最新动物实验研究方法及其在中医研究中应用PPT文档.ppt

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1、1.临床试验？2.动物实验？,动物实验是根据研究目的，恰当地选用标准的并符合实验要求的实验动物，在设计的条件下，进行各种科学实验，观察、记录动物的反应过程与反应结果，以探讨或检验未知因素对生命活动的作用与影响的医学实验。,动物实验的特点,动物实验的意义,美国心理学会动物研究指导总则“动物行为研究者应努力促进对基本行为原理的理解和/或为提高人类的健康和幸福作贡献。为达到这些目标，研究者要保证动物的权利和人道地对待它们。虽然有法律和规定，但一只动物的即时保护则有赖于科学家的个人良知。”美国心理学会还提供了学生研究者的指导原则。总体上，“当采用动物被试时，应精心照料并尽可能减少它们的痛苦和不适。”参

2、考文献：B.H.坎特威茨等.实验心理学。,动物实验是实验中医学的重要组成部分和重要的研究方法和手段，无论对中医学数千年来所积累的疾病认识、防治丰富经验进行验证和总结，对历代医家理法方药的研究，对中医学理论的研究和发展，还是对当前中医药学各个学科的教学、科研，对新的治疗方法（包括应用药物和非药物疗法）的发展，乃至对新的中医药学理论体系的创立，等等，都是不可缺少的。,动物实验在中医药发展中的作用,一、实验动物的选择实验动物的定义：实验动物是指以实验研究为目的，在一定的环境条件控制下，经过培养驯化，具有明确的生物学特性和清楚的遗传和微生物背景的动物。,图1 小鼠 图2 裸小鼠 图3 裸大鼠 图4 大

3、鼠 图5 白兔 图6 兔的饲养,图7 比格犬及其饲养 图8 马及其饲养,常用实验动物,实验动物种类繁多，在进行实验时，应根据课题的需要和动物的特性加以选择，使研究目的与动物的种属、特性和个体差异相吻合，才能保证研究工作的顺利进行。不同的科学实验要求选择和开发最适宜的实验动物。正确选择实验动物，实验设计周密详尽，可以节省人力、动物和时间，以最小的代价，最大限度地获得可靠的研究结果。否则，不仅会造成不必要的浪费，严重的还会影响到实验结果的判断，甚至导致实验的失败。因此，选择和开发实验动物是动物实验的首要环节，至关重要，应予以足够的重视。,三个基本要求：实验动物通常应该具备个体间的均一性、遗传性能的

4、稳定性和比较容易获得这三个基本要求。具体要求如下：1尽量选用机能、代谢、结构及其它方面机能与人相似的实验动物一般来说，动物的进化阶段愈高，机能、代谢、结构愈复杂，也就愈接近人类。2选用标准化的实验动物标准化实验动物指遗传背景明确、饲养环境与动物体内的微生物得到控制、符合一定标准的实验动物。,只有选用标准化实验动物，而且实验过程也在标准环境中饲养的动物，在实验中才能排除因动物杂交、遗传上的不均质及环境条件的变化，所引起的个体反应不一致。排除因动物携带细菌、病毒、寄生虫和潜在疾病的影响，才能便于分析实验结果，减少实验误差，提高科学性，准确性，把所获得的结果与同类研究进行比较、交流，并得到承认。,在

5、实验研究中应避免使用随意交配繁殖的动物，而应根据研究目的选择用遗传学控制的方法培育出来的近交系、突变系、系统杂交或封闭群动物。同时应对实验动物进行微生物控制，发展使用无菌动物、已知菌动物或无特定病原体（SPF）动物。,实验动物的分类 按遗传控制分类：（1）近交系，即纯系动物：其动物遗传的均质性保证了实验反应的稳定性。（2）封闭群动物：能较好地代表自然群体的遗传特性。（3）杂交一代动物（F1）：在一定程度上，兼有近交系和封闭群的特点。（4）突变动物：往往具有鲜明的人类疾病模型特征。,按微生物控制的程度，我国将实验动物分为四个等级：（1）普通级动物（CV动物）：一般为教学示范用。（2）清洁级动物（

6、CL动物）：国内科研工作要求的标准动物，适合于大多数科研课题。（3）无特定病原体动物（SPF动物）：国际标准实验动物。（4）无菌动物（GF动物）和悉生动物（GN动物）：仅在特殊课题需要时使用。,图9 实验动物中心,实验动物中心是我省规模较大、标准最高、设施最完善，集教学、科研、技术服务和培训为一体的实验动物中心。实验动物中心为3层大楼，层高4.5 M，建筑面积2197M2。大楼总体分布：一层东侧为犬等动物实验区域；一层西侧为办公区及部分附属设施。二层西侧为教学、科研用兔实验室；二层东侧为动物实验室（“兔类实验动物技术服务基地”配套功能实验室）。三层西侧为屏障系统区，SPF级动物实验室；三层东侧

7、为动物实验室（“GLP中心”配套动物实验实验室）。,技术服务项目动物代养：实验动物的日常管理，提供实验动物饲料等服务。动物实验：动物药理学、毒理学药物有关动物实验。动物模型：如高血压动物模型、糖尿病动物模型建立与疾病治疗、异常毒性试验、热原试验等。技能操作：如给药，采血，注射等。人员培训工作自2009年09月旗山校区实验动物中心启用以来，已举办了18期动物实验岗前培训。为校内外教师和同学开展动物实验研究工作提供相应的技术服务。,图11 清洁级准备室,图12 清洁级走廊 图13 大鼠、小鼠饲养室,Case Western Reserve University,3选用解剖、生理特点符合实验目的要求

8、的实验动物催吐实验适宜选用猴、猫，不选用大小鼠。胆囊功能实验不选用大鼠。,因为大/小鼠无呕吐反应,因为大鼠无胆囊,发汗中药的研究不能选用小鼠。慢性支气管炎的实验不能选用大小鼠。,无汗腺,因为大/小鼠气管及支气管腺不发达,计划生育研究常选用小鼠和大鼠。因繁殖力强，性周期和妊娠期短，生长快。如常用小鼠做抗生育、抗着床、抗早孕、抗排卵等实验应用上的首选动物。心血管病研究猪(辛克莱小型猪/广西巴马小型猪/欧米尼猪)。猪冠状动脉，在解剖学、血液动力学上与人类相似。对高胆固醇食物的反应与人一样，很容易出现动脉粥样硬化的典型病灶。,实验外科学研究犬(比格犬/华北犬/西北犬/狼犬)。内脏与人相似，比例近似。临

9、床医生在研究新的手术或麻醉方法时往往选用犬来做动物实验，取得经验和技巧后用于临床。如心血管外科，脑外科，断肢再植，器官和组织移植等。行为学和精神病及神经生物学研究猕猴。制造和鉴定脊髓灰质炎疫苗猕猴是唯一的实验动物。,4选用不同种属品系实验动物某些特殊反应，使适合于不同研究目的的需要肿瘤研究常选用近交系小鼠，如AKR小鼠白血病发生率可达90；C3H小鼠乳腺癌发病率达97，而不选用C57BL等小鼠，因其乳腺癌发病率极低(5)。发热、解热和检查致热源实验适宜选用兔做实验，因属恒温动物，对致热物质反应敏感。,高血压病研究选用SHR大鼠，因自发性高血压，心血管疾病发病率高，对降压药物有反应。耳科学研究豚

10、鼠听神经对声波特别是7002000Hz的纯音最敏感，常用于听觉和内耳疾病的研究。免疫学研究豚鼠易引起变态反应，产生大量补体，是过敏性休克和变态反应研究的首选动物。,5实验动物种属、品系的选择如果实验结论只针对某一品系则使用一个品系。如果实验结论针对整个物种在内的一般性研究则使用多个不同来源的品种、品系。一般对多物种进行实验时，应先选小型动物，再推广到大型物种；要求只能建立在对多个物种进行实验的基础上，才能推广到人类，也称动物实验外推。常用顺序时小鼠、大鼠、兔、犬、猴。,6遵守动物实验的一般规则（1）年龄、体重应根据实验目的来选择适龄动物。一般实验均用成年动物进行；幼龄动物一般较成年动物敏感；老

11、年动物的代谢活动及各种机能低下，反应迟钝，除了作老年医学研究外，其它专业很少应用。同一实验所选动物年龄应一致，体重大致相近，一般不应相差10%。,（2）性别不同性别动物对同一实验处理（如药物、刺激等）的感受性常有差异，在实验研究中如无特殊要求，一般宜选用雌雄各半做实验。（3）生理状态与健康情况动物的不同生理状态如怀孕、授乳时对外界刺激的反应常有所改变，在一般研究中应从实验组中删除；必须选用健康动物进行实验。,（4）实验季节和昼夜过程不同季节和不同昼夜，动物机体反应性会有一定改变，在实验动物选择中也应予以注意。（5）实验的重复与肯定由于不同种动物有不同的功能和代谢特点，所以在肯定一个实验结果时，

12、往往采用两种以上动物进行比较观察，尤其将动物实验结果推断到人的实验时应该慎重。例如，所选的实验动物如一种为啮齿类动物，另一种应该为非啮齿类动物。常用的序列是小鼠、大鼠、狗或猴。,二、中医动物实验研究的注意点实验动物在中医实验的应用和发展中，建议注意以下几个方面。1中医动物实验研究应以中医理论为指导2中医动物实验研究应从中医临床出发3中医动物实验研究应突出中医治疗原则,一、证动物模型的开创和发展自本世纪60年代以来，在中医证的动物模型制作与研究方面做了大量的研究工作。迄今证的动物模型逾150多种。其中包括各种虚证（阴虚、阳虚、气虚、血虚、各脏腑虚）、血瘀证、肝郁证、寒证、热证、温病卫气营血诸证、

13、里实证等模型，等等。实验动物疾病模型应用于中医临床研究，为中医诊疗方法研究提供了大量的实验模型，为临床理论的深化与新理论的形成提供了便利。,中医动物实验研究的主要内容,动物模型复制方法,问题是，常用实验动物，大鼠、小鼠能不能实现四诊，能不能实现基于四诊的辨证，以及辨证论治？,小鼠辨证论治方法的由来和进展方肇勤 潘志强 陈晓 卢文丽 付晓伶李海燕 陈德溯 侯俐 廖明娟 汤伟昌管冬元 吴中华 许敏 阚卫兵 许家佗上海中医药大学,引 言 辨证论治是中医学的优势。在新形式下，如何深入揭示辨证论治的机制、提高辨证论治的疗效，是中医、中西医结合基础学科的重要研究方向。辨证论治的基础研究主要借助于小鼠等实验

14、动物。为了满足研究的需要，国内学术界业已发展出200余种证候的动物模型，集中在常见的气、血、阴、阳虚证和实热、血瘀等实证。在很大程度上弥补了辨证论治研究动物模型的欠缺，促进了辨证论治基础研究与发展。但是迄今为止，尚缺乏小鼠四诊和基于四诊的辨证论治方法和技术，这成为新时期中医药基础研究的瓶颈。,那么，为什么要实现基于四诊的小鼠辨证？这是因为一些学术问题已凸现出来：（1）证候是体内多系统、组织、细胞、分子等不同层次生物学变化外在的综合反映。由于缺少小鼠四诊方法，以往有关小鼠证候判断，主要依据实验室检测数据，或治疗反证，一直未能建立起证候与实验室指标一一对应的联系。而大量的研究表明，目前一些常用实验

15、室指标还不能代表证候。（2）实验室检测，大多要求损伤、处死动物，如此难以动态观察证候的自然演变和辨证论治疗效。,（3）实验室检测，大多成本高、检测周期长，不利于辨证论治基础研究和发展的高效、批量要求。（4）大量的证候动物模型、实验室检测和方证论治一再证明，实验用大鼠、小鼠是存在证候的。（5）我们长期的动物实验，一再观察到实验动物大鼠、小鼠存在体质差异，以及同病异证、异病同证的现象，不加辨证的单方治疗，疗效往往受到限制，甚至会产生副作用。,那么，如何实现小鼠的四诊呢？比如问诊如何问？中医四诊重视面色和舌诊，小鼠头面布满被毛，舌又不会配合地伸出来，如何望诊？小鼠如何把脉？一些学者还一直对中医四诊有

16、顾虑，不能量化，小鼠四诊能否量化？对此他们开展了长期的探索和研究，结果如下：,图1 正常与晚期荷瘤小鼠面容 图2 正常小鼠 图3 肿瘤压迫张口呼吸小鼠,一、疾病小鼠存在证侯及其演变,图4 早期荷瘤昆明种小鼠 图5 中期荷瘤气虚小鼠,图6 中晚期荷瘤气虚小鼠 图7 中晚期荷瘤阴虚小鼠 图8 晚期荷瘤阴阳两虚小鼠,以下为不同组别荷瘤小鼠爪：,图11 爪消瘦而略红 图12 爪淡掌略胖,图9 正常小鼠爪 图10 爪淡伸展无力,以下为编号为H9荷瘤小鼠不同日期拍摄的爪：,图15 肿瘤接种第2周 图16 肿瘤接种第2.5周,图13 肿瘤接种第1周 图14 肿瘤接种第1.5周,二、正常小鼠存在体质差异/证候

17、差异,图17 正常昆明种小鼠后爪 图18 偏虚证的正常昆明种小鼠后爪,三、小鼠如何问诊 人、鼠对话是困难的，但是问诊所期望采集的信息却大多是可以获得的，而且部分信息的完整性、可靠性还优于普通临床上的问诊。为什么呢？众所周知，问诊归纳起来是十问：一问寒热二问汗，三问头身四问便，五问饮食六胸腹，七聋八渴俱当辨，九问旧病十问因，还要参考服药。临床上，患者的一般情况也是问诊的重要内容。小鼠通过何途径实现？,1.问寒热。小鼠畏寒，往往表现为扎堆，饲养中可以观察到；畏寒的另一特点是畏寒的局部体表温度下降，通过体表红外成像数码拍摄和图像处理，可以精确定量；而体内和体表温度的改变，可以分别通过肛温、腋温、尾温

18、、爪温检测获得。因此，以上检测可以很好地达到问寒热的主要目的，而且部分实现了量化。2.问汗。有报道尝试通过特殊染色技术，检测爪面出汗点和数量多寡；有的实验观察了皮毛潮湿的程度，部分弥补了问汗的困难。,3.问头身。头身的感受可以综合两个方面的信息获得：1）造模方法，如果这些方法在临床上可能造成头身证候的，比如头颅手术、高血压、感冒等，可以参考；2）小鼠旷场自主探究和活动、抖拢检测，如果头身痛楚，则小鼠活动和探究频率和幅度会减少。4.问便。饲养可以直接观察大便的数量和质量，小便可以通过代谢笼完整回收，观测其数量和性状。,5.问饮食。摄食量和饮水量可以精确测量，啮齿频率（通过声音采集与分析）可以部分

19、反映其脾胃健康与否。6.胸腹。方法类似于问头身。7.聋。生理学有听觉反应检测，可以采用；小鼠旷场、抖拢检测可以观察小鼠反应的灵敏与迟钝，间接反映其听觉。,8.渴。饮水量的精确测量，以及结合代谢笼尿液收集数量、颜色，判断其可能水分通过呼吸、汗液、尿液代谢的途径：阳热盛往往表现为饮多而尿少且赤；下消则饮一溲一，等等。9.问旧病。实验动物的疾病遗传，以及疾病或证候造模方法是明确的，而临床却往往做不到。,10.问病因。同上，而且造模药物干预过程也是明确的。11.参服药。治疗干预记录是十分明确的。12.一般情况。包括动物购入和实验日期、品系、月龄、性别，饲养、繁殖背景等均是明确的。,因此，小鼠虽然难以实

20、现传统意义上的问诊，比如疼痛的性质或持续时间，但问诊许多重要内容，却是可以详细、准确获得的。而且，大多可以精确地定量，因而其可靠性、准确性往往还要优于通常意义上的临床问诊。,四、小鼠如何望诊 1.望面色 以下图右是正常小鼠，肿瘤虚证小鼠在左侧。从图中可以看到，正常小鼠头部上抬，直视相机镜头，很关注；眼裂宽，眼色红润、有神；吻部饱满、红润；肿瘤虚证小鼠则相反，头低垂、目光呆滞，失去了好奇；双目色暗；吻部瘦削、色暗滞。,图21 正常与肿瘤小鼠面容与体态,2.望舌 清醒状态下，小鼠舌不易自主伸出，如果强迫其伸出，必然严重干扰气血运行，不符合中医四诊原则。当小鼠麻醉后，可以方便地轻轻撑开小鼠嘴，使其舌

21、自然伸出口腔之外，采用显微放大（8-15），是可以清晰观察到的。其表现与人类舌象十分相似。血虚舌淡，阴虚阳盛舌偏红。但是，麻醉会干扰小鼠气血运行；不同模型小鼠对麻醉的耐受度还不同，甚至难以接受；麻醉过深会导致小鼠死亡，过浅则小鼠会出现挣扎、不配合等等。因此，常规地开展舌诊，有一定的限制。有没有部分可以替代的方法？,图22正常小鼠舌 图23环磷酰胺模型 图24乙酰苯肼模型 图25甲状腺素模型 图26丙基硫氧嘧啶模型,图27正常小鼠爪 图28环磷酰胺模型 图29乙酰苯肼模型 图30甲状腺素模型 图31丙基硫氧嘧啶模型,图32正常小鼠尾 图33环磷酰胺模型 图34乙酰苯肼模型 图35甲状腺素模型 图

22、36丙基硫氧嘧啶模型,小鼠舌象与爪尾的比较,3.望爪和尾 与人类不同，小鼠爪、尾的角化质比较薄，可以较好地反映气血充盈和阴阳盛衰的表现。以上不同模型小鼠爪、尾（8）各取自以上舌象的同一小鼠。就红色的程度而言，各模型舌、爪、尾是一致的，爪、尾色可以部分替代舌色和面色。,以上结果说明：（1）舌、爪、尾颜色的变化趋势是一致的，r值的变化趋势也一致。（2）反映红色的程度，舌优于爪、爪优于尾。因此，要观察气血寒热，优先观察舌、其次是爪。,4.望诊其他采集内容 包括：称重、望形体虚实、望形体神、望形体寒热、望运动步态、望精力、望毛色虚实、望呼吸状况、望眼神、望耳、望鼻、望唇、望腹、望二阴、望大便、望小便、

23、望爪、望尾、望睡眠、爪和尾显微拍照（颜色、胖瘦、光泽、爪舒展、爪伸展、爪老嫩、爪洁净、爪溃烂）。,5.不同品系小鼠爪等的证候表现非常一致 以上望诊方法，是否适用于常见不同品系小鼠？黑色与白色小鼠是否一致？,他们比较了常用不同品系小鼠C57小鼠（黑色）、BALBc、ICR、昆明小鼠（均为白色）的四诊表现，发现具有很高的一致性。这一结果提示，他们所建立的望诊方法是适用于常用不同品系小鼠的。,以下是不同品系小鼠的爪：,图38 C57小鼠爪 图39 BALBc小鼠爪 图40 ICR小鼠爪 图41 昆明小鼠爪,五、小鼠如何切诊 1.小鼠如何把脉 他们没有开展小鼠把脉的研究，主要是担心会干扰其气血运行。然

24、而，他们建立了小鼠自然状态下心电的快速采集。该设计思路和采集装置已经获得中华人民共和国专利，专利号为：ZL03116816.7。可以类似于检测脉的至数与节律，如促、结、代、数、疾、缓、迟等脉象。,2.切诊的其他项目与内容 包括体温和肤之温凉、肿块的大小与质地、肌力的强弱等，不同疾病和证候动物还会有一些特殊的检测内容。,六、小鼠如何闻诊 小鼠闻诊内容目前主要为嗅气味，声音的标准采集和分析将有助于判断小鼠的虚实。七、小鼠四诊的标准化、客观化、计量化采集与分析 为实现小鼠非创伤性的标准化、客观化、计量化四诊检测，他们提出并初步建立了小鼠四诊工作站。,1.思路和原则 继承中医四诊和辨证论治的理论与方法

25、，模拟中医临床四诊信息的采集方式，实现小鼠的非创伤性四诊检测，同时部分实现四诊检测的标准化、量化，提高四诊检测速度，以适应大样本的检测之需。即：（1）非创伤性检测；（2）标准化、客观化、计量化；（3）可操作原则，即操作容易和方便，便于掌握和普及；（4）低成本原则，利于普及；（5）流水作业原则，以提高检测速率。,2.小鼠四诊工作站内容（1）小鼠行为学旷场实验检测单元（2）小鼠爪、尾显微放大拍摄单元（3）小鼠舌显微放大拍摄单元,图42 小鼠旷场检测 图42-1 小鼠爪尾显微放大拍摄单元,（4）小鼠自然状态下心电快速采集单元,图43 小鼠清醒状态下前后肢引导出的心电,图423 小鼠爪持法 图423

26、小鼠尾持法,（5）小鼠腋温采集单元（6）小鼠体重采集单元（7）小鼠整体外观摄影单元（8）小鼠抖拢自主活动状况采集单元（9）小鼠摄食量称量单元（10）小鼠饮水量测量单元（11）荷瘤小鼠瘤径的测量（12）信息综合处理单元,八、小鼠常见证候辨证标准1四诊信息的标准采集2建立各四诊信息的正常参考值（1）建立实验前各四诊信息的正常参考值（2）建立正常对照组动态的正常参考值（3）部分检测数据基数校正3症状归类预处理,表1 形质、迟动、淡、红、青紫、瘀、寒热症状类,表2 虚实、湿、毒、病因病邪、病态症状归类,表3 五脏定位症状归类,4常见的寒热、虚实、气血、阴阳、病邪、五脏证候辨证标准（1）寒、热、虚、实等

27、的辨证标准,表4 寒、热、虚、实等的辨证标准,（2）阴虚证、阴虚火旺、阳虚证、阴阳两虚、气虚证、血虚证等的辨证标准,表5阴虚证、阴虚火旺、阳虚证、阴阳两虚、气虚证、血虚证等的辨证标准,（3）部分病邪的辨证标准（4）五脏证候的辨证标准,表6 部分病邪的辨证标准,表7 五脏证候的辨证标准,四、展望 通过几十年的探索，中医的实验动物，尤其是证动物模型研究取得了空前的成就，同时，也暴露出了一些问题，主要表现在：1动物模型很难用四诊方法加以判别。2造模因素选择缺少标准。3有的造模设计，忽视临床实际，刻意去追求证，脱离病去制造证，而不是在病，尤其是常见病的模型上去区分证。4关于方药的反证问题。,二、以动物

28、实验验证临床治疗方法，探求其作用机理临床治疗方法的动物实验研究主要包括以下几方面：1研究经方的作用机理（如独活寄生汤的研究）2研究名老中医经验疗法的作用机理（如二仙汤的研究）3应用于新药开发（如透骨消痛胶囊的研制）,三、中医基础理论的研究及其在教学上的应用四、其它研究与应用动物实验在中医研究中已渗入到各个领域。除以上所介绍的外，较多的应用领域有中药药理（包括性味归经）的实验研究、中草药毒理的动物实验、各类常用中草药有效成份的药理、毒理和代谢，中草药原料开发、保健品和化妆品等开发，以及对其安全性评价等等。,本痿标痹,骨性关节炎,肝肾亏虚：补肾壮筋汤风寒湿阻：独活寄生汤阳虚寒凝：阳和汤瘀血阻滞：身痛逐瘀汤,横断面辨证,病证结合,辨病,主方辨证,透骨消痛胶囊,肝肾亏虚：命门风寒湿阻：三里阳虚寒凝：血海瘀血阻滞：血海,巴戟天白芍川芎肿节风单味药研究川芎白芍药对研究计算机药理学研究组织形态学研究细胞分子生物学研究,梅花入骨丹、青风藤、苦杏仁单体研究海桐皮汤外用研究敷贴疗法研究揉膝推髌点穴手法研究治疗型关节炎护膝研究毫米波干预关节软骨研究,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,谢 谢！,