4细胞基本培养技术PPT文档.ppt
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1、,内 容第一节 玻璃器皿及塑料制品的清洗与消毒第二节 培养操作的基本要领和要求第三节 细胞培养的基本技术,第一节细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒,一、清洗,目的:在组织细胞培养中,体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长有害物质包括:微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿、胶塞、塑料制品,1、玻璃器皿的清洗,包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤清洗后的玻璃器皿要求:干净透明无油迹不能残留任何物质,清洗:自来水洗,烘干 泡酸 自来水洗 去离子水洗 三蒸水洗 烘干 新瓶子均按该程序清洗,培养材料染菌的瓶子经高压灭菌后也按该程序清洗。酸
2、液(洗液):浓硫酸+重铬酸钾,浸泡:初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡,以使附着物软化或被溶掉。,新的初次使用的玻璃器皿先用自来水简单刷洗,然后用5稀盐酸液浸泡过夜,以中和其中的碱性物质,培养瓶浸泡后还需要装满蒸馏水后上高压!,再次使用的玻璃器皿:用后立即浸入水中,要求完全浸入,不能留有气泡或浮在液面上。原因:常附有大量刚使用过的蛋白质,干固后不易洗掉。,刷洗:用毛刷沾洗涤剂刷洗,以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度,过度会损害器皿表面光泽度,浸酸:玻璃器皿浸泡到清洁液中的过程注意:浸泡时器皿要充满清洁液,勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间:一般为过夜,不应少于6 小时配制、
3、浸泡时应注意安全,须穿戴耐酸手套和围裙,并要保护好面部及身体裸露部分。,冲洗在使用后,刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹。浸泡后的冲洗过程:,需流水冲洗十次以上,每次水须灌满及倒干净,蒸馏水浸泡过夜,自来水冲洗5遍,一蒸水5遍,二蒸水3遍,培养瓶要求二蒸水也用流水,烤干备用。,2、胶塞的清洗,新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质,应先用自来水冲洗,再做常规处理.,常规清洗方法每次用后立即置入水中浸泡,用2%NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟(以除掉培养中的蛋白质),自来水冲洗,蒸馏水冲洗2-3次,晾干备用。,3、塑料制品的清洗,塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的
4、包装,打开包装即可用,多为一次性物品。必要时用2%NaOH 浸泡过夜,用自来水充分冲洗,再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟,最后用自来水和蒸馏水冲洗干净,晾干备用。,培养板、塑料离心管的清洗同玻璃器皿。但不能放在烤箱中干燥!,二、包装:目的:以便消毒及储存,防止落人灰尘及消毒后再次被污染。包装纸(盒)表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等!,各种用品的包装,器皿的包装分为半包装和全包装培养瓶 两个一组全包,包装前盖上螺旋盖子。吸管 在与胶头相接端塞上棉花装入吸管筒。青霉素小瓶 倒扣在饭盒中,全包。滤器 上下口半包装再用报纸包,最后用布包好。大的容器 如锥形瓶,加上棉塞后半包装。枪头、EP管 装在
5、相应的盒子中,全包。手术器械 放在饭盒中,全包。离心管 加盖子后全包,三、消毒、灭菌 防止培养物污染可通过消毒灭菌(将已存在的微生物去除)灭菌sterilization:应用理化方法杀死所有病原微生物、非病原微生物和芽胞。消毒disinfection:应用理化方法杀死微生物,只要求达到无传染性的目的,不要求全部杀死。,无菌germ free:没有活菌。防腐antisepsis:应用理化方法防止和抑制微生物生长繁殖。抑菌(bacteriostasis):抑制体内或体外细菌生长繁殖。常用的抑菌剂为抗生素,1、消毒灭菌的方法,物理方法:湿热(高压蒸汽)、干热、紫外线。射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或
6、去除微生物。化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。,2、消毒灭菌的注意事项,干热消毒:一般在烤箱中进行,需加温到 160,保持90120 min方能杀死芽孢。注意!消毒完毕后不可马上将烤箱门打开,以免冷空气突然进人,影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。,湿热消毒:一般使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。注意:1、不能装太满,保持消毒器内气体流通。2、在加热升压之前,打开排气阀门,使加热后消毒器内的残留冷空气排出!关闭排气阀门,开始升压,待达到所需要的压力时,开始记录时间,并控制压力恒定。,3、一般物品:布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅 20 min;常规使用液体:消毒 15
7、磅 15 min。4、橡胶和塑料用品:如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。,紫外线消毒:主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。时间为30分钟2小时左右。过滤除菌消毒:适用于组织细胞培养使用的液体如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。,3、常用设施的消毒及灭菌,培养室:紫外线照射、乳酸熏蒸台面:紫外线照射、70%乙醇擦拭培养箱:新洁尔灭擦拭培养瓶、培养皿等:用报纸包好高压蒸汽灭菌滴管、枪头等:装载相应的容器中用报纸包好高 压蒸汽灭菌培养板:紫外线照射12小时以上。培养基:过滤除菌,、,第二节 培养操作基本要领和要求,防止污染是决定培养成功或失败的首要条
8、件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力,故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。一、培养前准备1、制定出分门别类的操作卡片。如“分装血清”、“组织块贴壁初代培养”、“传代培养”、等等。各卡片上记有需用器材和物品名称、要求及数量等,好处是实验者可按卡片收集所用物品,清点无误后,把用品放置于操作场地,然后进行消毒。,2、操作野消毒:现多用紫外线灯灭菌,效果很好。用30 瓦紫外线管灯,操作箱消毒20 一30 分钟即可;操作室空间大,需消毒3050 分钟。在用紫外线灯照射期间,在操作台面上勿置培养细胞和培养用液等物,以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。紫外线只有直接杀菌作用,工作野用品过多或重叠放置,物
9、品相互遮挡射线,会降低消毒效果,3、洗手和着装:原则上和外科手术相同。在利用无菌箱工作时,因整个前臂要伸入箱内,洗刷时一定要清洗到肘部。75酒精,进行擦洗消毒;必要时亦可用0.2的新洁尔灭洗涤消毒。进行培养工作时,如利用净化台,仅戴口罩和工作帽,着一般工作服即可。在无菌室内工作需着消毒衣帽。,二、火焰消毒:在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时,首先要点燃酒精灯或煤气灯。以后操作,如安装吸管帽、启开或封闭瓶口等,都需经过火焰烧灼进行。已吸取过营养液的吸管不能再用火焰烧灼!因吸管头中残留营养液能烧焦形成炭膜,再用时会把有害物带入培养液中。消毒火焰要求无色或微蓝色,而红黄色或发黑的火苗,表示燃烧不完
10、全或含有杂质,有害物能混入培养液内。因此酒精灯需用96的不含杂质的酒精,绝不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。,三、培养操作注意事项1、进行培养操作时,动作要准确敏捷,但又不必太快,以防空气流动,增加污染机会。2、不能用手触及已消毒器皿,如已接触,要用火焰烧灼消毒触及部,如不便消毒时,应取备品更换。3、布局:原则上应是右手使用的东西放置在右侧,左手用品在左侧,酒精灯置于中央(图4-1)。工作由始至终要保持一定顺序性。,4、组织或细胞在末做处理之前,勿过早暴露在空气中。同样,培养液在使用前,不要过早开瓶;用过之后如不再重复使用,应立即封闭瓶口。5、培养用瓶开瓶以后,皆应保持45 度斜位或平放,吸取营
11、养液BSS、细胞悬液及其它各种用液时,均应分别使用吸管,不能混用,以防扩大污染或导致细胞交叉污染。6、工作中不能面向操作野讲话或咳嗽,以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。,第三节 基本培养操作技术,一、传代培养法,当初代培养成功,细胞生长增殖形成单层细胞后,进而扩展汇合,占满一切空间,此时需要进行分离培养。这一操作称传代或再培养。80%汇合或刚汇合细胞是理想传代阶段。为什么要进行传代?,1、贴壁细胞传代,贴壁细胞,贴附生长型细胞,细胞培养常用的培养瓶、培养皿、6孔板、96孔板,+,+,细胞的贴附过程,贴附物质带正电荷,细胞带负电荷,成纤维细胞:梭形、三角形、2-3个突起,上皮细胞:扁平
12、、多角形、园核,可连成单层,材料和试剂 Hela细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 EDTA消化液(0.02%)培养瓶、无菌吸液管(5ml、1ml)、弯头毛细滴管、废液缸,图5-6 消化法传代培养步骤,【程序】(1)吸除培养瓶内旧培养液;(2)向瓶内加入EDTA 混合液少许,以能覆满瓶底为限;(3)置温箱中25 分钟(或在室温中,把培养瓶放在倒立显微镜台上镜下观察),当发现细胞胞质回缩,细胞间隙增大后,立即终止消化;(4)吸除消化液,(5)用吸管吸取营养液(已经加入双抗并调好pH值)加入培养瓶,轻轻反复吹打瓶壁细胞,使之从瓶壁脱离形成细胞悬液;吹打勿用力过猛,以免伤害细胞;(6)计数
13、板计数后(如非实验用,不计数亦可),把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中,置温箱中培养。,2、悬浮细胞的传代培养,悬浮生长型细胞,材料和试剂 HL-60细胞 RPMI1640生长液、碳酸氢钠、双抗 培养瓶、无菌吸液管(5ml、1ml)、弯头毛细滴管、废液缸,二、操作步骤l、选生长良好的HL-60细胞一瓶 轻轻加入等量的生长液。2、用无菌吸液管轻轻吹打,使HL-60细胞均匀悬浮 然后吸出一半的细胞悬液加人另一个培养瓶中。3、如果细胞比较浓,可按1:3分配传代培养。,二、初代培养法,意义:初代培养或原代培养,是从供体获取组织后的首次培养。其最大优点是:组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大的变化
14、,具有二倍体遗传性状,在供体来源充分、生物条件稳定的情况下(年龄、性别),在一定程度上能反映体内状态。初代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用初代培养细胞做实验,如药物测试等效果也很好;初代培养也是建立各种细胞系(株)必须经过的阶段。,1、原则:幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养;分化程度低的组织比分化程度高的容易生长;肿瘤组织比正常组织容易培养。一般在无特定要求时,取易培养的组织进行培养,成功率高。,(一)取材,注意事项:取材之后,最好立即培养,如因故不能培养时,应把组织切成1 立方厘米左右的小块,置于培养液中,4贮存;存放时间不宜超过24 小时。从体内取材时,应严格保持无菌,
15、取肿瘤和其它病理组织时容易带菌,为减少污染,可用含500 1000 单位毫升的青、链霉素BSS 液,漂洗5 10 分钟后再做培养处理。,1、鼠组织取材,各种组织取材,2取皮肤:人皮肤是常用的培养材料,对供体无特定要求时,可利用手术时取材:请术者手术时切取l 2cm2 皮肤,即满足培养要求。取皮肤时可在上臂和大腿内侧等处,先用肥皂洗净取材部位皮肤,用75酒精擦拭消毒2 3 次(勿用碘酒)。取材方法可按如下两种方法:一是用注射器针尖轻轻斜刺入表皮内2 毫米左右,向上挑起一个小的皮丘,然后用手术刀紧贴针尖下方,切下直径2 3 毫米小片,深度以创面微见血迹为度;二是用拇指和食指把取皮部皮肤紧捏起,在绷
16、起的皮肤表面,用手术刀轻轻片取一小片表皮,大小和深度同前。,3取体液:血液白细胞是常用的培养材料,一般多用静脉取血法。亦可从耳垂或指尖取血。从无名指肚取血很好,血多,消毒和取血都方便,刺口恢复很快不易感染。从手指取2 3 滴血即够一次培养,血用量多时需从静脉采取。为防止凝血,常用肝素等抗凝剂;吸出血后拔掉针,立即把血注入无菌容器中备用。取骨髓组织、羊水、胸水和腹水可委托临床有关科室,按不同手术规程取材。,(二)组织的分离,目的:为获取多量生长良好的细胞,必须把组织细胞分散开,使细胞解离出来;能达到单细胞水平更好,同时并不使细胞受伤害,细胞能很好生长。分散组织的方法有离心法、机械法和化学法三种;
17、,1离心分离法,培养物为血液、羊水、腹水和胸水等细胞悬液时,可采用离心法分离。一般用低速500 1000 转分速度,离心5 10 分钟即可。如悬液量大,离心时间可适当延长,但如离心速度过大和时间太长,易压挤细胞使之受损或死亡。,淋巴细胞分离法,原理:淋巴细胞分层液(Lyphocyte Separation Medium)效果很好。分层液是根据细胞比重不同,使各类细胞相互分开的。红细胞比重1.092,淋巴细胞和大单核等白细胞比重为1.070;分层液适用于分离血中淋巴细胞。(1)取抗凝血若干毫升;(2)按1:1 加入无菌分层液(滤过除菌)后,800 1000 转离心;(3)无菌分离出白细胞(白细胞
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