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1、植物体细胞杂交,植物细胞A,植物细胞B,去细胞壁,原生质体融合,杂种细胞,植物细胞融合,1、植物体细胞杂交的结果是产生了？2、这个过程中涉及的原理是？,杂种植株,细胞膜的流动性 植物细胞的全能性,动物细胞工程,动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体核移植,动物细胞培养和核移植技术,一、动物细胞培养,动物细胞培养的概念：动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,为什么要进行动物细胞培养?,1.动物细胞培养,如何进行细胞培养?,2.2.1动物细胞培养和核移植技术,从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基

2、中，让这些细胞生长和增殖。,1.1概念,（一）动物细胞培养的过程,1、选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。,2.分散成单个细胞,在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.27.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。,阅读课本观察图片，简述动物细胞培养的基本过程,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,胰蛋白酶,单个细胞,加培养液,制成,细胞悬浮液,10代细胞,部分细胞“癌变”，遗传物质改变，无限传代,动物细胞培养不能最终培养成动物体,50代细胞,原代

3、培养,传代培养,细胞贴壁,剥离、分瓶,细胞株,细胞,细胞系,3、过程,胰蛋白酶,接触抑制,有关概念,传代培养,细胞贴壁,接触抑制,原代培养,有关概念,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提

4、供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？,讨 论,充足营养,适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境,（二）、动物细胞培养的条件：1.无菌、无毒的环境培养液和所有培养用具进行无菌处理措施：培养液中加抗生素，定期更换培养液2.营养糖、氨基酸、无机盐、微量元素、促生长因子（维生素、激素等）和动物血清3.温度和PH 36.50.5 PH为7.27.44.气体环境（主要是O2 和CO2）通常95空气 5的CO2,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养

5、基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物组织培养和动物细胞培养的比较（非常学案P28）,（三）、动物细胞培养技术的应用,（1）生产生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。,（3）用于检测有毒物质,（2）基因工程中常用的受体细胞,（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是-（）A细胞系 B细胞株 C原代细胞 D传代细胞,2、动物细胞工程技术的基础是-（）A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养,A,D,3、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄

6、动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞（）A.容易产生各种变异 B具有更强的全能性 C.取材十分方便 D分裂增殖的能力强,D,4.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（）A.培养基不同；B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行；C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能；D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。,A,2.动物细胞核移植技术和克隆动物,将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）,分类,细胞分化程度低，恢复全能性容易,细胞分化程度高，恢复全能性不容易,2.1 动物细胞核移植

7、概念：,克隆：指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方式产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子，细胞或个体。克隆包括三个层次：分子水平：如PCR扩增DNA 细胞水平：如动物细胞培养 个体水平：如克隆动物,2.2体细胞核移植的过程：,思考：1.核移植的受体细胞是什么？处在什么时期？2.通过什么手段激活受体细胞，构建重组胚胎？,M中期卵母细胞,诱导方法：物理或化学方法激活受体细胞，完成细胞分裂和发育进程。,讨论：,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移至受体细胞之前，

8、必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。,培养的动物细胞一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一

9、些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,多莉羊的培育过程,2.3体细胞核移植技术的应用前景：,1、在畜牧业中可以加速家畜遗传改良的进程,2、保护濒危物种,3、医药卫生领域生产医用蛋白质及组织器官的移植,4、了解胚胎发育和衰老过程；追踪研究疾病的发展过程和治疗疾病,3、体细胞核移植技术存在的问题,胚胎移植动物幼体产出 概率10克隆动物存在着健康问题克隆动物的食品安全性问题存在争议P50 思考与讨论,动物细胞融合与单克隆抗体,三、动物细胞融

10、合,概念：也称细胞杂交。是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。,物理法,化学法,生物法：,灭活的病毒,仙台病毒,丧失感染性,（不感染细胞）,保留融合活性,（诱导细胞融合）,1、诱导方式,动物细胞融合（细胞杂交）2个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程,细胞A,细胞B,杂种细胞,灭活的病毒,物理法化学法,仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒,离心振动电激,聚乙二醇,2.过程：,灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面,细胞膜被病毒颗粒穿通,细胞膜连接,细胞融合，形成杂种细胞（细胞膜具有一定的流动性）,用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程,拓展：

11、聚乙二醇处理后，培养液中存在哪几种细胞？,脾-脾 脾-瘤 瘤-瘤 未融合的脾细胞 未融合的瘤细胞,3、原理,细胞膜的流动性,4、用途：制备单克隆抗体,动物细胞融合相当于植物体细胞杂交的原生质体融合过程,观看示意图简述融合过程？,有何同？不同？,动物细胞融合,主要用于制备,单克隆抗体,获得杂种植株,用途,物理、化学方法,（同左）,灭活的病毒,物理（离心、振动、电刺激）,化学（聚乙二醇）,诱导方法,使细胞分散后诱,导细胞融合,去除细胞壁后诱,导原生质体融合,细胞融合的方法,细胞膜的流动性,细胞膜的流动性、,植物细胞全能性,原理,动物细胞融合,植物体细胞杂交,比较项目,植物、动物细胞融合的比较,在动

12、物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）A结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同,四、单克隆抗体,什么是抗体？抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。B淋巴细胞产生抗体。,如何理解单克隆抗体？,单:单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强的球蛋白,1.其由何种细胞产生？2.主要分布在哪里？3.如何得到抗体？,读下面一段文字资料，思考以下问题：,长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性

13、差，纯度低，反应不够灵敏。人们发现，在动物发生免疫反应的过程中，体内的B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种化学性质单一、特异性强的抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。,怎样才能获得单克隆抗体？,仅用细胞培养技术可行吗？,我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的？,有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢？,原始的方法获得抗体，特异性差，纯度低。想获得单一抗体，必须用单个B淋巴细胞进行无性繁殖，通过克隆形成细胞群。问题：体外培养的条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增值的，如何使单个淋巴细胞增殖呢？,实验目的:制备单

14、克隆抗体.实验原理：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。实验材料：小白鼠实验器材：培养皿、针筒等等。实验过程：如下页,根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的 实验方案:,设计方案：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖,杂种细胞,根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的 实验方案:,B淋巴细胞与抗体,B淋巴细胞受抗原刺激后，可以产生抗体。动物体内的B淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。每一个淋巴细胞只能产生一种抗体。,如何大量生产单克隆抗体？,利用淋巴细胞产生抗体的功能利用肿瘤细

15、胞无限增殖的特性利用细胞融合的技术将两种细胞融合获得具有淋巴细胞和肿瘤细胞特性的杂交瘤细胞利用动物细胞培养技术大量培养杂交瘤细胞,思考：,1、本过程利用了哪些原理？,免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理,2、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？,（小鼠骨髓瘤细胞可以在体外培养条件下大量增殖，B淋巴细胞能够产生抗体，细胞的同源性越近，融合形成的杂种细胞越易成活。）,（3）杂交瘤细胞有何特性？,（4）骨髓瘤细胞是癌细胞吗?,（有无限增殖能力（失去凋亡机制，失去接触抑制等）的细胞是肿瘤细胞，而具有转移能力的肿瘤细胞，称为癌细胞，所以说，瘤细胞不能等于癌细胞。）,这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双

16、亲细胞的遗传物质，不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的本领，因而可以获得大量单克隆抗体,B BB B瘤 瘤瘤 瘤,（5）细胞融合后培养液中有几种细胞（两两结合）,已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两条DNA合成途径，但一般不分裂增值。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增值，将这两种细胞在试管中混合，加PEG促融，获得杂种细胞。,（6）整个制备过程为何要经过两次筛选?,（第一次筛选得到杂交瘤细胞（多种），第二次需先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始培养，然后再筛选出能产生特异性抗体的细胞群。由于该细胞群是单个杂交

17、瘤细胞克隆得来的，所以产生的抗体必然是化学性质单一的，特异性强的单克隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。）,单克隆抗体的应用：,在基础理论研究中具有重要意义,在疾病诊断、治疗和预防方面，具有特异性高、灵敏度高等优越性。,生物导弹,与常规抗体相比，单克隆抗体产量高，特异性强，灵敏度高，优越性十分明显。,总结,一种诱导细胞融合的新方法,一种新细胞,一个优势,总结,两个过程,动物细胞培养过程,单克隆抗体制备过程,三个“一”,一个诱导细胞融合的新方法 灭活病毒,一个新细胞杂交瘤细胞,一个优势单克隆抗体特异性 强、灵敏度高的优势,1、下图为某同学根据杂

18、交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的抗体实验方案,制备单克隆抗体,B细胞,抗体,细胞融合,灭活病毒,双亲细胞,分泌抗体,无限增殖,原代,传代,50,2、世界上第一只克隆羊“多莉”的培育过程如图所示，请据图回答：,乙,甲,a,b,c,d,e,f,(1)图中的甲为苏格兰绵羊，乙为多莉羊。那么，a和b是通过_分裂形成的，其DNA含量是体细胞的 _；c肯定是_ 细胞，乙的遗传性状与提供 _的绵羊 一致.,减数,一半,体,细胞核,乙,甲,a,b,c,d,e,f,(2)产生 甲和乙的过程分别是和（3）在形成乙是的过程中，需要将d的细胞核取出，将c细胞核移入d细胞内，此技术叫。所需的受体细胞大多采用动物卵

19、细胞的原因是（4）绵羊的白色对黑色为显色。若甲是白色绵羊，要判断它是否纯合体，选用与它交配的绵羊最好是-,有性生殖,克隆,核移植,卵细胞大，易于操作；卵细胞具有继续分化的潜能。,黑毛,乙,甲,a,b,c,d,e,f,（5）在产生多莉羊时，需将e细胞形成的早期胚胎移入另一头母羊（f）子宫里，这种技术在细胞工程中叫（6）继植物组织培养后，克隆绵羊的培育成功，证明动物细胞也有（7）在繁殖多莉羊的过程中，是否遵循孟德尔遗传规律？多莉羊的性状与d羊、c羊及f羊的关系是什么？,胚胎移植,全能性,不遵循，多莉羊的多数性状象c羊，个别性状象d羊，发育也会受到f羊影响。,动物细胞培养液的主要成分：,葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。,（1）液体培养基,（2）含有动物血清,动物体细胞大都生活在液体的环境,（二）动物细胞融合,1.过程：,4、培养过程,幼龄动物,取动物器官和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培养,单个细胞,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,