高中生物选修三基因工程的基本操作程序文档资料.ppt

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1、,补充：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片段，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.(以模板转录然后脱落),不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列，在该序列中

2、，最重要的是位于编码区上 游的RNA聚合酶结合位点。,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区,与RNA聚合酶结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,2.真核细胞的基因结构,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点等。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细

3、胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,1、从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,（1）.基因文库,某生物体内全部DNA,许多DNA片段

4、,受体菌群体,1、从基因文库中获取目的基因,基因组文库,某种生物某个时期的mRNA,cDNA,受体菌群体,部分基因文库（cDNA文库）,基因组文库的构建,（2）.基因文库的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因,cDNA文库的构建-反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,（3）构建基因文库的目的,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?,便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得

5、所需的目的基因。,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法),概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2、利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）

6、：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加_倍,一,过程：,PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,碱基互补配对原则,四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP,四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化解旋,半保留复制、边解旋变复制,半保留复制、全解旋再复制,体外复制,主要在细胞核内,大量的DN

7、A片段,形成整个DNA分子,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的核苷酸序列,目的基因,化学合成,推测,推测,3、人工合成法：,在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成,化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？,1.作用：,二.基因表达载体的构建-核心,IMN,2.组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3)终止子：是使转录在需要的地方停止,(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来,(2)启动子：

8、是RNA聚合酶识别和结合部位,(1)目的基因,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,（5）复制原点：是转录和复制的起点。,二、基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,限制酶处理,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,一个切口两个黏性末端,复制原点+启动子+目的基因+终止子+标记基因,寻根问底：,将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。,这种方法针对性差，完全靠

9、运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。,资 料:,科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资料证明：表达载体构建组成要完整,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构用到的工具酶：既用到限制

10、酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键启动子、终止子对于目的基因表达必不可少目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,2.下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成 从基因组文库中提取从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成A.B.C.D.,1在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法 B、基因组文库法 C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应,3.在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4

11、次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个,A.540 B.8100 C.17280 D.7560,4.目的基因与运载体结合所需的条件有 同一种限制酶 具有抗性基因的质粒 RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A BC D,5.（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,D,常用的受体细胞：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三.目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,特点

12、:,农杆菌转化法：,（1）将目的基因导入植物细胞,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,过程：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物、祼子植物。,Hin d限制性酶,目的DNA,Ti质粒,苏云金杆菌,构建表达载体,Bt毒素蛋白基因,DNA连接酶,T-DNA(可转移-DNA),知识拓展,农杆菌转化法的过程：,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单

13、子叶植物,适用于单子叶植物,基因枪法,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,胚珠,花药,花丝,柱头,花柱,子房壁,子房,雄蕊,雌蕊,花粉管通道法,适用于被子植物,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵（体内或体外 受精）,提纯含目的基因表达载体,受精卵,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、

14、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感 受 态 细 胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞 吸收DNA,_感受态细胞法,（3）将目的基因导入微生物细胞,（3）.将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就

15、能获得大量的目的基因。,四 目的基因的检测与鉴定,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组 DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1.检测方法：,分子杂交技术：,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,1.检测,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,

16、方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物的DNA杂交时，如果出现杂交带（用特殊的显影装置可以看见），则说明目的基因已插入受体细胞的染色体DNA中。,基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的一条链发生碱基互补配对。,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。,变性,方法：,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,如果显示出杂交

17、带，就表明待测样品目的基因已经转录。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法：抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.鉴定个体生物学水平的鉴定,（1）多细胞个体,抗虫、抗病接种实验，活性比较实验,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（2）单细胞生物,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、Ca2+处理法,DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术,分子检测外的个体水平鉴定,