镜的保养由对应学号的同学负责。实验过程中如果所用显微镜不能使用，自行与其他同学调节。但显微镜如果出现问题，由对应学号的同学承担责任。,四、实验操作步骤,基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、排列）特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，再仔细观察特殊结构）,四、实验操作步骤,（二）细菌形态的观察（示教？）,（三）革兰氏染色的操作方法,四、实验操作步骤,（1）涂片：先在载玻片左右端各滴一滴生理盐水，分别挑取大肠杆菌和白色葡萄球

7、菌菌体于生理盐水中涂片（采用三区涂片法：分别将上述2种菌液延伸至玻片中央，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚。,（三）革兰氏染色的操作方法,载玻片,生理盐水滴,菌体,涂片,大肠杆菌,葡萄球菌,混合菌,染色前必须固定细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。,（三）革兰氏染色的操作方法,干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥(或者用吹风机)。固定：涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操作的目的是使得细胞质凝固

8、，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰12次即可。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染1-2分钟min，水洗。媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。,（三）革兰氏染色的操作方法,脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030s，立即用水冲净酒精。注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌（假阳性），脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。,（三）革兰氏染色的操作方法,复染：用番红液

9、染12min,水洗。镜检：干燥后（室温下晾干），观察（先在低倍镜（40X），然后在油镜（100X）下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。,（三）革兰氏染色的操作方法,(10)实验结果的记录：要求在用显微镜观察（左眼观察）的同时在实验记录本上画下你所观察到的细菌的形态。,（三）革兰氏染色的操作方法,注意：实验结束后，把载玻片用酒精棉擦净，放入烧杯！,本实验每人做一张。实验报告中要画图表示结果（40X倍镜、100X油镜）。,（三）革兰氏染色的操作方法,思考题,1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样2.革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步？3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？,