从特定的细胞中分离与核糖体结合的mRNA精选文档.ppt

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1、核酸的分离与纯化技术是生物化学和分子生物学中的一项基本技术。其中，RNA，尤其是mRNA的制备与分析，在了解基因表达方面是分子生物学的研究的关键步骤。大部分真核mRNA分子的3端存在一个2030个多聚腺苷酸残基poly（A），可以用磁珠法或者寡聚（dT）的纤维素亲和而纯化。,-mRNA分子的分离,磁珠法,寡聚dT纤维素柱层析法,目录,1,摘要,3,实验材料和方法,实验过程及结果,4,5,讨论,一 摘要,基因表达谱技术可以分析来自器官，组织和细胞的转录产物。然而，由于器官和组织是由各种类型的细胞组成，且有各自的基因表达模式，因此这些方法受到了限制。为了鉴定复杂组织中某一细胞类型的转录组，研究人员

2、用物理方法，原位杂交或者免疫组织化学的方法分离不同类型的细胞，但都有一定的局限性。,本文我们描述一种快速有效地分离体内任何细胞类型中与核糖体结合的mRNA转录组的方法。我们建立了一个小鼠系-RiboTag（Tag Ribosomes），带有一个Rpl22等位基因，该基因C端的一个野生型外显子4的左右各有一个Lox P位点，其后还有一个带有3个血凝素（HA）抗原决定簇拷贝的外显子4。,当RiboTag小鼠与Cre重组酶表达小鼠杂交后，Cre 重组酶能够激活用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质Rpl22HA的表达，并一起翻译为多聚核糖体。,在特定细胞类型中，多聚核糖体与单克隆抗体（抗原为HA）的免疫沉淀

3、反应就能够分离与核糖体结合的mRNA转录组。,Cre重组酶表达小鼠,二 简介,利用转基因技术使抗原决定簇标签表达或利用绿色荧光蛋白（GFP）等报告基因克服了在分析复杂组织中特定细胞类型的转录组中遇到的困难，因此研究者可以鉴定感兴趣的细胞。用人工解剖，荧光激活细胞分类术（FACS）或者激光捕获显微切割技术（LCM）可以从复杂的器官中分离这些标记的细胞。,原理-荧光染色或标记被检细胞悬液，使单细胞液流快速通过仪器的激光器照射分析区，被检细胞产生的不同荧光信号转变为电脉冲，分别输入计算机内，并显示于示波器屏幕上，即可获得该细胞群体中不同类型细胞的有关数据。缺点-各种细胞类型之间的三维关系将被破坏，还

4、将导致基因表达的改变。,荧光激活细胞分类术（FACS）,原理-通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜乙烯乙酸乙烯酯EVA）膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。缺点-为使细胞离开它原来的环境，要对组织进行切片，处理，脱水等复杂的操作。,激光捕获显微切割技术（LCM）,mRNA转录组可以通过免疫沉淀反应从多聚核糖体中分离出来，然后用定量的RT-PCR或微阵列等标准基因识别技术分析。,优点,表达Cre重组酶小鼠的易获取性,用抗原决定簇标记的核糖体蛋白质亚基的易检测性,三 实验材料和方法,RiboTag小鼠 表达Cre 重组酶小鼠 pBluescript KS+质粒 HA序列 各种限制性内切

5、酶 胚胎干细胞 HA抗体和c-myc抗体,Western Blot Analysis蔗糖密度梯度分析免疫组织化学多聚核糖体的免疫沉淀反应RNA完整性的分析qRT-PCR分析Northern Blot AnalysisSouthern Blot Analysis,四 实验过程及结果,用于表位附加的核糖体蛋白的选择和靶载体的设计,Rpl22HA蛋白质在小鼠组织中的表达,Rpl22HA蛋白质整合到多聚核糖体,Rpl22HA C末端的HA标签用于免疫沉淀多聚核糖体,核糖体结合的mRNA与非核糖体结合的mRNA的辨别,特定细胞转录产物的富集,用于表位附加的核糖体蛋白质的选择和靶载体的设计,核糖体由大约8

6、0个蛋白质组成。当检测用绿色荧光蛋白（GFP）标记的大型酵母和哺乳动物蛋白质的C末端时，在适当的细胞区室发现了4个核糖体蛋白质亚基（RPS17，RPS25，RPL22和RPL36）。我们选择标记Rpl22基因，该基因是从细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）中分离得来的，为9.8kb。这个靶基因包含2个外显子4，第一个为野生型外显子4，左右两边各有一个loxP位点，第二个外显子4被HA标记。,细菌人工染色体（BAC）,用于 DNA片段克隆的载体系统一直是分子生物学中不可或缺的重要工具。质粒系统容量小(15 kb)，只适用于一般基因的克隆，很少用

7、于DNA文库(DNA library)的构建，尤其是真核生物的文库构建。粘粒容量虽有所增大(45 kb)，但对于一些较大的基因簇(gene cluster)的研究仍然无能为力。酵母人工染色体(yeast artificialchromosom,YAC)系统容量很大(可至数Mb)，已被广泛应用于DNA文库的构建和基因簇研究，但其易于发生重组，缺乏稳定性及制备工艺的繁琐局限了它的使用。,补充1,20世纪90年代发展起来的细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)是一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb

8、左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点。在基因文库构建和基因功能分析等方面有广泛的应用。,补充2 定位重组系统,目前，选择标记基因被广泛应用于细胞的遗传转化，用于区分转化和非转化细胞，但当筛选完成后，选择标记基因不再有用，将之从转基因细胞中去除有以下几个优点：,大大提高了转基因生物的安全性,为多基因转化使用同一选择标记基因提供了可能性,降低了对转入的目的基因进行表达结果分析的复杂性,减少了转入的外源DNA的序列，提高了基因组的稳定性,定位重组系统是由单个多肽酶识别特定的DNA序列而发生重组的遗传操作系统。每种重组系统都主要由两部分组成：重

9、组酶和特异性识别位点。,Cre/LoxP重组系统,Cre重组酶(cause recombination)：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，由343个氨基酸组成，它不仅具有催化活性，而且跟限制酶相似，识别特异的DNA序列，如：LoxP位点，引起重组。,Lox P位点（Locus of crossing over in P1)：是Cre重组酶作用的特异性重组位点，由34 bp组成。,Cre/LoxP系统条件性敲除基因,在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)中通过置换型载体进行同源重组，向靶基因位点两侧引入两个同向排列的Lox P位点。将该ES细胞打人假孕母鼠中

10、，发育成“floxed小鼠”。,“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre重组酶会切掉Lox P位点之间的靶基因和第1个Lox P位点，从而达到靶基因的失活或敲除。,FLP/FRT重组系统,来自于啤酒酵母细胞核内2m质粒的FLP/FRT 重组系统同样由两部分组成：重组酶FLP FRT位点重组酶FLP可催化同一分子上两个同向FRT位点间DNA片段的切除。,补充3 表位附加标记,表位(epitope)：即指抗原决定部位或指抗原决定基；表位附加标记(epitope tag)：将附加的抗原表位融合到目的蛋白以检测目的蛋白的表达，同时还可以通过亲和层析法来纯化目的蛋白及利用免疫荧光技术对标记蛋白进

11、行亚细胞定位。,HA标记一般由9个氨基酸组成，它来源于流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)。,c-myc标记由十多个氨基酸组成的，它来自人类c-myc原癌基因。,靶载体的构建,BAC,9.8kb EcoRI/BamHI 片段（包含Rpl22基因的外显子3和4）,pBluescript KS+质粒,XbaI/XhoI,pBluescript KS+质粒,在 XbaI/XhoI片段的3端产生一个BamHI位点,pBluescript KS+质粒,AatII,Klenow 酶补平,亚克隆,克隆,PCR,再亚克隆,1.7kb Sal I/Cla I片段,3HA序列,HindIII/Ap

12、aI片段 LoxPNeoLoxP,Klenow 酶,LoxPNeoLoxP外显子4,Cre 重组酶,补平,LoxPNeoLoxP外显子4,产生,第一个pBluescript KS+质粒,NotI/ApaI双酶切分离出,Klenow 酶补平,第二个pBluescript KS+质粒,Xho I酶切,BsmBI，NotI限制酶和 Klenow 酶,图1A Rpl22基因的标记过程,RiboTag mouse line,补充4 胚胎干细胞介导基因的导入,利用电穿孔等基因转移技术将外源基因导入胚胎干细胞内，再将此胚胎干细胞嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育，将来出生的动物可能整合上外源基因，通过杂交

13、繁育可得到具有纯合目的基因的转基因动物。优点是基因整合率高（50%左右），可选择特殊位置诱导突变，为基因修补提供最大的可能性；缺点主要在于建立ES细胞株比较困难。,图一B 用 Southern blot辨别导入靶基因的ES细胞，野生型HindIII/Sfil DNA片段是9908bp，正确的靶HindIII/Sfil DNA片段是8749bp。,图一C PCR扩增的产物。野生型的PCR产物（不含LoxP位点）是260bp，突变的PCR产物（含LoxP位点）是290bp。,野生型HindIII/Sfil DNA片段,正确的靶HindIII/Sfil DNA片段,Rpl22HA蛋白质在小鼠组织中的

14、表达,为检测Rpl22HA等位基因的功能，我们首先将RiboTag小鼠与间质同源2（Meox2）表达Cre重组酶小鼠杂交，激活各组织中的Rpl22HA等位基因。,Meox2+/+:Rpl22 HA/+mouseMeox2 Cre/+:Rpl22 HA/+mouseMeox2 Cre/Cre:Rpl22 HA/HA mouse,Meox2 表达Cre重组酶小鼠,RiboTag小鼠,图1D 用野生型RPL22蛋白质或HA的抗体，检测野生型RPL22蛋白质和RPL22HA蛋白质的表达，其分子量分别为15kDa和23kDa。靶载体与无Cre重组酶的小鼠杂交只产生野生型Rpl22蛋白，与有Cre重组酶的

15、小鼠杂交只产生Rpl22HA 蛋白。,Meox2+/+:Rpl22 HA/+mouseMeox2 Cre/+:Rpl22 HA/+mouseMeox2 Cre/Cre:Rpl22 HA/HA mouse,图1E 通过对表达Rpl22HA的纯合子小鼠Western blotting分析说明Rpl22HA蛋白质在所有组织中稳定表达。通过另一个大的核糖体蛋白质亚基RPL7的Western blotting分析得之，Rpl22HA蛋白质在各组织中表达量的差异与每个组织中核糖体的量的不同有关。,H心脏 S脾脏 Li肝脏 O卵巢 Sk骨骼肌 Pa胰腺 Lu肺 K肾脏 B大脑,Rpl22HA蛋白质整合到多聚

16、核糖体,证明了Rpl22HA蛋白质的稳定表达后，还得证明Rpl22HA蛋白质整合到了核糖体中。对表达Rpl22HA蛋白质的纯合子小鼠的大脑匀浆进行蔗糖密度梯度分析，然后再进行Western blotting分析。,图1F 蔗糖密度梯度为15%-50%，测核糖体总蛋白在254nm处的吸光度，Western blot测定Rpl22HA蛋白。Rpl22HA蛋白质主要存在于多聚核糖体片断中，在第1个梯度（细胞质）中几乎不存在。当加入EDTA后，导致核糖体总蛋白和Rpl22HA蛋白质变成更轻的片段，都主要沉降到第2，3，4个梯度，说明Rpl22HA蛋白质确实是核糖体的一部分。,Rpl22HA 的HA标签

17、用于免疫沉淀多聚核糖体,当RiboTag小鼠与Cre 重组酶小鼠杂交后，导致野生型外显子4的消失，取而代之的是HA标记的外显子4。,表达HA标记的核糖体,匀浆,结合HA的抗体的磁珠,4条件下过夜培养,高盐缓冲液冲洗被磁珠免疫吸附的核糖体,匀质,加入到,RNA被提取出来,补充5 免疫磁珠分离法,免疫磁珠分离法是基于预分离物质（本文是核糖体）表面的抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的物质被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的物质由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使物质得以分离。,图2 RiboTag的作用-用来分离与核糖体结合的

18、mRNA,图3A 用2100 生物分析仪检测从表达Rpl22HA蛋白质的小鼠大脑匀浆或睾丸匀浆中提取的核糖体RNA样品完整性。加入一定量的核糖体RNA，用HA的抗体检测到完整的18S和28S核糖体RNA，而用myc抗体则检测不到18S和28S核糖体RNA。,图3B为RNA的完整性数量（RIN），反映样品中rRNA的质量，8.09.2，说明从免疫共沉淀中获得的RNA的质量很好。,补充6 RNA的完整性的检测,对RNA的完整性进行评估，这是保证实验成功和优异重现性的最重要保障。使用2100 生物分析仪，用RIN值（RNA Integrity Number/RNA完整性）来客观的定义RNA样本的完整

19、度。2100 生物分析仪，是一款基于微流毛细管电泳系统为基础，对蛋白质，DNA或RNA进行多功能分析的技术平台。每当2100生物分析仪完成一个RNA样品分析后，软件会自动给出一个从1到10之间的完整性的数值。数值越大，完整性越好。RIN值已成为行业内不可缺少的重要参数。,图3C 用HA的抗体或myc抗体磁珠免疫共沉淀的蛋白质的Western blot分析说明只在HA-IP中检测到RPL22HA，另一个核糖体蛋白质（RPL7）被少量也被免疫共沉淀。,43,在多巴胺和cAMP调控磷蛋白（DARPP-32）的控制下,多巴胺转运（DAT）启动子,荷尔蒙抗体（Amh）启动子,RiboTag小鼠,Cre

20、重组酶小鼠,我们观察到在DAT多巴胺神经元，DARPP32纹状体的中型多棘神经元和AMH支持细胞中的RPL22HA蛋白质得到了大量表达。,特定细胞转录组的富集,图4A RPL22HA蛋白质在各种细胞中大量表达。HA的抗体呈绿色，酪氨酸氢化酶（TH）的抗体呈红 色，TO-PRO-3试剂盒呈蓝色。,DAT多巴胺神经元,DARPP32纹状体的中型多棘神经元,AMH支持细胞,多巴胺转运启动子,在多巴胺和cAMP调控磷蛋白（DARPP-32）的控制下,荷尔蒙抗体（Amh）启动子,图4B 加入等量的蛋白质，免疫沉淀检测到的RPL22HA蛋白质的量依次增多。说明RPL22HA蛋白质表达量取决于细胞类型。,图

21、4C RPL22HA蛋白质免疫沉淀的效率。虽然在三种情况下RPL22HA 蛋白质表达水平不一样，但免疫共沉淀的效率没有很大的变化。,I-inputP-pelletS-supernatant,DAT-Cre:RiboTag mice-中脑的多巴胺神经元中的转录产物（包括Th和Slc6a3）富集倍数为10-15倍，信噪比低，Cnp不富集；DARPP32-Cre:RiboTag mice-纹状体的中型多棘神经元中的转录产物（包括Ppp1r1b，Pdyn和Penk1）富集倍数为5-6倍，Cnp不在中型多棘神经元中表达，所以不富集；AMH-Cre:RiboTag mice-睾丸支持细胞中的转录产物(包括

22、Fshr，Trf和Inhbb)富集倍数为5倍，支持细胞中不表达Prm2，所以不富集。,图4D 用qRT-PCR分析转录产物，与输入RNA相比，特定细胞免疫共沉淀mRNA的富集。,信噪比低,不表达,不表达,核糖体结合的mRNA与非核糖体结合的mRNA的辨别,检测RiboTag 方法能否辨别翻译被抑制的和有翻译活性的mRNA转录组，在精子形成的过程中，精子DNA蛋白质的表达就是一个很好的例子。鱼精蛋白的翻译远落后于相应mRNA的转录，鱼精蛋白1（Prm1）mRNA转录后，结合Y-box抑制蛋白，使其以胞浆核蛋白颗粒(cytoplasmic ribonucleoprotein，mRNP)的形式先贮存

23、起来，直到poly(A)尾被脱腺苷化变短，才在晚期精子细胞阶段翻译活化。,在精子形成的第一阶段，检测总Prm1 mRNA和与核糖体结合的Prm1 mRNA 的量。表达RPL22HA的纯合子小鼠的睾丸在出生25，28，32天后分离，均质化，用连接有HA抗体的磁珠免疫沉淀多聚核糖体，获得不同时间段的核糖体转录组。,图5B 在第25天与核糖体相关的Prm1 mRNA 转录组只占总Prm1 mRNA的9%，第28天只占18.8%,第32天增加到30%。,图5A qRT-PCR分析小鼠总Prm1 mRNA，总Actb mRNA和与核糖体结合的mRNA。说明与核糖体相关的Prm1 mRNA在第25天开始增

24、加，28天接近最大值。相反，与核糖体相关的Actb mRNA 则没有太大的变化。,图5D Northern blot分析显示580nt（无翻译活性）Prm1转录组主要存在于非核糖体中，而450nt（脱腺苷化，有翻译活性）Prm1转录组主要存在于核糖体中。说明有翻译活性的转录组存在于核糖体中，即RiboTag 方法能区别翻译被抑制的和有翻译活性的mRNA转录组。,图5C 考马斯亮蓝染色显示三个时间段PRM1蛋白质含量。出生后第25天没有，第28天开始增加。,五 讨论,优点修饰了内源Rpl22 gene，因此核糖体蛋白质更易检测，与细胞内的核糖体的量成比例。RiboTag 方法利用各种Cre 表达

25、重组酶小鼠系，包括三种细胞类型，使实验更科学，结果更准确。不用担忧BAC 基因随机插入到小鼠基因中去。在表达Rpl22HA的纯合子小鼠中没有发现任何缺陷，推断标记Rpl22 蛋白质不影响它在体内的功能。,最近，设计出一种敲除Rpl22 基因的小鼠，是能活的，多产的。这些小鼠的生存能力取决于一种同系物-Rpl22-Like 1，在各组织均表达。一些细胞的Rpl22-Like 1的表达水平可能高于Rpl22，这影响我们广泛利用RiboTag技术的能力，但是由于不存在Rpl22-Like 1的抗体，我们不能通过实验对比标记Rpl22-Like 1和Rpl22的效率。,实验的不足与发展方向,本实验发现特定细胞类型的mRNA已大量富集，但仍然存在一些未被HA标记的核糖体被磁珠吸附。不过，我们的方法在未来可以向减少非特异核糖体免疫沉淀方向发展。一个提高信噪比的简单方法是解剖适当的大脑区域以增加被标记的核糖体的细胞的比例。,谢谢大家！,十分感谢孟老师耐心 细致的指导！,