放线菌素D诱导细胞凋亡形态学文档资料.ppt

《放线菌素D诱导细胞凋亡形态学文档资料.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《放线菌素D诱导细胞凋亡形态学文档资料.ppt（40页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、【实验原理】细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。细胞死亡有两种形式：一种是坏死性死亡（necrosis），是由于细胞外部理化因素的侵袭而造成的细胞崩溃裂解；另外一种是凋亡（apoptosis），是细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是由基因决定的自动结束生命的主动过程，由于受到严格的遗传机制决定的程序性调控，所以也被称为细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD）。,生物学意义：,细胞凋亡对于多细

2、胞生物个体的胚胎发育、维持器官组织细胞数目相对平衡、自我平衡的保护以及抵御外界因素的干扰都起着非常关键的作用：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。,诱导细胞发生凋亡的外在因子包括物理性因子（如紫外线、射线等）和化学性因子（如超氧自由基、羟自由基、视黄酸、环己亚胺、放线菌素D等）。,细胞凋亡过程不同于坏死性死亡，凋亡过程中染色质断裂，细胞核碎裂成为核碎片，细胞质浓缩，细胞体积减小，细胞膜内折，整个细胞通过起泡和发芽的方式形成一些大小不等的凋亡小体（apoptotic bodies），并逐渐被细胞周围的吞噬细胞所吞噬，细胞的内容物没有泄漏，不会引

3、起周围组织的炎症反应。,凋亡细胞的核DNA的断裂发生在核小体之间，因此产生的断裂DNA在电泳时会呈现180200bp整数倍大小的阶梯状条带（ladders），这是识别凋亡细胞的可靠生化特征。,Hochest33258荧光染料能够和DNA特异结合，对正常细胞、凋亡细胞均能染色，受到紫外光激发可发出绿色荧光。但由于凋亡细胞的染色质凝缩和凋亡小体的形成，因此呈致密浓染，而正常细胞则发出均匀荧光，由此可以将凋亡细胞和正常细胞区分开来。,诱导细胞凋亡步骤,1、向处于对数增长期细胞加入放线菌素D（1g/ml），细胞37培养箱中培养12小时；2、将培养瓶中的培养基和悬浮细胞收集到离心管中，2000rpm离心

4、8-10分钟去上清收集细胞；用胰酶消化培养瓶中的贴壁细胞，再合并到离心管中，再离心收集细胞。3、加入2ml PBS悬浮细胞，离心去上清；再加入0.1ml固定液悬浮和固定细胞10分钟。4、取2滴细胞于洁净的盖玻片上，自然干燥；5、置盖玻片于平皿内，滴加Hochest33258染液，室温下避光染色2030分钟后，蒸馏水洗涤3次，自然干燥。6、在载玻片上滴一滴封片液，将盖玻片有细胞的一面封盖在液滴上，不要产生气泡，用滤纸吸去多余的封片液。7、在荧光显微镜下进行观察。（染色时看上次结果）,【观察与结果】,Hela细胞经过放线菌素D诱导后，可产生不同程度的细胞凋亡。在荧光显微镜下，被Hochest332

5、58染色的正常细胞呈现均匀的蓝色，而凋亡细胞表现为团状分布的致密浓染颗粒，二者区别明显。,显示,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker（自赵允、翟中和）,DNA鉴定（不作）,长成致密单层细胞诱导后收集细胞,用PBS 洗3 次。加入细胞裂解液37 温育过夜,离心收集上清,苯酚、氯仿抽提,在上清液中加入2倍体积乙醇在-20 静置过夜,离心,DNA 沉淀用TE 溶解，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。,细胞凋亡(Apoptosis),细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡的形态学

6、和生物化学特征细胞凋亡的分子调控机理,一、细胞凋亡的概念及其生物学意义,概念：细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的 过程，所以也常常被称为细胞编程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡细胞将被吞噬细胞吞噬。生物学意义：细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非 常关键的作用：蝌蚪尾的消失，骨髓和肠的细胞凋亡，脊椎动物的神经系统的发育，发育过程中手和足的成形过程。,二、细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡与坏死(necrosis)细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的生化特征诱导细胞凋亡的因子细胞凋亡的检测,细胞

7、凋亡与坏死(necrosis),二者的主要区别是，细胞凋亡过程中，细胞质膜反折，包裹断裂的染色质片段或细胞器，然后逐渐分离，形成众多的凋亡小体（apoptotic bodies），凋亡小体则为邻近的细胞所吞噬。整个过程中，细胞质膜的整合性保持良好，死亡细胞的内容物不会逸散到胞外环境中去，因而不引发炎症反应。相反，在细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏，细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应,细胞凋亡的形态学特征,凋亡的起始：细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合

8、；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成：核染色质断裂为大小不等的片段，与某 些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体 凋亡小体逐渐为邻近的细胞吞噬并消化,细胞凋亡的生化特征,细胞凋亡的主要特征是形成大小为 180200bp特征性的DNA ladders 凋亡细胞组织转谷氨酰胺酶tTG（tissue Transglutaminase）积累并达 到较高水平,诱导细胞凋亡的因子,物理性因子，包括射线（紫外线，射线等），较温和的温度刺激（如热激，冷激）等化学及生物因子：包括活性氧基团和分子，DNA 和蛋白质

9、合成的抑制剂，激素，细胞生长因子，肿 瘤坏死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗体等,细胞凋亡的检测,形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带TUNEL测定法，即DNA断裂的原位末端标记法彗星电泳法（comet assay）流式细胞分析 根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA 产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细 胞，同时又能观察细胞的周期状态。,三、细胞凋亡的分子调控机理,线虫(C.elegans)凋亡研究发现ced3,ced4基因促进 细胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制 细胞凋亡。Ced3哺乳类同源

10、物是ICE(Interleukin-1-converting enzyme)，即Caspase1Caspase家族与凋亡Bcl-2家族、线粒体与细胞凋亡细胞凋亡的分子机理,Caspase家族与凋亡,Caspase家族Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即CaspaseCaspase活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,Caspase活化,Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点裂解活化或自

11、身活化,胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径,凋亡信号通路 当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptor protein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNA Ladder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。,Bcl-2家族、线粒体

12、与细胞凋亡,Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3Bcl-2、线粒体与细胞凋亡哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC,Bcl-2、线粒体与细胞凋亡,当Caspase8活化后，它一方面作用于Procaspase3，另 一方面使Bid裂解成2个片段，其中含BH3结构域的C-端 片段被运送到线粒体，与Bcl-2/Bax的BH3结构域形成 复合物，导致细胞色素C释放。CytC与胞质中Ced4同源 物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子apoptosis protease activating factor)结合并活化Apaf-1，活化的Apaf-1再活 化Procaspase9，最后引起细胞凋亡,a 正常T细胞杂交瘤细胞 b 凋亡细胞(扫描电镜)c 凋亡细胞(透射电镜),caspase 超家族成员及其相应底物,BCL-2家族成员,坏死细胞,凋亡细胞,细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1细胞色素c诱导0 h2细胞色素c诱导1 h3细胞色素c诱导2 h4细胞色素c诱导3 h5细胞色素c诱导4 h6阴性对照7Marker（自赵允、翟中和）,